一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用
技术领域
1.本发明属于烟草病害防治技术领域，具体涉及一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
背景技术：2.烟草（nicotiana tabacum l.）属于茄科烟草属，是一种商业化的叶用经济作物（曾文艺等，2022），病害一直是影响烟草生产的重要因素之一，近年来随着气候条件、土壤微生态和耕作制度等变化，烟草镰刀菌根腐病已成为危害烟草的重要根茎类真菌病害（李小杰等，2022），引起烟草镰刀菌根腐病的主要病原是尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）和茄病镰刀菌（fusarium solani）（邱睿等，2018）。
3.近年来，生防微生物的应用成为防治植物病虫害的重要手段。假单胞菌属细菌广泛分布于植物根际土壤，可产生多种具有抑菌活性的次生代谢产物，在病害防治中发挥着重要作用，假单胞菌还可以产生植物激素等物质，促进植物生长（黄艺烁等，2021）。其中绿针假单胞菌被一些学者成功用于苦瓜枯萎病、辣椒疫霉病、番茄枯萎病等病害防治中。
4.目前，利用拮抗微生物进行烟草病害防治的研究和应用备受关注，已有学者分离获得了对烟草黑胫病、赤星病、青枯病效果明显的拮抗菌株，对于烟草镰刀菌根腐病菌生物防治的研究鲜见报道。为此，本研究以健康烟株根际土壤为分离来源，利用平板对峙法对分离菌株的拮抗效果进行筛选，对抑菌率较高的菌株进行抑菌谱测定、防病促生作用测定、分类鉴定以及生防机理探索，以期为烟草镰刀菌根腐病生物防治药剂研发提供理论基础。
5.镰刀菌（fusarium spp.）是一类世界性分布的真菌，镰刀菌侵染烟草引起的枯萎病和根腐病是世界性的土传真菌病害，在美国、韩国、加拿大、澳大利亚、南非、日本等产烟国普遍发生。近年来，随着农业耕作制度变迁和区域性环境变化，镰刀菌根腐病在我国烟区的发病范围和发病程度呈上升趋势，目前在云南、河南、湖南、山东、贵州、福建、湖北、安徽等地均有发生，已成为我国烟区重大病害之一。
6.绿针假单胞菌通过产生2,4-二乙酰藤黄酚( 2,4-diacetylphloroglucinol phl)，吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid pca)，藤黄绿脓菌素(pyoluteorin，plt)硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)和氰化物(hcn)等代谢物质、改善矿物质营养或通过竞争作用抑制或阻碍根围病原微生物的发展，促进植物生长，起到拮抗植物病害的作用。
7.王远山等人发现绿针假单胞菌pl9菌株对烟草疫霉菌丝体及游动孢子具有很强的抑制作用；黄艺烁等人发现一株绿针假单胞菌橘黄亚种在番茄匍炳霉叶斑病具有很好防效；申顺善等研究发现绿针假单胞菌hg28-5在辣椒根际的定殖能力很强，对辣椒疫病具有明显的防治效果，具有良好的生防潜力和应用前景。目前，关于铜绿假单胞菌进行烟草镰刀菌的生物防治尚未有相关文献报道。
技术实现要素：8.为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提出了一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，用以解决上述背景技术中提到的问题。
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，试验所用的供试材料包括供试土样、供试菌株、供试烟草品种和供试培养基；所述供试土样是2021年5-8月从河南许昌襄城县、三门峡卢氏县、渑池县等烟田健康烟株根际采集根际土样，共82份；所述供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌b-9-1（fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌a-4-9(fusarium solani)，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种（烟草疫霉phytophthora nicotianae）、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉(thielaviopsis basicola)，烟草白绢病菌(sclerotium rolfsiii sacc)，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌(rhizoctonia solani)，鸢尾丝囊霉菌(aphanomyces iridis)及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌(botryosphaeria dothide)，上述病原菌均由河南省农业科学院烟草研究所提供；所述供试烟草品种为中烟100；所述供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）、马铃薯葡萄糖液体培养基（pdb）、lb液体培养基。
10.优选的，实验步骤如下：a1、拮抗细菌分离纯化采用稀释涂布平板法，分别称取10g混匀的健康烟株根基土壤，放入250 ml无菌三角瓶中，加入90ml无菌水后置于摇床震荡10min，使土样均匀分散在稀释液中，为10-1土壤悬浮液，再进行梯度稀释，依次稀释至10-4、10-5和10-6，各吸取100l稀释液涂布与1/2 lb固体培养基上，28℃黑暗培养2d，挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落与新的lb固体培养基上进行划线纯化后，所得菌株斜面保存备用；a2、拮抗细菌的筛选采用平板对峙法（宋光桃等，2010），以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌；用接针将分离到的细菌上下平行划线接种于距培养皿中心2.5cm处的pda培养皿两边，28℃培养24h后，取培养5d的靶标病原菌，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于接有细菌的pda平板中央，以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照，置于28℃培养箱中恒温培养；待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量处理组抑菌带宽度，计算抑菌率，每个处理3次重复；抑菌率=(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径
×
100%；a3、拮抗细菌的抑菌谱测定采用平板对峙培养法（宋光桃等，2010）略有改动（平行划线改为对称点接种），进行生防菌株对8种常见烟草病原真菌抑菌试验，每个处理3次重复；a4、拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定
参照姚晨虓等（2021）的培养皿滤纸保湿法，将中烟100裸种依次用75%的乙醇和0.5%的次氯酸钠消毒30s，无菌水漂洗干净后放入拮抗细菌悬浮液（浓度为1
×
109cfu/ml）中浸种3h，再用无菌水漂洗3-4次后，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间的消毒种子作为对照，每皿25粒种子（5
×
5），重复3次，第10天测量统计种子萌发率及烟苗根长，计算增长率；增长率=(处理组根系长度-对照组根系长度)/对照组根系长度
×
100%；a5、拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定拮抗菌发酵滤液的制备：将lb斜面保存菌株接1环于盛有150ml lb液体培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h得到菌液原液；将上述培养得到的菌液经12000r/min离心10 min，留上清液，用细菌过滤器（22μm）除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液；拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用：收集病原菌分生孢子，将孢子浓度调至1
×
107孢子/ml，分别与4株拮抗菌株发酵滤液等体积混合，25℃共培养24h，在光学显微镜下观察孢子萌发情况，无菌lb液体培养基滤液处理为对照，每个处理重复3次；a6、拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定参照杨艺炜等（2018）的方法，测定生防菌株挥发性物质对靶标菌的抑制活性，在活化的靶标菌边缘上取直径5mm菌块置于新的pda平板中央，用接菌环在lb平板上化满生防细菌菌株，将前者反口与后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以空白的lb平板做对照，每个处理重复3次，28℃黑暗培养7d，测定对照和处理的靶标菌菌落直径，并计算相对抑菌率；a7、拮抗细菌的鉴定参考千慧敏（2020）等方法进行16s rdna基因序列pcr扩增，以待测菌株基因组dna为模板，用通用引物27f和1492r扩增待测细菌的16s rdna序列，引物表见说明书附图4；pcr反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，pcr扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的目标片段连接到pmd-19t vector上，含目的片段的单克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序；应用ncbi进行序列比对分析，采用mega7.0软件的neighbor-joining法构建系统发育树；a8、拮抗菌抗生素合成基因检测将拮抗假单胞菌菌株接于lb液体培养基中，180 r/min振荡培养24h，取2ml菌液离心后留沉淀，用细菌dna提取试剂盒提取菌株dna；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成假单胞杆菌的dapg和pca合成基因的特异性引物，引物表见说明书附图4，pcr扩增后将特异性条带回收并克隆，送由生工测序，用ncbi blast比对分析dna序列；a9、拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定挑选健康、饱满的中烟100种子，漂浮育苗法培养至大十字期（3-4片真叶），用无菌镊子轻轻挑出大小一致的健壮烟苗，无菌轻轻水涮洗掉烟苗根部基质，将烟苗根部浸泡于浓度为 1
×
109cfu/ml的拮抗细菌悬浮液中30min，移栽至装有无菌基质的灭菌花盆（85
×
70mm）中培养2d后，进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20ml，灌根结束后24h，在烟根周围接种预先培养好的带有靶标菌的麦粒，5g/每株，共设置3个对照组，对照组1无菌水侵泡烟苗接种
靶标菌，对照组2拮抗菌悬浮液浸泡烟苗接种无菌麦粒，对照组3无菌水侵泡烟苗接种无菌麦粒，接靶标菌后48h，再次进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20ml，以等体积无菌水灌根处理对照1和3，每处理5株盆；培养第30d根据中华人民共和国国家标准（gb/t23222-2008）中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效；根据中华人民共和国烟草行业标准（yc/t142-2010）中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重，叶面积（m2）=0.6345
×
叶长（cm）
×
叶宽（cm）；病情指数=(σ（病级数
×
该病级植株数）)/(最大病级数
×
植株总数)
×
100%；防治效果=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100%；a10、数据统计与分析数据处理采用excel和dps7.05软件分析，方差分析采用duncan新复极差法。
11.优选的，实验结果如下：b1、生防菌株的分离筛选通过平板对峙法筛选得到拮抗作用较好的细菌菌株yx33，该菌株离自河南卢氏县烟区健株根际土壤；由平板对峙法结果可知，该菌株对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的平均防效都在57%以上，具体数据见说明书附图5；其中，表中数据为3次重复的平均值；同列数据后的不同小写字母表示差异显著（p《0.05）；b2、生防菌株抑菌谱测定利用平板对峙法对菌株yx33的抑菌谱进行了测定，测定结果显示，该菌株对供试的8种烟草根茎类病害病原菌均有不同程度的抑制作用，具体数据见说明书附图6，生防菌株对茄病镰刀菌的平均抑菌率均大于80%，对烟草疫霉菌、鸢尾丝囊霉菌、葡萄坐腔球菌的抑菌率均大于60%，对烟草尖孢镰刀菌、白绢病菌、立枯丝核菌和烟草根串珠霉的的抑制效果都达到了50%以上；b3、拮抗菌株对烟草种子促生作用测定试验结果如说明书附图7所示， 4拮抗菌株yx33悬浮液处理过的种子发芽后烟苗根系较对照组显著增长，yx33处理组烟苗根系增长率达到了133.93%；；b4、拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定试验结果表明，拮抗菌株发酵滤液能抑制病原菌孢子萌发，lb液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45%以上，拮抗菌发酵滤液处理孢子萌发率仅有6%-8%，见说明书附图5；b5、拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定测定结果如说明书附图9显示，拮抗菌株挥发性化合物对茄病镰刀菌的抑菌效率为25.07%，且影响菌落形态，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，显微观察有孢子产生，拮抗菌处理菌株气生菌丝丰富浓密，菌落中心凸起，菌落边缘不整齐、菌丝相互交织，显微观察无孢子；拮抗菌yx33产生的voc对尖孢镰刀菌的抑菌率仅有3.32
±
0.67%，但对尖孢镰刀菌菌落形态有较大影响，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，菌落表面有白色粉样组织，背面培养基中有粉色色素产生，yx33处理菌株菌落边缘整齐，菌丝纯白色，菌落中央有青绿
色色素产生，拮抗菌挥发性有机化合物抑菌活性测定情况见图1；b6、拮抗细菌的鉴定blast结果如图2所显示，菌株yx33与绿针假单胞菌（pseudomonas chlororaphis）x8（mw786769.1）等的序列相似性达到97%，且位于统一分支，因此鉴定yx3为绿针假单胞菌；b7、拮抗菌抗生素合成基因检测序列扩增结果如图3所示，菌株yx33可以扩增到600bp左右的特异性条带，经测序，yx33得到569bp的序列，ncbi数据库blast结果显示，yx33 pca合成相关基因（om719879）序列与pseudomonas aeruginosa stain pa2101 phzg2（mn044391.1）和pseudomonas aeruginosa strain pa1201 phzg2（kx180138.1）基因的相似性均为98.25%，该菌株均未扩增出dapg相关基因片段；b8、拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定盆栽防效试验结果见说明书附图10，生防菌株yx33对烟草尖孢镰刀菌根腐病有显著防治效果，能显著降低烟草镰刀菌根腐病的发病率和病情指数，该菌株对烟草尖孢镰刀菌根腐病的平均防效为79.93%，对茄病镰刀菌的防效偏低，为17.33%；盆栽促生实验结果如说明书附图11所示，生防菌处理烟株有效叶片数与对照组无显著差异，在最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积等农艺性状指标上均较对照有显著的促进作用，生防菌株处理烟株最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积和总根体积较对照分别提高了142.00%、177.23%、542.86%、74.54%、22.28%和380%。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开一种对烟草镰刀菌根腐病原具有明显拮抗效果的绿针假单胞菌（pseudomonas chlororaphis）yz33，并对其抑菌机理和促生特性进行了初步分析，该菌株对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，主要通过菌体产生的抗生素抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌产生较强的抑菌效果，且可促进烟株生长发育，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。
附图说明
13.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为本发明拮抗菌挥发性有机化合物抑菌活性测定结果图，上排为尖孢镰刀菌，下排为茄病镰刀菌，从左为ck, 右为yx33处理；图2为本发明拮抗细菌的鉴定结果图，是基于16s rdna构建的系统发育树；图3为本发明拮抗菌抗生素合成基因检测结果图，其中m：dl2000 marker；1-4为yx33的pca合成相关基因；图4为本发明检测引物信息表图5为本发明生防菌对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑菌效果表；图6为本发明生防菌株对8种病原菌抑菌表；图7为本发明生防菌对烟草根系发育影响测定结果表；图8为本发明生防菌发酵液对病原菌孢子萌发的影响表；图9为本发明生防菌株voc对病原菌抑菌效果表；图10为本发明生防菌株对烟草镰刀菌根腐病的防治效果表；
图11为本发明生防细菌对盆栽烟草的促生效果表。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
15.请参阅图1-11，本发明提供以下技术方案：一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，试验所用的供试材料包括供试土样、供试菌株、供试烟草品种和供试培养基；所述供试土样是2021年5-8月从河南许昌襄城县、三门峡卢氏县、渑池县等烟田健康烟株根际采集根际土样，共82份；所述供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌b-9-1（fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌a-4-9(fusarium solani)，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种（烟草疫霉phytophthora nicotianae）、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉(thielaviopsis basicola)，烟草白绢病菌(sclerotium rolfsiii sacc)，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌(rhizoctonia solani)，鸢尾丝囊霉菌(aphanomyces iridis)及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌(botryosphaeria dothide)，上述病原菌均由河南省农业科学院烟草研究所提供；所述供试烟草品种为中烟100；所述供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）、马铃薯葡萄糖液体培养基（pdb）、lb液体培养基。
16.具体的，实验步骤如下：a1、拮抗细菌分离纯化采用稀释涂布平板法，分别称取10g混匀的健康烟株根基土壤，放入250 ml无菌三角瓶中，加入90ml无菌水后置于摇床震荡10min，使土样均匀分散在稀释液中，为10-1土壤悬浮液，再进行梯度稀释，依次稀释至10-4、10-5和10-6，各吸取100l稀释液涂布与1/2 lb固体培养基上，28℃黑暗培养2d，挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落与新的lb固体培养基上进行划线纯化后，所得菌株斜面保存备用；a2、拮抗细菌的筛选采用平板对峙法（宋光桃等，2010），以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌；用接针将分离到的细菌上下平行划线接种于距培养皿中心2.5cm处的pda培养皿两边，28℃培养24h后，取培养5d的靶标病原菌，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于接有细菌的pda平板中央，以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照，置于28℃培养箱中恒温培养；待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量处理组抑菌带宽度，计算抑菌率，每个处理
3次重复；抑菌率=(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径
×
100%；a3、拮抗细菌的抑菌谱测定采用平板对峙培养法（宋光桃等，2010）略有改动（平行划线改为对称点接种），进行生防菌株对8种常见烟草病原真菌抑菌试验，每个处理3次重复；a4、拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定参照姚晨虓等（2021）的培养皿滤纸保湿法，将中烟100裸种依次用75%的乙醇和0.5%的次氯酸钠消毒30s，无菌水漂洗干净后放入拮抗细菌悬浮液（浓度为1
×
109cfu/ml）中浸种3h，再用无菌水漂洗3-4次后，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间的消毒种子作为对照，每皿25粒种子（5
×
5），重复3次，第10天测量统计种子萌发率及烟苗根长，计算增长率；增长率=(处理组根系长度-对照组根系长度)/对照组根系长度
×
100%；a5、拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定拮抗菌发酵滤液的制备：将lb斜面保存菌株接1环于盛有150ml lb液体培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h得到菌液原液；将上述培养得到的菌液经12000r/min离心10 min，留上清液，用细菌过滤器（22μm）除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液；拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用：收集病原菌分生孢子，将孢子浓度调至1
×
107孢子/ml，分别与4株拮抗菌株发酵滤液等体积混合，25℃共培养24h，在光学显微镜下观察孢子萌发情况，无菌lb液体培养基滤液处理为对照，每个处理重复3次；a6、拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定参照杨艺炜等（2018）的方法，测定生防菌株挥发性物质对靶标菌的抑制活性，在活化的靶标菌边缘上取直径5mm菌块置于新的pda平板中央，用接菌环在lb平板上化满生防细菌菌株，将前者反口与后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以空白的lb平板做对照，每个处理重复3次，28℃黑暗培养7d，测定对照和处理的靶标菌菌落直径，并计算相对抑菌率；a7、拮抗细菌的鉴定参考千慧敏（2020）等方法进行16s rdna基因序列pcr扩增，以待测菌株基因组dna为模板，用通用引物27f和1492r扩增待测细菌的16s rdna序列，引物表见说明书附图4；pcr反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，pcr扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的目标片段连接到pmd-19t vector上，含目的片段的单克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序；应用ncbi进行序列比对分析，采用mega7.0软件的neighbor-joining法构建系统发育树；a8、拮抗菌抗生素合成基因检测将拮抗假单胞菌菌株接于lb液体培养基中，180 r/min振荡培养24h，取2ml菌液离心后留沉淀，用细菌dna提取试剂盒提取菌株dna；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成假单胞杆菌的dapg和pca合成基因的特异性引物，引物表见说明书附图4，pcr扩增后将特异性条带回收并克隆，送由生工测序，用ncbi blast比对分析dna序列；
a9、拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定挑选健康、饱满的中烟100种子，漂浮育苗法培养至大十字期（3-4片真叶），用无菌镊子轻轻挑出大小一致的健壮烟苗，无菌轻轻水涮洗掉烟苗根部基质，将烟苗根部浸泡于浓度为 1
×
109cfu/ml的拮抗细菌悬浮液中30min，移栽至装有无菌基质的灭菌花盆（85
×
70mm）中培养2d后，进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20ml，灌根结束后24h，在烟根周围接种预先培养好的带有靶标菌的麦粒，5g/每株，共设置3个对照组，对照组1无菌水侵泡烟苗接种靶标菌，对照组2拮抗菌悬浮液浸泡烟苗接种无菌麦粒，对照组3无菌水侵泡烟苗接种无菌麦粒，接靶标菌后48h，再次进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20ml，以等体积无菌水灌根处理对照1和3，每处理5株盆；培养第30d根据中华人民共和国国家标准（gb/t23222-2008）中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效；根据中华人民共和国烟草行业标准（yc/t142-2010）中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重，叶面积（m2）=0.6345
×
叶长（cm）
×
叶宽（cm）；病情指数=(σ（病级数
×
该病级植株数）)/(最大病级数
×
植株总数)
×
100%；防治效果=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100%；a10、数据统计与分析数据处理采用excel和dps7.05软件分析，方差分析采用duncan新复极差法。
17.具体的，实验结果如下：b1、生防菌株的分离筛选通过平板对峙法筛选得到拮抗作用较好的细菌菌株yx33，该菌株离自河南卢氏县烟区健株根际土壤；由平板对峙法结果可知，该菌株对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的平均防效都在57%以上，具体数据见说明书附图5；其中，表中数据为3次重复的平均值；同列数据后的不同小写字母表示差异显著（p《0.05）；b2、生防菌株抑菌谱测定利用平板对峙法对菌株yx33的抑菌谱进行了测定，测定结果显示，该菌株对供试的8种烟草根茎类病害病原菌均有不同程度的抑制作用，具体数据见说明书附图6，生防菌株对茄病镰刀菌的平均抑菌率均大于80%，对烟草疫霉菌、鸢尾丝囊霉菌、葡萄坐腔球菌的抑菌率均大于60%，对烟草尖孢镰刀菌、白绢病菌、立枯丝核菌和烟草根串珠霉的的抑制效果都达到了50%以上；b3、拮抗菌株对烟草种子促生作用测定试验结果如说明书附图7所示， 4拮抗菌株yx33悬浮液处理过的种子发芽后烟苗根系较对照组显著增长，yx33处理组烟苗根系增长率达到了133.93%；；b4、拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定试验结果表明，拮抗菌株发酵滤液能抑制病原菌孢子萌发，lb液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45%以上，拮抗菌发酵滤液处理孢子萌发率仅有6%-8%，见说明书附图5；b5、拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定
测定结果如说明书附图9显示，拮抗菌株挥发性化合物对茄病镰刀菌的抑菌效率为25.07%，且影响菌落形态，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，显微观察有孢子产生，拮抗菌处理菌株气生菌丝丰富浓密，菌落中心凸起，菌落边缘不整齐、菌丝相互交织，显微观察无孢子；拮抗菌yx33产生的voc对尖孢镰刀菌的抑菌率仅有3.32
±
0.67%，但对尖孢镰刀菌菌落形态有较大影响，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，菌落表面有白色粉样组织，背面培养基中有粉色色素产生，yx33处理菌株菌落边缘整齐，菌丝纯白色，菌落中央有青绿色色素产生，拮抗菌挥发性有机化合物抑菌活性测定情况见图1；b6、拮抗细菌的鉴定blast结果如图2所显示，菌株yx33与绿针假单胞菌（pseudomonas chlororaphis）x8（mw786769.1）等的序列相似性达到97%，且位于统一分支，因此鉴定yx3为绿针假单胞菌；b7、拮抗菌抗生素合成基因检测序列扩增结果如图3所示，菌株yx33可以扩增到600bp左右的特异性条带，经测序，yx33得到569bp的序列，ncbi数据库blast结果显示，yx33 pca合成相关基因（om719879）序列与pseudomonas aeruginosa stain pa2101 phzg2（mn044391.1）和pseudomonas aeruginosa strain pa1201 phzg2（kx180138.1）基因的相似性均为98.25%，该菌株均未扩增出dapg相关基因片段；b8、拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定盆栽防效试验结果见说明书附图10，生防菌株yx33对烟草尖孢镰刀菌根腐病有显著防治效果，能显著降低烟草镰刀菌根腐病的发病率和病情指数，该菌株对烟草尖孢镰刀菌根腐病的平均防效为79.93%，对茄病镰刀菌的防效偏低，为17.33%；盆栽促生实验结果如说明书附图11所示，生防菌处理烟株有效叶片数与对照组无显著差异，在最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积等农艺性状指标上均较对照有显著的促进作用，生防菌株处理烟株最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积和总根体积较对照分别提高了142.00%、177.23%、542.86%、74.54%、22.28%和380%。
18.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，其特征在于：试验所用的供试材料包括供试土样、供试菌株、供试烟草品种和供试培养基；所述供试土样是2021年5-8月从河南许昌襄城县、三门峡卢氏县、渑池县等烟田健康烟株根际采集根际土样，共82份；所述供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌b-9-1（fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌a-4-9(fusarium solani)，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种（烟草疫霉phytophthora nicotianae）、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉(thielaviopsis basicola)，烟草白绢病菌(sclerotium rolfsiii sacc)，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌(rhizoctonia solani)，鸢尾丝囊霉菌(aphanomyces iridis)及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌(botryosphaeria dothide)，上述病原菌均由河南省农业科学院烟草研究所提供；所述供试烟草品种为中烟100；所述供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）、马铃薯葡萄糖液体培养基（pdb）、lb液体培养基。2.根据权利要求1所述的一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，其特征在于：实验步骤如下：a1、拮抗细菌分离纯化采用稀释涂布平板法，分别称取10g混匀的健康烟株根基土壤，放入250 ml无菌三角瓶中，加入90ml无菌水后置于摇床震荡10min，使土样均匀分散在稀释液中，为10-1土壤悬浮液，再进行梯度稀释，依次稀释至10-4、10-5和10-6，各吸取100l稀释液涂布与1/2 lb固体培养基上，28℃黑暗培养2d，挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落与新的lb固体培养基上进行划线纯化后，所得菌株斜面保存备用；a2、拮抗细菌的筛选采用平板对峙法（宋光桃等，2010），以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌；用接针将分离到的细菌上下平行划线接种于距培养皿中心2.5cm处的pda培养皿两边，28℃培养24h后，取培养5d的靶标病原菌，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于接有细菌的pda平板中央，以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照，置于28℃培养箱中恒温培养；待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量处理组抑菌带宽度，计算抑菌率，每个处理3次重复；抑菌率=(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径
×
100%；a3、拮抗细菌的抑菌谱测定采用平板对峙培养法（宋光桃等，2010）略有改动（平行划线改为对称点接种），进行生防菌株对8种常见烟草病原真菌抑菌试验，每个处理3次重复；a4、拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定参照姚晨虓等（2021）的培养皿滤纸保湿法，将中烟100裸种依次用75%的乙醇和0.5%的次氯酸钠消毒30s，无菌水漂洗干净后放入拮抗细菌悬浮液（浓度为1
×
109cfu/ml）中浸种3h，再用无菌水漂洗3-4次后，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无
菌水浸泡同等时间的消毒种子作为对照，每皿25粒种子（5
×
5），重复3次，第10天测量统计种子萌发率及烟苗根长，计算增长率；增长率=(处理组根系长度-对照组根系长度)/对照组根系长度
×
100%；a5、拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定拮抗菌发酵滤液的制备：将lb斜面保存菌株接1环于盛有150ml lb液体培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h得到菌液原液；将上述培养得到的菌液经12000r/min离心10 min，留上清液，用细菌过滤器（22μm）除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液；拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用：收集病原菌分生孢子，将孢子浓度调至1
×
107孢子/ml，分别与4株拮抗菌株发酵滤液等体积混合，25℃共培养24h，在光学显微镜下观察孢子萌发情况，无菌lb液体培养基滤液处理为对照，每个处理重复3次；a6、拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定参照杨艺炜等（2018）的方法，测定生防菌株挥发性物质对靶标菌的抑制活性，在活化的靶标菌边缘上取直径5mm菌块置于新的pda平板中央，用接菌环在lb平板上化满生防细菌菌株，将前者反口与后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以空白的lb平板做对照，每个处理重复3次，28℃黑暗培养7d，测定对照和处理的靶标菌菌落直径，并计算相对抑菌率；a7、拮抗细菌的鉴定参考千慧敏（2020）等方法进行16s rdna基因序列pcr扩增，以待测菌株基因组dna为模板，用通用引物27f和1492r扩增待测细菌的16s rdna序列，引物表见说明书附图4；pcr反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，pcr扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的目标片段连接到pmd-19t vector上，含目的片段的单克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序；应用ncbi进行序列比对分析，采用mega7.0软件的neighbor-joining法构建系统发育树；a8、拮抗菌抗生素合成基因检测将拮抗假单胞菌菌株接于lb液体培养基中，180 r/min振荡培养24h，取2ml菌液离心后留沉淀，用细菌dna提取试剂盒提取菌株dna；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成假单胞杆菌的dapg和pca合成基因的特异性引物，引物表见说明书附图4，pcr扩增后将特异性条带回收并克隆，送由生工测序，用ncbi blast比对分析dna序列；a9、拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定挑选健康、饱满的中烟100种子，漂浮育苗法培养至大十字期（3-4片真叶），用无菌镊子轻轻挑出大小一致的健壮烟苗，无菌轻轻水涮洗掉烟苗根部基质，将烟苗根部浸泡于浓度为 1
×
109cfu/ml的拮抗细菌悬浮液中30min，移栽至装有无菌基质的灭菌花盆（85
×
70mm）中培养2d后，进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20ml，灌根结束后24h，在烟根周围接种预先培养好的带有靶标菌的麦粒，5g/每株，共设置3个对照组，对照组1无菌水侵泡烟苗接种靶标菌，对照组2拮抗菌悬浮液浸泡烟苗接种无菌麦粒，对照组3无菌水侵泡烟苗接种无菌麦粒，接靶标菌后48h，再次进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20ml，以等体积无菌水灌根处理对照1和3，每处理5株盆；
培养第30d根据中华人民共和国国家标准（gb/t23222-2008）中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效；根据中华人民共和国烟草行业标准（yc/t142-2010）中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重，叶面积（m2）=0.6345
×
叶长（cm）
×
叶宽（cm）；病情指数=(σ（病级数
×
该病级植株数）)/(最大病级数
×
植株总数)
×
100%；防治效果=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100%；a10、数据统计与分析数据处理采用excel和dps7.05软件分析，方差分析采用duncan新复极差法。3.根据权利要求2所述的一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，其特征在于：实验结果如下：b1、生防菌株的分离筛选通过平板对峙法筛选得到拮抗作用较好的细菌菌株yx33，该菌株离自河南卢氏县烟区健株根际土壤；由平板对峙法结果可知，该菌株对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的平均防效都在57%以上，具体数据见说明书附图5；其中，表中数据为3次重复的平均值；同列数据后的不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；b2、生防菌株抑菌谱测定利用平板对峙法对菌株yx33的抑菌谱进行了测定，测定结果显示，该菌株对供试的8种烟草根茎类病害病原菌均有不同程度的抑制作用，具体数据见说明书附图6，生防菌株对茄病镰刀菌的平均抑菌率均大于80%，对烟草疫霉菌、鸢尾丝囊霉菌、葡萄坐腔球菌的抑菌率均大于60%，对烟草尖孢镰刀菌、白绢病菌、立枯丝核菌和烟草根串珠霉的的抑制效果都达到了50%以上；b3、拮抗菌株对烟草种子促生作用测定试验结果如说明书附图7所示， 4拮抗菌株yx33悬浮液处理过的种子发芽后烟苗根系较对照组显著增长，yx33处理组烟苗根系增长率达到了133.93%；；b4、拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定试验结果表明，拮抗菌株发酵滤液能抑制病原菌孢子萌发，lb液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45%以上，拮抗菌发酵滤液处理孢子萌发率仅有6%-8%，见说明书附图5；b5、拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定测定结果如说明书附图9显示，拮抗菌株挥发性化合物对茄病镰刀菌的抑菌效率为25.07%，且影响菌落形态，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，显微观察有孢子产生，拮抗菌处理菌株气生菌丝丰富浓密，菌落中心凸起，菌落边缘不整齐、菌丝相互交织，显微观察无孢子；拮抗菌yx33产生的voc对尖孢镰刀菌的抑菌率仅有3.32
±
0.67%，但对尖孢镰刀菌菌落形态有较大影响，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，菌落表面有白色粉样组织，背面培养基中有粉色色素产生，yx33处理菌株菌落边缘整齐，菌丝纯白色，菌落中央有青绿色色素产生，拮抗菌挥发性有机化合物抑菌活性测定情况见图1；b6、拮抗细菌的鉴定blast结果如图2所显示，菌株yx33与绿针假单胞菌（pseudomonas chlororaphis）x8
（mw786769.1）等的序列相似性达到97%，且位于统一分支，因此鉴定yx3为绿针假单胞菌；b7、拮抗菌抗生素合成基因检测序列扩增结果如图3所示，菌株yx33可以扩增到600bp左右的特异性条带，经测序，yx33得到569bp的序列，ncbi数据库blast结果显示，yx33 pca合成相关基因（om719879）序列与pseudomonas aeruginosa stain pa2101 phzg2（mn044391.1）和pseudomonas aeruginosa strain pa1201 phzg2（kx180138.1）基因的相似性均为98.25%，该菌株均未扩增出dapg相关基因片段；b8、拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定盆栽防效试验结果见说明书附图10，生防菌株yx33对烟草尖孢镰刀菌根腐病有显著防治效果，能显著降低烟草镰刀菌根腐病的发病率和病情指数，该菌株对烟草尖孢镰刀菌根腐病的平均防效为79.93%，对茄病镰刀菌的防效偏低，为17.33%；盆栽促生实验结果如说明书附图11所示，生防菌处理烟株有效叶片数与对照组无显著差异，在最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积等农艺性状指标上均较对照有显著的促进作用，生防菌株处理烟株最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积和总根体积较对照分别提高了142.00%、177.23%、542.86%、74.54%、22.28%和380%。
技术总结本发明属于烟草病害防治技术领域，具体为一株绿针假单胞菌YX33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，试验所用的供试材料包括供试土样、供试菌株、供试烟草品种和供试培养基；本发明公开一种对烟草镰刀菌根腐病原具有明显拮抗效果的绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）YZ33，并对其抑菌机理和促生特性进行了初步分析，该菌株对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，主要通过菌体产生的抗生素抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌产生较强的抑菌效果，且可促进烟株生长发育，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。应用奠定基础。应用奠定基础。
技术研发人员：邱睿 陈玉国 牛莉莉 李小杰 白静科 李成军 赵均 李淑君 徐敏 何雷 刘东升 何晓冰 苗圃 杨晋燕
受保护的技术使用者：河南省农业科学院烟草研究所
技术研发日：2022.04.11
技术公布日：2022/7/5
