1.本发明涉及纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂制备领域，具体而言，涉及一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂及其制备方法。
背景技术：2.现有的纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂在进行制备的过程中存在一些不足之处需要进行改进，不足之处如下：
3.1)首先目前的微泡类超声造影剂，粒径大，多为微米级的，静脉注射后，不易渗漏到血管外，难以对血管外的疾病进行诊断；
4.2)其次外壳材料大多是脂质体，稳定性差，限制了临床上的应用。
技术实现要素：5.针对上述问题。本发明提供了一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂，通过采用硅脂质为外壳材料，制备出粒径在320nm左右包裹26～29℃低沸点液态pfp纳米乳，具有更好的稳定性，超声造影效果显著，体外持续超声显影时间长，又能弥补纳米级超声造影剂显影效果差的缺陷，解决了脂质造影剂稳定性差的问题。
6.为解决上述技术问题，本发明提出了一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂，包括以下组分：
7.pfp硅脂质：3mg～5mg；dspe-peg2000：5％～15％摩尔比；乙醇：0.2ml ph＝3；超纯水：4ml～5ml；全氟戊烷：2ml～6ml；脂质溶液：3ml～6ml；pfp硅脂质纳米乳：4ml～7ml。
8.为解决上述技术问题，本发明还提出了一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、称取4mg的pfp硅脂质和不同摩尔比(5％～15％)的dspe-peg2000溶于0.2mlph＝3的酸性乙醇中，孵育4h，温度控制在50℃，使硅脂质充分在酸性乙醇中水解成混合的脂质溶液，得到亲水的硅羟基头部；
10.s2、将4ml超纯水和不同量的全氟戊烷加入10ml的血清瓶中，在水浴超声条件下逐滴加入步骤s1中酸化好的混合脂质溶液，得到预乳液；
11.s3、将预乳液用超声细胞破碎仪超声1min(设置幅度为30a，工作3s停3s)形成乳白色乳液，低转速离心除去未包进去的全氟戊烷，一共离心水洗3次，再重新分散在水中置于4℃冰箱保存，整个制备过程控制环境温度低于15℃，减少全氟戊烷不必要的气化。
12.在进一步的实施方案中，可以用以下步骤替换步骤s1，具体如下：
13.称取4mg所述pfp硅脂质纳米乳和不同摩尔比(5％～15％)的dspe-peg2000溶于0.2mlph＝3的酸性乙醇中，孵育不超过4h，直接溶于乙醇中滴加。
14.采用上述替换的步骤，可以进一步解决pfp硅脂质纳米乳的生产的的问题。
15.在进一步优选的技术方案中，还包括以下步骤：采用氩离子激光器测定所述pfp硅脂质纳米乳的粒度，控制温度为25℃，激光波长为630nm，动态光散射角为θ＝90
°
。
16.上述步骤可以进一步解决pfp硅脂质纳米乳的粒度无法进行测量的问题。
17.在进一步优选的技术方案中，还包括以下步骤：将所述pfp硅脂质纳米乳进行液-气相变的加热程序为，从室温26℃加热至37℃，5℃/min，保温5min后加热至65℃，5℃/min，保温5min。
18.上述步骤可以进一步解决pfp硅脂质纳米乳液-气相变的加热后成相效果比较差的问题。
19.在进一步优选的技术方案中，将所述pfp硅脂质纳米乳进行体外显影实验，步骤如下：
20.取pfp硅脂质纳米乳稀释至0.25mg/ml后，取4ml装入3ml的滴管中，用止血钳夹住，且止血钳的位置在乳液液面下1mm左右的地方，将该滴管倒置入水槽中，用toshiba多功能彩色多普勒超声诊断仪，depth＝3.0cm，在造影模式(f＝3.5mhz，mi＝0.08)下，温度为26℃和加热到37℃，扫查并保存图片，并以等量的生理盐水作为对照，比较在不同温度条件下pfp硅脂质纳米乳显影强度的差别。
21.上述步骤可以进一步解决pfp硅脂质纳米乳显影强度的差别无法测量的问题。
22.在进一步优选的技术方案中，采用乙醇注入法制备pfp硅脂质纳米乳，步骤如下：首先将硅脂质和dspe-peg2000溶解在酸性乙醇中孵育，pfp通过水浴超声分散在纯水中随即逐滴加入上述孵育好的脂质溶液两亲性的硅脂质组装形成纳米乳，同时将pfp作为内核负载在纳米乳内核中。
23.上述步骤可以进一步解决制备pfp硅脂质纳米乳效果比较差的问题。
24.在进一步优选的技术方案中，步骤s3中，超声显影实验频率设置为3.5mhz，所述pfp硅脂质纳米乳在加热到65℃发生了“液-气相转变”并超声的大量的微泡，提高了对超声波的背向散射作用。
25.上述步骤可以进一步解决“液-气相转变”超声波的背向散射比较弱的问题。
26.在进一步优选的技术方案中，所述pfp硅脂质纳米乳的生物相容性，mtt法测试其对与hela细胞共孵育24h和48h后的细胞毒性。
27.上述步骤可以进一步解决pfp硅脂质纳米乳的生物相容性无法进行准确测量的问题。
28.在进一步优选的技术方案中，还包括以下步骤：所述pfp硅脂质纳米乳纳米乳与hela细胞一起孵育24h和48h后，从50～800μg/ml的浓度范围内，hela细胞的存活率均在90％以上，则pfp硅脂质纳米乳对hela细胞没有细胞毒性作用，具有生物相容性。
29.本发明的有益效果是：
30.a、采用硅脂质为外壳材料，制备出粒径在320nm左右包裹26～29℃低沸点液态pfp纳米乳；
31.b、该纳米乳的外壳材料比脂质体有更好的稳定性，体外持续超声显影时间长；
32.c、在加热条件下，能通过“液-气相转变”产生微米级气泡，既具备血管外显影的优点，又能弥补纳米级超声造影剂显影效果差的缺陷；
33.d、通过以硅脂质、全氟戊烷(pfp)为原料制备液态氟碳硅质纳米乳，以载药液态氟碳脂质纳米乳作为对照组分析其稳定性，并探究其体外超声造影的效果；
34.e、所制备的液态氟碳硅脂质纳米乳较脂质纳米乳有更好的稳定性，且超声造影效
果显著；
35.f、能够成功制备出稳定性好，体外超声造影效果显著的多功能纳米乳，很好地解决了脂质造影剂稳定性差的缺点，实现了诊断与治疗一体化。
附图说明：
36.图1为本发明提供的pfp硅脂质纳米乳的tem电镜图片(a)和粒径分布图片(b)图；
37.图2为本发明提供的pfp硅脂质纳米乳在pbs和ns的稳定性图；
38.图3为本发明提供的pfp硅脂质纳米乳和pfp脂质纳米乳在tx-100中的稳定性图；
39.图4为本发明提供的pfp硅脂质纳米乳在加热前和加热到37℃的偏光显微镜图；
40.图5为本发明提供pfp硅脂质纳米乳在机械指数为0.08不同频率下的超声显影效果图(a)和对应的灰度值图(b)图；
41.图6为本发明提供pfp硅脂质纳米乳在频率为3.5mhz不同机械指数下的超声显影图(a)和对应的灰度值图(b)图；
42.图7为本发明提供pfp硅脂质纳米乳与hela细胞孵育24h和48h的细胞活力图。
具体实施方式
43.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
44.实施例1：
45.如图1-图7所示，一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂，包括以下成分：
46.pfp硅脂质：3mg～5mg；
47.dspe-peg2000：5％～15％摩尔比；
48.乙醇：0.2mlph＝3；
49.超纯水：4ml～5ml；
50.全氟戊烷：2ml～6ml；
51.脂质溶液：3ml～6ml；
52.pfp硅脂质纳米乳：4ml～7ml。
53.实施例2：
54.如图1-图7所示，一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
55.s1、称取4mg的pfp硅脂质和不同摩尔比(5％～15％)的dspe-peg2000溶于0.2mlph＝3的酸性乙醇中，孵育4h，温度控制在50℃，使硅脂质充分在酸性乙醇中水解成混合的脂质溶液，得到亲水的硅羟基头部；
56.s2、将4ml超纯水和不同量的全氟戊烷加入10ml的血清瓶中，在水浴超声条件下逐滴加入步骤s1中酸化好的混合脂质溶液，得到预乳液；
57.s3、将预乳液用超声细胞破碎仪超声1min(设置幅度为30a，工作3s停3s)形成乳白色乳液，低转速离心除去未包进去的全氟戊烷，一共离心水洗3次，再重新分散在水中置于4℃冰箱保存，整个制备过程控制环境温度低于15℃，减少全氟戊烷不必要的气化。
58.实施例3：
59.本实施例通过以下步骤替换实施例2的步骤s1：
60.称取4mg所述pfp硅脂质纳米乳和不同摩尔比(5％～15％)的dspe-peg2000溶于0.2mlph＝3的酸性乙醇中，孵育不超过4h，直接溶于乙醇中滴加。
61.在另外一个实施例中，还包括以下步骤：采用氩离子激光器测定所述pfp硅脂质纳米乳的粒度，控制温度为25℃，激光波长为630nm，动态光散射角为θ＝90
°
。
62.在另外一个实施例中，将所述pfp硅脂质纳米乳进行液-气相变的加热程序为，从室温26℃加热至37℃，5℃/min，保温5min后加热至65℃，5℃/min，保温5min。
63.在另外一个实施例中，将所述pfp硅脂质纳米乳进行体外显影实验，步骤如下：取pfp硅脂质纳米乳稀释至0.25mg/ml后，取4ml装入3ml的滴管中，用止血钳夹住，且止血钳的位置在乳液液面下1mm左右的地方，将该滴管倒置入水槽中，用toshiba多功能彩色多普勒超声诊断仪，depth＝3.0cm，在造影模式(f＝3.5mhz，mi＝0.08)下，温度为26℃和加热到37℃，扫查并保存图片，并以等量的生理盐水作为对照，比较在不同温度条件下pfp硅脂质纳米乳显影强度的差别。
64.在另外一个实施例中，采用乙醇注入法制备pfp硅脂质纳米乳，步骤如下：首先将硅脂质和dspe-peg2000溶解在酸性乙醇中孵育，pfp通过水浴超声分散在纯水中随即逐滴加入上述孵育好的脂质溶液两亲性的硅脂质组装形成纳米乳，同时将pfp作为内核负载在纳米乳内核中，步骤s3中，超声显影实验频率设置为3.5mhz，所述pfp硅脂质纳米乳在加热到65℃发生了“液-气相转变”并超声的大量的微泡，提高了对超声波的背向散射作用。
65.在另外一个实施例中，pfp硅脂质纳米乳的生物相容性，mtt法测试其对与hela细胞共孵育24h和48h后的细胞毒性，pfp硅脂质纳米乳纳米乳与hela细胞一起孵育24h和48h后，从50～800μg/ml的浓度范围内，hela细胞的存活率均在90％以上，则pfp硅脂质纳米乳对hela细胞没有细胞毒性作用，具有生物相容性。
66.本发明实施例的工作过程如下：
67.s1、称取4mg的pfp硅脂质和不同摩尔比(5～15％)的dspe-peg2000溶于0.2mlph＝3的酸性乙醇中孵育4h(50℃)，使硅脂质充分在酸性乙醇中水解，得到亲水的硅羟基头部。
68.s2、将4ml超纯水和不同量的全氟戊烷加入10ml的血清瓶中，在水浴超声条件下逐滴加入上述酸化好的混合脂质溶液，得到预乳液。
69.s3、将预乳液用超声细胞破碎仪超声1min(设置幅度为30a，工作3s停3s)形成乳白色乳液，低转速离心除去未包进去的全氟戊烷，一共离心水洗3次，再重新分散在水中置于4℃冰箱保存，整个制备过程控制环境温度低于15℃，减少全氟戊烷不必要的气化；
70.pfp脂质纳米乳不同摩尔比(5～15％)的dspe-peg2000溶于0.2ml ph＝3的酸性乙醇中，不需要孵育4h，直接溶于乙醇中滴加，pfp硅脂质纳米乳的粒度测定采用氩离子激光器，温度为25℃，激光波长630nm，动态光散射角为θ＝90
°
条件下测定；
71.为了研究pfp硅脂质纳米乳的稳定性，采用马尔文zetasizer nano-zs90光散射纳米粒度仪对所得纳米乳的平均粒径、粒度分布进行不同时间点测定。具体方法如下：取一定体积新制备纳米乳分散在分别pbs(0.01m，ph＝7.4)和生理盐水(ns)中，将其置与摇床中孵育(37℃，1000rpm)，采用动态光散射的方法，分别在0h，0.1h，0.3h，0.6h，1h，3h，6h，9h，12h，24h，48h和96h时间点检测其粒径的变化。
72.pfp硅脂质纳米乳的液-气相变研究是其作为hifu增效剂的关键。通过大量文献阅读，确定采用偏光显微镜及热台设备来探究pfp硅脂质纳米乳的液-气相变过程，pfp硅脂质
纳米乳的液-气相变的加热程序为，从室温26℃加热至37℃，保温5min，pfp硅脂质纳米乳体外显影实验步骤为取pfp硅脂质纳米乳稀释至0.25mg/ml后，取4ml装入3ml的滴管中，用止血钳夹住，且止血钳的位置在乳液液面下1mm左右的地方，将该滴管倒置入水槽中，用toshiba多功能彩色多普勒超声诊断仪，depth＝3.0cm，在造影模式(f＝3.5mhz，mi＝0.08)下，温度为26℃和加热到37℃，扫查并保存图片，并以等量的生理盐水作为对照，比较在不同温度条件下pfp硅脂质纳米乳显影强度的差别。
73.乙醇注入法制备pfp硅脂质纳米乳，首先将硅脂质和dspe-peg2000溶解在酸性乙醇中孵育，pfp通过水浴超声分散在纯水中随即逐滴加入上述孵育好的脂质溶液两亲性的硅脂质组装形成纳米乳，同时将pfp作为内核负载在纳米乳内核中，超声显影实验频率设置为3.5mhz，pfp硅脂质纳米乳在加热到37℃发生了“液-气相转变”并超声的大量的微泡，提高了对超声波的背向散射作用。
74.pfp硅脂质纳米乳的生物相容性，mtt法测试其对与hela细胞共孵育24h和48h后的细胞毒性，pfp硅脂质纳米乳纳米乳与hela细胞一起孵育24h和48h后，从50～800μg/ml的浓度范围内，hela细胞的存活率均在90％以上，则pfp硅脂质纳米乳对hela细胞几乎没有细胞毒性作用，生物相容性好。
75.以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
技术特征：1.一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂，其特征在于，包括以下组分：pfp硅脂质：3mg～5mg；dspe-peg2000：5％～15％摩尔比；乙醇：0.2mlph＝3；超纯水：4ml～5ml；全氟戊烷：2ml～6ml；脂质溶液：3ml～6ml；pfp硅脂质纳米乳：4ml～7ml。2.一种如权利要求1所述的纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、称取4mg的pfp硅脂质和不同摩尔比(5％～15％)的dspe-peg2000溶于0.2mlph＝3的酸性乙醇中，孵育4h，温度控制在50℃，使硅脂质充分在酸性乙醇中水解成混合的脂质溶液，得到亲水的硅羟基头部；s2、将4ml超纯水和不同量的全氟戊烷加入10ml的血清瓶中，在水浴超声条件下逐滴加入步骤s1中酸化好的混合脂质溶液，得到预乳液；s3、将预乳液用超声细胞破碎仪超声1min(设置幅度为30a，工作3s停3s)形成乳白色乳液，低转速离心除去未包进去的全氟戊烷，一共离心水洗3次，再重新分散在水中置于4℃冰箱保存，整个制备过程控制环境温度低于15℃，减少全氟戊烷不必要的气化。3.根据权利要求2所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤用于替换步骤s1：称取4mg所述pfp硅脂质纳米乳和不同摩尔比(5％～15％)的dspe-peg2000溶于0.2mlph＝3的酸性乙醇中，孵育不超过4h，直接溶于乙醇中滴加。4.根据权利要求2所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：采用氩离子激光器测定所述pfp硅脂质纳米乳的粒度，控制温度为25℃，激光波长为630nm，动态光散射角为θ＝90
°
。5.根据权利要求2所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将所述pfp硅脂质纳米乳进行液-气相变的加热程序为，从室温26℃加热至37℃，5℃/min，保温5min后加热至65℃，5℃/min，保温5min。6.根据权利要求2所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，将所述pfp硅脂质纳米乳进行体外显影实验，步骤如下：取pfp硅脂质纳米乳稀释至0.25mg/ml后，取4ml装入3ml的滴管中，用止血钳夹住，且止血钳的位置在乳液液面下1mm左右的地方，将该滴管倒置入水槽中，用toshiba多功能彩色多普勒超声诊断仪，depth＝3.0cm，在造影模式(f＝3.5mhz，mi＝0.08)下，温度为26℃和加热到37℃，扫查并保存图片，并以等量的生理盐水作为对照，比较在不同温度条件下pfp硅脂质纳米乳显影强度的差别。7.根据权利要求2所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，采用乙醇注入法制备pfp硅脂质纳米乳，步骤如下：
首先将硅脂质和dspe-peg2000溶解在酸性乙醇中孵育，pfp通过水浴超声分散在纯水中随即逐滴加入上述孵育好的脂质溶液两亲性的硅脂质组装形成纳米乳，同时将pfp作为内核负载在纳米乳内核中。8.根据权利要求2所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，步骤s3中，超声显影实验频率设置为3.5mhz，所述pfp硅脂质纳米乳在加热到65℃发生了“液-气相转变”并超声的大量的微泡，提高了对超声波的背向散射作用。9.根据权利要求2所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述pfp硅脂质纳米乳的生物相容性，mtt法测试其对与hela细胞共孵育24h和48h后的细胞毒性。10.根据权利要求9所述的一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：所述pfp硅脂质纳米乳纳米乳与hela细胞一起孵育24h和48h后，从50～800μg/ml的浓度范围内，hela细胞的存活率均在90％以上，则pfp硅脂质纳米乳对hela细胞没有细胞毒性作用，具有生物相容性。
技术总结本发明提供了一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂，包括以下组分：PFP硅脂质：3mg～5mg；DSPE-PEG2000：5％～15％摩尔比；乙醇：0.2mLpH＝3；超纯水：4mL～5mL；全氟戊烷：2mL～6mL；脂质溶液：3mL～6mL；PFP硅脂质纳米乳：4mL～7mL。本发明还提供了一种纳米液态氟碳硅脂质超声造影剂的制备方法。本发明采用超声细胞破碎法，以硅脂质、全氟戊烷为原料制备液态氟碳硅质纳米乳，以液态氟碳脂质纳米乳作为对照组分析其稳定性，并探究其体外超声造影的效果。所制备的液态氟碳硅脂质纳米乳较脂质纳米乳有更好的稳定性，且超声造影效果显著。成功制备出稳定性好，体外超声造影效果显著的多功能纳米乳，将很好地解决脂质造影剂稳定性差的问题，实现了诊断与治疗一体化。实现了诊断与治疗一体化。实现了诊断与治疗一体化。
技术研发人员：朱文健
受保护的技术使用者：中山大学附属第七医院（深圳）
技术研发日：2022.03.22
技术公布日：2022/7/5
