1.本发明涉及一种融合卷曲螺旋结构域的蔗糖异构酶活性包涵体，属于生物工程领域。
背景技术：2.异麦芽酮糖(α-d-吡喃葡萄糖基-1,6-果糖，isomaltulose)是蔗糖的同分异构体，天然存在于蜂蜜、甘蔗汁中，甜度约为蔗糖的50％。目前，异麦芽酮糖主要在食品工业中作为蔗糖的替代品用于保健品、糖尿病人食品和运动饮料的生产中。此外，异麦芽酮糖还在化工领域中被用作生产一些表面活性剂和高分子聚合物的原材料，因此是一种具有较好发展前景的功能糖。目前工业上主要利用蔗糖异构酶(sucrose isomerase，si)催化蔗糖转化成异麦芽酮糖，相比利用化学法合成具有较大的优势，如反应条件温和、制备过程绿色环保、反应专一性较高等。由于异麦芽酮糖的应用愈加广泛，越发受到消费者的欢迎，导致异麦芽酮糖的市场需求量逐年增长，但其生产主要由国外公司垄断，市场售价每吨约为1.5万元，因此提高蔗糖异构酶的利用率从而降低异麦芽酮糖的生产成本越发受到重视。
3.已发现多种产蔗糖异构酶的细菌，包括大黄欧文菌(erwinia rhapontici)、沙雷式杆菌(serratia plymuthica)、多源发散菌(pantoea dispersa)和克雷伯式杆菌(klebsiella sp.)等。然而，野生菌普遍产酶水平较低，难以达到工业化生产的要求，如erwinia rhapontici nx-5的发酵酶活为1.3u/ml，klebsiella sp.lx3的发酵酶活为15.12u/ml。因此，目前研究人员主要通过异源表达手段制备重组蔗糖异构酶并将其固载于水不溶性载体上制备成固定化酶以提高利用率。如利用ε-多聚-l-赖氨酸修饰的介孔tio2和ε-多聚-l-赖氨酸和明胶制备的海绵对蔗糖异构酶进行固定化，分别具有93.3％和84.5％的酶活力回收率；利用壳聚糖-戊二醛交联法、海藻酸钠-羧甲基纤维素钠混合包埋法以及交联酶聚集体法对蔗糖异构酶进行固定化，分别实现了70.3％、32.5％、30.9％的酶活力回收率。综上所述，通过传统的吸附法、结合法、交联法和包埋法虽然成功将蔗糖异构酶制备成固定化酶，但需要首先利用色谱技术对纯酶进行分离纯化，进一步利用水不溶性载体与纯酶进行固载反应，这一过程中的分离纯化、制备载体和固定化反应相关化学试剂均增加了固定化酶的生产成本，不利于固定化蔗糖异构酶的大规模生产和应用。近年研究发现，利用特定标签序列与酶蛋白融合表达，能够诱导其在细胞内形成具有催化活性的包涵体(catalytically-active inclusion bodies，catibs，下文简称活性包涵体)，其表达量大、易分离纯化、尤其是表达和固定化过程同步进行，无需额外的载体材料和固载反应，是一种新型自固定化酶，不仅在理论上改变了过去“包涵体是完全无活性的蛋白聚集体”的观点，而且作为一种新型酶异源表达和固定化方法，具有较好的工业应用潜力。
技术实现要素：4.为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种融合卷曲螺旋结构域的蔗糖异构酶活性包涵体。本发明以源自klebsiella sp.lx3的si为研究对象，其具有较高蔗糖转化率
(99.5％)和主产物为异麦芽酮糖等优势。将tdot分别融合在去除自身天然信号肽序列的si的n或c端，构建重组表达载体并转入大肠杆菌e.coli bl21(de3)中进行诱导表达，进一步分离纯化活性包涵体后进行酶学性质表征，从而为重组蔗糖异构酶的异源表达和高效利用提供新策略。
5.本发明提供了一种基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明还提供了一种基因，核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明还提供了核苷酸序列如seq id no.1所示的基因编码的含有tdot-si的融合蛋白，氨基酸序列如seq id no.3所示。
8.本发明还提供了核苷酸序列如seq id no.2所示的基因编码的含有si-tdot的融合蛋白，氨基酸序列如seq id no.4所示。
9.本发明还提供了一种含有核苷酸序列如seq id no.1所示的基因的重组工程菌。
10.本发明还提供了一种含有核苷酸序列如seq id no.2所示的基因的重组工程菌。
11.本发明还提供了一种蔗糖异构酶活性包涵体，由含有核苷酸序列如seq id no.1所示的基因的重组工程菌或者含有核苷酸序列如seq id no.2所示的基因的重组工程菌诱导融合蛋白表达，菌体破碎、分离、纯化所得。
12.具体地，所述蔗糖异构酶活性包涵体的制备方法，包括以下步骤：利用卷曲螺旋结构域tdot融合在蔗糖异构酶si的n或c端，构建重组表达载体并转入大肠杆菌e.coli bl21(de3)中进行诱导表达，制备成活性包涵体。
13.所述含有核苷酸序列如seq id no.1所示的基因的重组工程菌的蔗糖异构酶活性包涵体的制备方法，具体包括以下步骤：
14.(1)构建含有tdot-si融合蛋白的编码基因的重组表达载体pet-24a-tdot-si，将该重组表达载体转入表达宿主细胞，获得重组工程菌；
15.(2)培养所述重组工程菌，诱导融合蛋白表达；
16.(3)收集菌体细胞并进行细胞破碎，分离细胞破碎上清液和含有包涵体的沉淀样品，将沉淀样品通过缓冲液洗涤进行纯化得到活性包涵体。
17.所述含有核苷酸序列如seq id no.2所示的基因的重组工程菌的蔗糖异构酶活性包涵体的制备方法，具体包括以下步骤：
18.(1)构建含有si-tdot融合蛋白的编码基因的重组表达载体pet-24b-si-tdot，将该重组表达载体转入表达宿主细胞，获得重组工程菌；
19.(2)培养所述重组工程菌，诱导融合蛋白表达；
20.(3)收集菌体细胞并进行细胞破碎，分离细胞破碎上清液和含有包涵体的沉淀样品，将沉淀样品通过缓冲液洗涤进行纯化得到活性包涵体。
21.优选地，所述蔗糖异构酶si来源于klebsiella sp.lx3，其核苷酸序列为seq id no.5所示。
22.优选地，所述tdot基因来自海葡萄嗜热菌(staphylothermus marinus)，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
23.作为举例而非限制，所述表达宿主细胞优选为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
24.本发明还提供了一种蔗糖异构酶活性包涵体在催化蔗糖转化成异麦芽酮糖中的应用。
25.进一步地，所述蔗糖异构酶活性包涵体催化蔗糖转化成异麦芽酮糖的ph为4.5～6.5，温度为30～45℃。
26.本发明将源自细胞表面蛋白tetrabrachion的四聚化卷曲螺旋结构域(tetrameric coiled-coil domain of the cell-surface protein tetrabrachion,tdot)与si进行融合表达并研究重组酶的酶学性质。分别将tdot与si的n/c末端融合，构建重组表达载体，转入大肠杆菌e.coli bl21(de3)中进行诱导表达，结果显示tdot-si和si-tdot表达为具有催化活性的包涵体，而未融合tdot的si包涵体则无催化活性。进一步利用离心和缓冲液清洗将活性包涵体进行纯化，酶学性质研究显示tdot-si和si-tdot活性包涵体的最适反应温度均为40℃，最适反应ph分别为5.5和5.0。tdot-si活性包涵体的动力学常数km为103.9
±
9.5mmol/l，kcat/km为0.06
±
0.002l/(mmol
·
s)，si-tdot活性包涵体的动力学常数km为54.4
±
6.6mmol/l，kcat/km为0.03
±
0.002l/(mmol
·
s)。产物特异性研究结果显示，随着反应温度提高，产物中异麦芽酮糖含量并未出现较大变化，而产物中海藻酮糖随转化反应温度升高而降低，同时单糖的含量随转化反应温度提高而增加。本发明通过融合表达技术成功制备出融合卷曲螺旋结构域的蔗糖异构酶活性包涵体，其作为一种新型自固定化酶，具有同步实现表达和固定化的优势，为实现重组蔗糖异构酶的规模化制备和高效利用提供了新策略。
附图说明
27.图1是转化重组质粒工程菌的菌落pcr鉴定；泳道m为250bp dna ladder marker，泳道1为pet-24a-tdot-si；泳道2为pet-24b-si-tdot。
28.图2是重组6
×
his-si/si-6
×
his的sds-page分析；泳道m为protein marker；泳道1～4为pet24b-6
×
his-si诱导前、诱导后、上清液、沉淀；泳道5～8为pet24b-si-6
×
his诱导前、诱导后、上清液、沉淀。
29.图3是重组tdot-si/si-tdot的sds-page分析；泳道m为protein marker；泳道1～4为pet24a-tdot-si诱导前、诱导后、上清液、洗涤后包涵体；泳道5～8为pet24b-si-tdot诱导前、诱导后、上清液、洗涤后包涵体。
30.图4是温度对tdot-si和si-tdot酶活力的影响。
31.图5是ph对tdot-si和si-tdot酶活力的影响。
具体实施方式
32.下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
33.蔗糖异构酶si(ncbi accession number aak82938)源自klebsiella sp.lx3，蔗糖异构酶si基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。携带蔗糖异构酶si基因的质粒pet-28a-si可通过本领域常规手段合成。n/c端分别融合有组氨酸标签的质粒pet24b-6
×
his-si(核苷酸序列如seq id no.13所示)和pet24b-si-6
×
his(核苷酸序列如seq id no.14所示)均可通过本领域常规手段合成。
34.tdot的核苷酸序列如seq id no.6所示，携带tdot基因的质粒pet-24a-tdot由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。
35.卡那霉素、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside，iptg)、triton-x100、sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒、sanprep柱式dna胶回收试剂盒、bca蛋白质定量检测试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
36.hs dna polymerase、quickcuttm bamh i和quickcuttm xho i、dpn i、t4 dna连接酶、dna和蛋白质相对分子量标准品均购自宝生物工程(大连)有限公司。
37.基因测序工作由吉林省库美生物科技有限公司完成。
38.异麦芽酮糖购自sigma公司。
39.其它化学试剂购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
40.lb液体培养基：含10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉、10g/l nacl，ph 7.2；lb固体培养基为在lb液体培养基中加入1.5％琼脂。
41.llb培养基：含10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉、5g/l nacl，ph 7.2。
42.buffer a缓冲液：na2hpo4·
12h2o：16.937g、nah2po4·
2h2o：0.62g，溶于450-750ml去离子水，调ph为8.0后，加入50ml甘油，用去离子水定容至1l。
43.buffer b缓冲液：取0.5ml triton-x100溶于100ml buffer a缓冲液。
44.buffer c缓冲液：na2hpo4·
12h2o：16.937g、nah2po4·
2h2o：0.62g，溶于450-750ml去离子水，调ph为8.0后，用去离子水定容至1l。
45.实施例1重组表达载体的构建
46.以表1内引物，采用酶切连接法构建pet-24a-tdot-si表达载体：以实验室保藏的pet-28a-si为模板，其携带不包含天然信号肽的si编码基因，利用引物p1/p2扩增得到含有酶切位点的si基因片段，将其与pet-24a-tdot用quickcuttm bamh i和quickcuttm xho i进行双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后利用dna胶回收试剂盒回收线性化载体和目的基因片段，继续用t4 dna连接酶进行连接反应。将连接反应产物利用热激转化至e.coli dh10b感受态细胞中，涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板。挑取单菌落利用引物p5/p6进行菌落pcr鉴定，结果如图1(a)所示，扩增产物在1500-2250bp处存在单一条带，与预期扩增序列2055bp大小一致。将验证正确的阳性单克隆继续培养和提取质粒后进行基因测序，测序正确的重组表达载体标记为pet-24a-tdot-si。
47.采用restriction free-cloning(rf)克隆技术构建pet-24b-si-tdot表达载体：以pet-24a-tdot为模板利用引物p3/p4进行第一轮pcr扩增反应，将pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳分离后利用dna胶回收试剂盒进行回收，将其作为第二轮pcr反应的长引物，继续以pet24b-si-6
×
his为模板进行第二轮pcr反应。待反应结束后加入dpnⅰ分解模板质粒后将反应产物电击转化至e.coli dh10b感受态细胞中，涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板。挑取单菌落利用引物p5/p6进行菌落pcr鉴定，结果如图1(b)所示，扩增产物在1500-2250bp处存在单一条带，与预期扩增序列2049bp大小一致。将验证正确的阳性单克隆继续培养和提取质粒后进行基因测序，测序正确的重组表达载体标记为pet-24b-si-tdot。
48.表1本发明所用引物序列
[0049][0050]
实施例2重组基因在大肠杆菌中的诱导表达与分离纯化
[0051]
将构建的重组表达载体pet-24a-tdot-si和pet-24b-si-tdot，以及重组表达载体pet24b-6
×
his-si和pet24b-si-6
×
his分别转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞中，挑取阳性单克隆接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200r/min培养14h得到种子液。将种子液以1％(v/v)接入含50μg/ml卡那霉素的llb液体培养基中，于37℃，200r/min培养至od600nm达到0.6-0.8时加入诱导剂，其中重组工程菌e.coli bl21(de3)/pet-24a-tdot-si加入终浓度为0.8mmol/l的iptg，e.coli bl21(de3)/pet-24b-si-tdot加入终浓度为0.1mmol/l的iptg，e.coli bl21(de3)/pet24b-6
×
his-si和e.coli bl21(de3)/pet24b-si-6
×
his加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，将上述加入iptg的菌液继续在16℃，200r/min培养20h进行诱导表达。
[0052]
利用缓冲液清洗法对活性包涵体进行分离纯化：将诱导表达后的菌液离心收集并且用buffer a重悬后在冰水浴中超声破碎(功率500w，破碎3s，间隔5s，破碎20min)。将破碎后的全菌样品在10000r/min下离心15min分离可溶性上清和含有包涵体的沉淀组分。将沉淀依次用buffer b和buffer c清洗2次和3次，清洗后的包涵体样品用10000r/min下离心15min进行回收，最后将清洗后的包涵体样品用buffer c充分悬浮后得到活性包涵体酶液。取少量活性包涵体酶液加入等体积的10％sds溶液处理5min以彻底溶解包涵体，之后利用bca蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白浓度。将细胞破碎上清液和清洗后的活性包涵体样品利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page)进行检测。
[0053]
如图2所示，为重组6
×
his-si和si-6
×
his的sds-page分析。诱导后在66.4kda处出现与6
×
his-si和si-6
×
his理论相对分子质量68.14kda相符的目的条带，且主要以包涵体形式表达，经过酶活力检测发现包涵体沉淀无催化活性，表明无论在n/c端融合组氨酸标签，重组si蛋白都主要以无活性包涵体形式表达。
[0054]
如图3所示，为重组tdot-si和si-tdot的sds-page分析。诱导后全菌样品在66.4kda的蛋白相对分子质量标准品上方出现与tdot-si和si-tdot理论相对分子质量73.18kda相符的目的条带，表明融合蛋白成功被诱导表达。表达的融合蛋白tdot-si和si-tdot仍主要以包涵体形式存在于沉淀样品中，将包涵体进行酶活检测发现具有较高催化活性，表明融合tdot标签诱导si表达为活性包涵体。
[0055]
实施例4活性包涵体酶活力的测定
[0056]
(1)最适反应温度的测定
[0057]
取4mg/ml的tdot-si和si-tdot活性包涵体酶液100μl分别与含4％蔗糖的ph 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液400μl混匀，分别在30、35、40、45、50、55℃下于200r/min反应2h，之后将反应样品在100℃沸水中处理15min进行灭酶。之后将灭酶后的反应产物经10000r/min离心15min得到的上清用0.22μm滤膜过滤后进行hplc检测。hplc检测条件为：利用hypersil aps-2，4.6
×
250mm，5μm氨基柱对反应产物进行检测，采用示差检测器，流动相为乙腈：水(v/v＝80:20)，柱温35℃，进样量10μl，流速1.0ml/min。根据异麦芽酮糖标准品与其对应峰面积拟合出的标注曲线计算反应产物中异麦芽酮糖的浓度并计算酶活力。酶活力单位的定义：以蔗糖为底物，每分钟释放1μmol异麦芽酮糖所需的酶量为1个酶活力单位(u)。相对酶活定义：以同组的最高酶活为100％，计算所得比值为相对酶活。
[0058]
结果如图4所示，tdot-si和si-tdot活性包涵体均在40℃时具有最高酶活力，并且在30-40℃范围内酶活力随温度提高和增加，在35-45℃范围内二者均具有超过80％的酶活力，当温度高于45℃后tdot-si和si-tdot活性包涵体的酶活力均迅速下降。
[0059]
(2)最适反应ph的测定
[0060]
将tdot-si和si-tdot活性包涵体酶液分别与含4％蔗糖的ph 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混匀，在40℃下进行酶催化反应并对产物中异麦芽酮糖进行定量检测和酶活力计算，测定酶活力以确定最适反应ph。
[0061]
结果如图5所示，在ph 4.0-5.0范围内，随着ph提高tdot-si和si-tdot活性包涵体的酶活力均增加，并且分别在ph 5.5和ph 5.0下具有最高酶活力。此外，在ph 5.0-6.0范围内二者均具有超过80％的催化活性，并且在ph高于6.5后酶活力迅速下降。
[0062]
(3)酶促反应动力学常数的测定
[0063]
将tdot-si和si-tdot活性包涵体酶液分别与不同浓度(10、20、40、50、100、200、250、400、500、800mmol/l)的蔗糖溶液混合，在最适反应条件下(tdot-si：40℃，ph＝5.5；si-tdot：40℃，ph＝5)进行催化反应后利用hplc检测产物异麦芽酮糖的生成量并计算反应速度。之后利用graphpad prism 5.0基于michaelis-menten方程进行非线性拟合得到动力学常数km和vmax，计算得到kcat/km。
[0064]
在最适反应条件下测定tdot-si和si-tdot活性包涵体的比活力分别为622.6
±
17.5u/g和252.6
±
17.1u/g。进一步在不同浓度蔗糖底物下检测了活性包涵体的转化反应产物并计算得到催化反应速度，通过非线性拟合得到动力学常数，结果如表2所示，tdot-si的km为103.9
±
9.5mmol/l，k
cat
/km为0.06
±
0.002l/(mmols)，si-tdot的km为54.4
±
6.6mmol/l，k
cat
/km为0.03
±
0.002l/(mmols)，表明tdot标签融合在si的n/c端形成的活性包涵体对底物蔗糖具有不同的动力学参数，si-tdot与底物蔗糖的结合能力更强，但催化效率略低于tdot-si。
[0065]
表2 tdot-si/si-tdot的动力学参数
[0066][0067]
已报道制备固定化蔗糖异构酶的研究工作，如利用ε-多聚-l-赖氨酸修饰的介孔tio2固载si的比活力为39.41u/g，km为204.92mmol/l[wu l,liu y,chi b,et al.an innovative method for immobilizing sucrose isomerase onε-poly-l-lysine modified mesoporous tio2[j].food chemistry,2015,187:182-188.]，利用ε-多聚-l-赖氨酸和明胶制备的海绵对蔗糖异构酶进行固定化，比活力为71.58u/g，km为245.71mmol/l，与未固定化的自由酶km为259.71mmol/l相比无明显变化[wu l,qiu j,wu s,et al.bioinspired production of antibacterial sucrose isomerase-sponge for the synthesis of isomaltulose[j].advanced synthesis&catalysis,2016,358(24):4030-4040.]。而本发明通过将si在细胞内同步表达和固定化制备成活性包涵体，不仅无需载体材料和额外的固定化反应，而且单位质量具有较好的比活力，显示出较好的应用潜力。同时，本发明发现，tdot标签融合在si的n/c末端形成的活性包涵体对底物蔗糖表现出不同的动力学参数，表明形成的活性包涵体由于微观结构的不同影响了与底物的结合和催化过程。
[0068]
实施例6产物特异性分析
[0069]
将100μl浓度为4mg/ml的tdot-si活性包涵体酶液与400μl含4％蔗糖的ph 5.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混匀；将100μl浓度为4mg/ml的si-tdot活性包涵体酶液与400μl含4％蔗糖的ph 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混匀。将上述活性包涵体转化反应体系分别在30、35、40℃下，于200r/min反应12h，之后将酶转化样品经100℃沸水处理15min进行灭酶，再经10000r/min离心15min得到反应产物上清，用0.22μm滤膜过滤后利用hplc检测转化反应产物。
[0070]
结果如表3所示，tdot-si和si-tdot活性包涵体在当前温度范围内，转化反应产物中的异麦芽酮糖含量并未有较大幅度的变化，而产物中海藻酮糖的含量普遍随转化反应温度的提高而表现出降低的趋势，同时单糖(果糖和葡萄糖)的含量随温度提高而增加。
[0071]
表3不同温度下融合tdot标签蔗糖异构酶催化产物组成分析
[0072][0073]
本发明通过融合表达技术，利用卷曲螺旋结构域tdot作为融合标签，在大肠杆菌e.coli bl21(de3)中成功将蔗糖异构酶表达为活性包涵体，实现了表达和固定化的同步进行，其作为一种新型自固定化酶，无需载体材料和用于传统固定化反应的化学试剂，具有潜在的工业应用价值，同时，本发明也为针对实现重组蔗糖异构酶的高效制备和利用提供了新策略，为进一步的设计和优化打下了基础。
技术特征：1.一种基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.2所示。3.权利要求1所述基因编码的含有tdot-si的融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.3所示。4.权利要求2所述基因编码的含有si-tdot的融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.4所示。5.一种含有权利要求1所述基因的重组工程菌。6.一种含有权利要求2所述基因的重组工程菌。7.一种蔗糖异构酶活性包涵体，其特征在于，由权利要求5或6所述重组工程菌诱导融合蛋白表达，菌体破碎、分离、纯化所得。8.一种蔗糖异构酶活性包涵体在催化蔗糖转化成异麦芽酮糖中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述蔗糖异构酶活性包涵体催化蔗糖转化成异麦芽酮糖的ph为4.5～6.5，温度为30～45℃。
技术总结本发明公开了一种融合卷曲螺旋结构域的蔗糖异构酶活性包涵体，属于生物工程领域。本发明以源自Klebsiella sp.LX3的SI为研究对象，将TdoT分别融合在去除自身天然信号肽序列的SI的N或C端，构建重组表达载体并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，进一步分离纯化活性包涵体后进行酶学性质表征，从而为重组蔗糖异构酶的异源表达和高效利用提供新策略。策略。
技术研发人员：王从纲 高向红 庞焦 马志宇 李明玉 李宪臻
受保护的技术使用者：李宪臻
技术研发日：2022.02.16
技术公布日：2022/7/5
