贝利司他或其药学上可接受的盐在制备治疗感染的药物中的用途

1.本发明涉及医药领域。特别地，本发明涉及贝利司他或其药学上可接受的盐在制备治疗感染的药物中的用途。


背景技术：

2.贝利司他于2014年7月3日获fda批准上市，用于治疗外周t细胞淋巴瘤(ptcl)。目前，贝利司他还被尝试用于治疗其他肿瘤。贝利司他(n-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺)具有如下的化学结构式：
[0003][0004]
感染，例如细菌感染，严重危害人类健康。虽然抗生素可以有效治疗很多细菌感染，但具有耐药性甚至多重耐药性的细菌不断出现，令原本有效的抗生素变为无效。例如，枯草芽孢杆菌耐受磺胺二甲嘧啶和土霉素；金黄色葡萄球菌耐受很多青霉素类和头孢类抗生素。具有耐药性甚至多重耐药性的细菌感染已经成为影响人类健康的一大威胁。
[0005]
临床上对于能够治疗感染、尤其是能够杀灭耐药性/多重耐药性细菌的药物存在巨大需求。


技术实现要素：

[0006]
本领域已知，噬菌体，作为细菌病毒，能特异感染和裂解宿主菌。本发明发明人经深入研究、反复试验后发现，表达gp46蛋白的噬菌体能够占据细菌hu蛋白的dna结合区域，从而通过抑制hu蛋白与细菌dna结合而阻断hu蛋白参与细菌dna复制，最终导致细菌死亡。通过对gp46-hu蛋白结合位点的研究，发明人确定了细菌hu蛋白第71位的异亮氨酸(ile)不仅参与hu蛋白与gp46蛋白反应，也是hu蛋白与dna结合的关键位点。发明人还发现，贝利司他能够结合耐药性细菌hu蛋白、尤其是能够结合hu蛋白第71位的异亮氨酸(ile)，进而能够杀灭细菌(包括超级细菌)。
[0007]
本发明人借助计算机软件对drugbank药物数据库中的药物候选区域进行分子动力学模拟计算，筛选候选药物。发现贝利司他及其药学上可接受的盐可以与细菌的hu蛋白第71位的异亮氨酸实现高结合活性。从而通过抑制hu蛋白与细菌dna结合而阻断hu蛋白参与细菌dna复制，最终导致细菌死亡。
[0008]
发明人还发现，hu蛋白是细菌中高度保守的蛋白。在其他正常细菌和临床上常见的突变率非常高的耐药菌中，如结核杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等重要的临床致病细菌，该关键氨基酸位点也得到了完整的保留。因此针对该位点的药物具有广谱抗菌性能且对耐药菌有效。对于耐药性细菌/多重耐药性细菌，贝利司他同样可以以高结合活性结
合hu蛋白(例如第71位的异亮氨酸(ile))，因此贝利司他对超级细菌仍有较强的抑制作用，具有良好的杀菌效果。
[0009]
发明人发现，贝利司他或其药学上可接受的盐的最低抑菌浓度(mic，minimum inhibitory concentration)为小于等于约100μm、小于等于约50μm、小于等于约10μm(例如9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm、)、优选小于等于约1μm(例如小于等于0.9μm、0.8μm、0.7μm、0.6μm、0.5μm、0.4μm、0.3μm、0.2μm、0.1μm)、更优选小于等于0.1μm(例如小于等于0.09μm、0.08μm、0.07μm、0.06μm、0.05μm、0.04μm、0.03μm、0.02μm、0.01μm)。
[0010]
本发明提供一种贝利司他或其药学上可接受的盐在制备治疗感染的药物中的用途。本发明发现了贝利司他或其药学上可接受的盐可以用于以治疗感染(例如，细菌(包括超级细菌)感染)。本发明首次证实，贝利司他或其药学上可接受的盐对细菌(包括超级细菌)具有显著的抑制效果。
[0011]
本发明还提供一种药物组合物，其包含贝利司他或其药学上可接受的盐和任选地包含药学上可接受的载体。
附图说明
[0012]
图1示出了多个细菌hu蛋白完整序列的序列比对结果。
[0013]
图2示出了多个细菌hu蛋白第71位异亮氨酸附近的序列比对结果。
[0014]
图3示出了图1～2中相关细菌中hu蛋白的genbank编号。
[0015]
图4示出了不同情况下枯草芽孢杆菌的形态以及视野内拟核正常的细胞数占总细胞数的百分比。
[0016]
图5示出了计算机辅助筛选、确定候选药物的原理图。
[0017]
图6示出了通过核磁titration实验证明贝利司他与hu蛋白能够结合。
[0018]
图7示出了通过waterlogsy实验验证hu蛋白第71位异亮氨酸是该蛋白与贝利司他和相互作用的关键位点，图中所示“x”代表贝利司他。
[0019]
图8示出了枯草芽孢杆菌在不同贝利司他浓度下的生长曲线。
[0020]
图9示出了贝利司他对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌形态的影响。图9a1示出了枯草芽孢杆菌(b.subtillis)未经贝利司他(x)处理和经贝利司他(x)处理后dapi染色的情况。图9a2分别示出了不同放大倍数(具体分别为10000倍和50000倍)下枯草芽孢杆菌未经贝利司他处理(即control组)和经贝利司他(即treated组)处理后的透射电镜图像。图9b1示出了金黄色葡萄球菌(s.aureus)未经贝利司他(x)处理和经贝利司他(x)处理后dapi染色情况。图9b2分别示出了不同放大倍数(具体分别为10000倍和50000倍)下金黄色葡萄球菌未经贝利司他处理(即control组)和经贝利司他(即treated组)处理后的透射电镜图像。
[0021]
图10示出了各组小鼠皮肤细菌感染情况。图10a～d分别为空白对照组、高浓度贝利司他给药组、低浓度贝利司他给药组和夫西地酸给药组。
[0022]
图11示出了感染创面活菌量统计学处理。
[0023]
发明详述
[0024]
在一个方面，本发明提供一种贝利司他或其药学上可接受的盐在制备治疗感染的药物中的用途，所述药物任选的包含药学上可接受的载体。在另一个方面，本发明提供一种贝利司他或其药学上可接受的盐，用于治疗感染。在还有另一个方面，本发明提供一种治疗
感染的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的贝利司他或其药学上可接受的盐。
[0025]
本发明所述感染包括但不限于：皮肤感染、胃肠道感染、泌尿道感染、生殖-泌尿道感染、呼吸道感染、窦感染、中耳感染、全身感染、伤口感染、中枢神经感染、腹内感染、肾盂肾炎、肺炎、细菌性阴道炎、链球菌性咽喉痛、慢性细菌性前列腺炎、妇科及骨盆感染、性传播性细菌疾病、眼部和耳部感染。本发明所述感染可以是细菌性、真菌性、寄生虫性和病毒性感染。
[0026]
在一个实施方案中，感染为呼吸道感染。在一个具体的方面，呼吸道感染为社区获得性细菌性肺炎(cabp)。在一个更具体的实施方案中，呼吸道感染例如cabp是由选自下述的细菌引起的：金黄色葡萄球菌(s.aureus)、肺炎链球菌(s.pneumoniae)、化脓性链球菌(s.pyogenes)、流感嗜血杆菌(h.influenza)、卡他莫拉菌(m.catarrhalis)和嗜肺性军团病杆菌(legionella pneumophila)。
[0027]
在另一个实施方案中，感染为皮肤感染。在一个具体的方面，皮肤感染为急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(absssi)。在一个更具体的实施方案中，皮肤感染例如absssi是由选自下述的细菌引起的：金黄色葡萄球菌、cons、化脓性链球菌、无乳链球菌(s.agalactiae)、粪肠球菌(e.faecalis)和屎肠球菌(e.faecium)。
[0028]
在一个实施方案中，感染可以由细菌(例如厌氧菌或需氧菌)引起。
[0029]
在另一个实施方案中，感染是由革兰氏阳性细菌引起。在该实施方案的一个具体的方面，感染是由选自下述的革兰氏阳性细菌引起的：杆菌纲(bacilli)，包括，但不限于：葡萄球菌属(staphylococcus spp.)、肠球菌属(enterococcus spp.)、杆菌属(bacillus spp.)、李斯特菌属(listeria spp.)；放线菌门(phylum actinobacteria)，包括，但不限于丙酸菌属(propionibacterium spp.)、棒状杆菌属(corynebacterium spp.)、奴卡氏菌属(nocardia spp.)、放线菌属(actinobacteria spp.)和梭菌纲，包括，但不限于梭菌属(clostridium spp.)。
[0030]
在另一个实施方案中，感染是由选自下述的革兰氏阳性菌引起的：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌和屎肠球菌。
[0031]
在另一个实施方案中，感染是由革兰氏阴性细菌引起。在该实施方案的一个方面中，感染是由下述细菌引起：变形杆菌纲(proteobacteria)(例如β变形杆菌纲(betaproteobacteria)和γ变形杆菌纲(gammaproteobacteria))，包括大肠杆菌(escherichia coli)、沙氏杆菌(salmonella)、志贺氏菌(shigella)、其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)、假单胞杆菌属(pseudomonas)、莫拉氏菌属(moraxella)、螺旋杆菌属(helicobacter)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、蛭弧菌属(bdellovibrio)、乙酸菌(acetic acid bacteria)、军团菌属(legionella)；或α-变形杆菌纲，比如沃尔巴克氏体(wolbachia)。在另一个方面，感染是由选自蓝细菌、螺旋菌、绿硫细菌或绿非硫细菌的革兰氏阴性细菌引起。在该实施方案的一个具体的方面，感染是由选自下述的革兰氏阴性细菌所引起：肠杆菌科(enterobactericeae)(例如大肠杆菌(e.coli)、肺炎克雷白杆菌(klebsiella pneumoniae)，包括含有超广谱β-内酰胺酶及/或碳青霉烯酶的大肠杆菌及肺炎克雷白杆菌)、拟杆菌科(bacteroidaceae)(例如脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis))、弧菌科(vibrionaceae)(霍乱弧菌(vibrio cholerae))、巴斯德氏菌科(pasteurellae)(例如流感嗜血杆菌(haemophilus influenza))、假单胞菌科(pseudomonadaceae)(例如绿脓
杆菌pseudomonas aeruginosa))、奈瑟氏球菌科(neisseriaceae)(例如脑膜炎球菌(neisseria meningitidis))、立克次体(rickettsiae)、莫拉菌科(moraxellaceae)(例如粘膜炎莫拉菌(moraxella catarrhalis))、变形杆菌科(proteeae)的任何物种、不动菌属(acinetobacter spp.)、螺旋杆菌属(helicobacter spp.)及曲杆菌属(campylobacter spp.)。在一个具体的实施方案中，感染是由选自由肠杆菌科(例如大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌)、假单胞杆菌属及不动菌属的革兰氏阴性菌引起。在另一个实施方案中，感染是由选自下述的生物体引起：肺炎克雷白杆菌(k.pneumoniae)、沙氏杆菌属(salmonella)、希拉肠球菌(e.hirae)、鲍曼不动菌(a.baumanii)、卡他莫拉菌(m.catarrhalis)、流感嗜血杆菌(h.influenzae)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)、屎肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及粪肠球菌。
[0032]
在另一个实施方案中，感染是由选自流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和嗜肺性军团病杆菌的革兰氏阴性菌引起。
[0033]
在一个实施方案中，感染是由枯草芽孢杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌组成的组中的一种或多种引起。
[0034]
在另一个实施方案中，感染是由炭疽杆菌(bacillus anthracis)(炭疽)、鼠疫耶氏菌(yersinia pestis)(鼠疫)、肉毒杆菌(clostridium botulinum)(肉毒中毒)或土拉热弗朗西丝氏菌(francisella tularensis)(兔热病)。可以使用贝利司他或其药学上可接受的盐治疗的另外的感染包括，但不限于炭疽、肉毒中毒、腺鼠疫和兔热病。
[0035]
在一个实施方案中，感染是由对一种或多种抗生素具有耐药性的生物体(如细菌)引起。
[0036]
在另一个实施方案中，感染是由对四环素或第一和第二代四环素抗生素的任何成员(例如多西环素或二甲胺四环素)具有耐药性的生物体引起。
[0037]
在另一个实施方案中，感染是由对甲氧西林具有耐药性的生物体引起。
[0038]
在另一个实施方案中，感染是由对万古霉素具有耐药性的生物体引起。
[0039]
在另一个实施方案中，感染是由对喹诺酮或氟喹诺酮具有耐药性的生物体引起。
[0040]
在另一个实施方案中，感染是由对替加环素(tigecycline)或任何其它四环素衍生物具有耐药性的生物体引起。在一个具体实施方式中，感染是由对替加环素具有耐药性的生物体引起。
[0041]
在另一个实施方案中，感染是由对β-内酰胺或头孢菌素抗生素具有耐药性的生物体或对青霉烯类或碳青霉烯类具有耐药性的生物体引起。
[0042]
在另一个实施方案中，感染是由对大环内酯、林可酰胺(lincosamides)、链霉杀阳菌素抗生素、噁唑烷酮和截短侧耳素具有耐药性的生物体引起。
[0043]
在另一个实施方案中，感染是由多药-耐药性病原体(对任何两种或多种抗生素具有中度或完全抗性)引起。
[0044]
本发明所述生物体可以是细菌、真菌、病毒等。
[0045]
在一个实施方式中，本发明所述感染的实例包括，但不限于腹内感染(通常是革兰氏阴性菌种如大肠杆菌和厌氧菌如脆弱拟杆菌的混合物)、糖尿病足(链球菌、沙雷氏菌属、葡萄球菌和肠球菌属、厌氧菌的各种组合(s.e.dowd等人，plos one 2008；3：e3326，将其全部教导通过引用并入本文)和呼吸系统疾病(特别是患有如囊性纤维化的慢性感染的患者
中的呼吸系统疾病-例如金黄色葡萄球菌加绿脓杆菌或流感嗜血杆菌、非典型性病原体)、创伤和脓肿(各种革兰氏阴性和革兰氏阳性菌，特别是mssa/mrsa、凝固酶-阴性葡萄球菌、肠道球菌、不动细菌属、绿脓杆菌(p.aeruginosa)、大肠杆菌、脆弱拟杆菌)、和血流感染(13％为多种微生物感染(h.wisplinghoff等人，clin.infect.dis.2004；39：311-317，将其全部教导通过引用并入本文))。
[0046]
贝利司他能够与多种酸或碱反应形成盐。通常用于形成酸性盐的酸是无机酸，如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，和有机酸如对甲苯磺酸、甲烷磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠椽酸、苯甲酸、乙酸等。这些盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁烯-1,4-二酸盐、己烯-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯二甲酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。碱性盐可由无机碱生成，例如铵、碱金属或碱土金属的氢氧化物，碳酸盐，重碳酸盐等等。下述碱性物质常用来生成碱性盐，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、碳酸钾等等。这些盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等。
[0047]
本发明还提供一种药物组合物，包含贝利司他或其药学上可接受的盐、以及任选地药学上可接受载体。本发明所述药物组合物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、悬浮液、溶液、分散剂、用于口服或非口服给药的缓释制剂、静脉注射制剂、皮下注射制剂、吸入制剂、透皮制剂、直肠或阴道栓剂。
[0048]
本发明所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受载体，本发明的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。
[0049]
制备各种含有各种比例活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如remington’s pharmaceutical sciences,martin,e.w.,ed.,mack publishing company,19th ed.(1995)所述。制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。以已知的方法制造本发明所述药物组合物，包括常规的混合、溶解或冻干方法。
[0050]
在本发明所述药物组合物中，活性成分的比例可以变化，可占给定的单位剂型重量的大约0.01％至大约99％。在这种治疗有用的药物组合物制剂中，活性成分的量使得能够获得有效剂量水平。
[0051]
本发明所述的片剂、胶囊剂等可以包含：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香味。当单位剂型是胶囊时，除了上面类型的材料，它还可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在，作为包衣，或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆可以包含活性成分，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂(如樱桃香料或桔子香料)。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可以接受的且以应用的量为无毒。此外，活性成分可以掺入缓释制剂和缓释装置中。
[0052]
活性成分也可以通过输注或注射到静脉内或腹膜内施用。可以制备活性成分或其盐的水溶液，任选可混和无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
[0053]
适于注射或输注的药物组合物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散剂的即时制剂的活性成分(任选封装在脂质体中)的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在所有情况下，最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液体分散介质，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以维持合适的流动性，例如，通过脂质体的形成，通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小，或通过表面活性剂的使用。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、缓冲剂或氯化钠。通过使用延缓吸收剂的组合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以产生可注射的组合物的延长吸收。
[0054]
通过将合适的溶剂中的需要量的活性成分与需要的上面列举的各种其他成分结合，然后进行过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这会产生活性成分加上任何另外需要的无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。
[0055]
有用的固体载体包括粉碎的固体(如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等)。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本发明的药物组合物可以任选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。可以加入佐剂(如香味)和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。
[0056]
增稠剂(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料)也可和液体载体用于形成可涂覆的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接用于使用者的皮肤上。
[0057]
活性成分的治疗有效量，不仅取决于选择的特定的盐，而且取决于施药方式、待治疗的疾病的性质和患者的年龄和状态，最终取决于在场医师或临床医生的决定。
[0058]
上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元，适
于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂。根据所涉及的具体治疗，活性成分的单位剂量的量可以在大约0.01到大约1000毫克或更多之间进行变化或调整。
[0059]
本发明使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
[0060]
在一种实施方式中，本发明所述生物体是具有耐药性的细菌，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa)。
[0061]
在一种实施方式中，本发明所述感染为由选自枯草芽孢杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌组成的组中的一种或多种细菌引起的感染。
[0062]
在一种实施方式中，本发明所述感染为呼吸道感染、伤口感染、泌尿道感染或中枢神经感染。
[0063]
在还有一种实施方式中，本发明提供一种贝利司他或其药学上可接受的盐在制备hu蛋白抑制剂中的用途。优选地，贝利司他或其药学上可接受的盐能够与生物体hu蛋白的第71位的异亮氨酸结合。
[0064]
在还有一种实施方式中，本发明提供gp46蛋白(例如噬菌体gp46蛋白)在制备hu蛋白抑制剂中的用途。特别地，发明人发现，gp46蛋白能够占据细菌hu蛋白的dna结合区域，从而通过抑制hu蛋白与细菌dna结合而阻断hu蛋白参与细菌dna复制，最终导致细菌死亡。通过对gp46-hu蛋白结合位点的研究，发明人确定了细菌hu蛋白第71位的异亮氨酸(ile)不仅参与hu蛋白与gp46蛋白反应，也是hu蛋白与dna结合的关键位点。发明人还发现，贝利司他能够结合耐药性细菌hu蛋白、尤其是能够结合hu蛋白第71位的异亮氨酸(ile)，进而能够杀灭细菌(包括超级细菌)。发明人发现，在其他正常细菌和临床上常见的突变率非常高的耐药菌中，如结核杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等重要的临床致病细菌，该关键氨基酸位点也得到了完整的保留。因此针对该位点的药物具有广谱抗菌性能且对耐药菌有效。
[0065]
在还有一种实施方式中，本发明所述细菌具有多重耐药性。
[0066]
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大于5％的上限的范围内的数字数值。
[0067]
术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
[0068]
术语“受试者”包括哺乳动物，哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
具体实施方式
[0069]
以下将参考附图详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0070]
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。
[0071]
以下实施例中所描述的实验方法，除另有说明外，均为常规方法；除非另有说明，软件、试剂和材料均为商业上可获得的。实施例中所述“x”代表贝利司他。
[0072]
实施例1：计算机辅助筛选、确定候选药物贝利司他
[0073]
(1)确定筛选候选药物的靶点区域
[0074]
通过对噬菌体gp46蛋白与hu蛋白结合位点的研究，确定了hu蛋白中的第71位的异亮氨酸是hu蛋白和gp46蛋白的结合位点之一。然后，本发明人对多种细菌的hu蛋白的完整序列进行比对(图1)，发现多种细菌的hu蛋白中第71位异亮氨酸高度保守(图2)。所述细菌的genbank序列号见图3。
[0075]
图4a和图4c均为hu蛋白未突变的正常枯草芽孢杆菌的形态，视野内拟核正常的细胞分别占总细胞的94.7％和98.8％。图4b为hu蛋白被抑制的情况下枯草芽孢杆菌的形态。图4d为hu蛋白中的第71位异亮氨酸突变为丙氨酸后枯草芽孢杆菌的形态。可以看出：相比于正常的枯草芽孢杆菌，将hu蛋白中的第71位氨基酸突变后细菌长度变长，部分细菌的拟核形态被破坏(图4d)，视野内拟核正常的细胞占总细胞的72.0％。将hu蛋白直接抑制后，细菌长度明显变长，且拟核形态正常的细菌大幅度减少，只占总细胞的4.2％(图4b)。这说明，hu蛋白对于细菌的正常生长十分关键，且hu蛋白71位的异亮氨酸是hu蛋白发挥作用的重要位点。因此，确定hu蛋白为候选药物的靶点。
[0076]
(2)vina大规模药物筛选、确定候选药物
[0077]
候选药物来自drugbank药物数据库，通过计算机软件vina，针对上述候选药物的靶点，进行分子动力学模拟计算(图5)。模拟得到的结果通过energy value排序，排名前10的药物作为候选药物。其中贝利司他排名第7，结合能为-4.9(kj/mol)，结合能力较强。
[0078]
实施例2：分子水平实验证明贝利司他和hu蛋白中第71位氨基酸的结合
[0079]
在分子水平，通过核磁titration和waterlogsy实验，验证了贝利司他与hu蛋白具有结合效应。将hu蛋白中的第71位的异亮氨酸(ile)突变为丙氨酸(ala)得到相应的突变体(下文称为“hu
i71a
蛋白”)，之后重复waterlogsy实验，药物与突变后的hu
i71a
蛋白的结合效应消失，证明了两者的关键结合位点在hu蛋白中的71位氨基酸。
[0080]
具体的实验步骤和实验结果如下：
[0081]
实验步骤
[0082]
称取适量的贝利司他(medchemexpress公司)将其溶解在dmso-d6(索莱宝科技有限公司)中，获得浓度为100mm的贝利司他原液，备用。取480μl含有10μm hu蛋白的溶液，加入20μld2o后混匀，将所得溶液转移到核磁共振管中，在布鲁克600mhz核磁共振谱仪(avance iii)上记录hu蛋白的hsqc谱图。取1μl贝利司他原液，加入上述核磁共振管中，混匀后再次记录hsqc谱图。
[0083]
取1μl上述贝利司他原液，加入479μl缓冲液(300mm nacl，50mm k2hpo4，ph 6.5)和20μld2o，混匀后将所得溶液转移到核磁共振管中备用。另取上述贝利司他原液1μl两份，分别加入适量的hu蛋白和hu
i71a
蛋白，再分别加入适量缓冲液和20μld2o，使得溶液总体积为
500μl且蛋白终浓度为10μm，混匀后将所得各溶液转移到核磁共振管中备用。将上述三管样品放入布鲁克600mhz核磁共振谱仪(avance iii)中，进行waterlogsy 1d nmr检测。
[0084]
实验结果
[0085]
实验结果如图6、图7所示。在图6中，hu蛋白的原始谱图为灰色，加入贝利司他后的谱图为黑色，在图7中可以看到相比于原始谱图，加入贝利司他后出现了峰迁移、峰强度变强等现象，说明贝利司他能够与hu蛋白结合。
[0086]
根据图7所示的结果可以看出：相比于贝利司他的原始waterlogsy谱图，贝利司他和hu蛋白混合后，部分来自贝利司他的峰发生了翻转成为负峰(2.6ppm、3.7ppm、8.5ppm处未翻转的正峰分别来自dmso和贝利司他未与hu蛋白结合的区域)，说明贝利司他与hu蛋白结合；当贝利司他和上述突变的hu
i71a
蛋白混合后，来自贝利司他的峰依然为正峰，谱图变化不大，说明贝利司他不能与突变后的hu蛋白反应，证明hu蛋白中第71位的异亮氨酸是和贝利司他作用的关键位点。
[0087]
实施例3：细胞水平实验证明贝利司他针对细菌的抑制作用
[0088]
实验前称取适量的贝利司他用dmso溶解，获得浓度为100mm的母液，用lb培养基将母液进行一定的稀释后，备用。本实施例中使用的枯草芽孢杆菌为atcc 23857株，金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌atcc baa-1761株。
[0089]
3.1枯草芽孢杆菌生长曲线测定
[0090]
实验步骤
[0091]
实验在96孔板上进行，设置4组药物处理组和1组空白对照组(即control组)，每组3个复孔。将lb培养基中培养的枯草芽孢杆菌(atcc23857株)菌液用lb培养基稀释至5
×
105cfu/ml，在96孔板的中间部位选择15个孔，每孔加入100μl稀释后的菌液，再加入100μl用lb培养基稀释的贝利司他溶液，使得4组药物处理组中的药物终浓度分别为100μm、200μm、400μm和500μm，空白对照组加入dmso和lb培养基，使得dmso终浓度为0.5％且反应体系体积与药物处理组的体积一致。37℃震荡培养24h。
[0092]
以600nm处的吸光值，作为培养液中的细菌浓度的指标，每3小时测定一次。最后以od
600
作为纵坐标，时间作为横坐标，绘制细菌生长曲线。
[0093]
实验结果
[0094]
如图8所示，不同浓度的贝利司他对枯草芽孢杆菌的生长均有一定的抑制作用。用200μm贝利司他处理后的菌液吸光度长期低于空白对照组的吸光度，表明贝利司他对细菌生长已经有了较强的抑制作用；用400μm和500μm贝利司他处理后，细菌的生长几乎被完全抑制。
[0095]
3.2细菌dapi染色及透射电镜观察
[0096]
实验步骤
[0097]
1)dapi染色
[0098]
实验在ep管中进行，设置1组药物处理组和1组空白对照组。将lb培养基中培养的枯草芽孢杆菌菌液用lb培养基稀释至5
×
105cfu/ml，取100μl稀释后的菌液，加入1.5ml ep管，再加入100μl用lb培养基稀释的贝利司他溶液，使药物终浓度为500μm，空白对照组加入dmso和lb培养基，使得dmso终浓度为0.5％且反应体系体积与药物处理组的一致，各组设置3个重复，37℃震荡培养4h。
[0099]
将经过贝利司他处理和空白对照组处理的枯草芽孢杆菌进行dapi染色：(1)离心收菌，去除上清，用1ml pbs重悬菌体漂洗后离心收菌，去除上清；(2)用100μl 4％多聚甲醛重悬菌体，室温固定10min；(3)离心收菌，去除上清，用1ml pbs重悬菌体漂洗后离心收菌，去除上清；(4)用100μl 0.05％triton x重悬菌体后室温透化10min；(5)离心收菌，去除上清，用1ml pbs重悬菌体漂洗后离心收菌，去除上清；(6)用10μl dapi染液重悬菌体，室温避光染色10min；(7)将染色好的菌液涂于载玻片，避光自然晾干后，在荧光显微镜下观察、拍照。
[0100]
参照上文对枯草芽孢杆菌进行dapi染色的操作步骤，将所述枯草芽孢杆菌替换为金黄色葡萄球菌(atcc baa-1761株)，对金黄色葡萄球菌进行dapi染色。
[0101]
2)透射电镜样品制备
[0102]
将lb培养基中培养的枯草芽孢杆菌菌液用lb培养基稀释至5
×
105cfu/ml，取2.5ml稀释后的菌液，加入15ml离心管，再加入2.5ml用lb培养基稀释的贝利司他溶液，使药物终浓度为500μm，空白对照组(即control组)加入25μl dmso和适量lb培养基，保证反应体系体积与药物处理组(即treated组)的一致，各组设置3个重复管。37℃震荡培养4h，离心收菌，去除上清后，分别用1ml/dl戊二醛4℃固定1h，pbs漂洗3次(每次10min)，再经饿酸固定，系列浓度丙酮+乙醇梯度脱水(每个浓度脱水10min)，环氧树脂包埋、超薄切片、铅铀电子染色后，进行透射电镜观察。上文所述系列浓度丙酮+乙醇梯度脱水(又称为“梯度乙醇-丙酮系列脱水法”)的具体操作为：先用浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇各脱水1次，再用1∶1液(100％无水丙酮∶100％无水乙醇)脱水1次，最后用100％无水丙酮脱水3次。对于金黄色葡萄球菌的处理方法同上。
[0103]
实验结果
[0104]
枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的dapi染色结果分别如图9a1和图9b1所示。可以看到枯草芽孢杆菌经贝利司他处理后荧光区域增长，说明细菌核区变长，细胞长度明显增加；金黄色葡萄球菌经贝利司他处理后荧光强度变弱，说明细菌核区弥散。
[0105]
在透射电镜下，也可以明显看到与对照组相比，经过贝利司他处理的枯草芽孢杆菌的长度出现了不同程度的伸长，拟核区分散在胞质多处(图9a2)；经过贝利司他处理的金黄色葡萄球菌的拟核区变得不明显，呈现松散状态(图9b2)。
[0106]
实验结果直接说明了贝利司他能够影响两种不同细菌拟核区的正常结构，进而抑制细菌的正常生长，表明贝利司他具有一定的广谱抗菌能力。
[0107]
实施例4：动物实验证明贝利司他对皮肤细菌感染的治疗作用
[0108]
在上述分子实验和细胞实验的基础上，进一步在动物实验中验证贝利司他对细菌感染的抑制和治疗作用。
[0109]
(1)实验材料
[0110]
医用胶带；3％水合氯醛；生理盐水；0.1μm贝利司他和100μm贝利司他(溶剂均为10％甘油)；市售夫西地酸软膏(含药量2％)；lb平板；小鼠独立送风笼具；外科剪；镊子；刮毛器。
[0111]
6～8周龄雌性balb/c小鼠20只，均饲养在独立送风笼具中。
[0112]
菌液制备：金黄色葡萄球菌(atcc baa-1761株)，由西安交通大学第一附属医院检验科保存。实验前将金黄色葡萄球菌接种于5ml lb中置于37℃培养箱中振荡培养，至菌量
约为107cfu/ml时取出备用。
[0113]
(2)tap(tape stripping)法破坏小鼠皮肤屏障，建立小鼠皮肤浅表损伤模型
[0114]
造模前日用脱毛膏对6-8周龄雌性balb/c小鼠背部皮肤进行脱毛，形成约1cm2大小的皮肤裸露区域。造模当日以10ml/kg腹腔注射3％水合氯醛麻醉小鼠，由同一操作者用基本相同的力度将医用胶带与小鼠脱毛处皮肤紧密粘贴后撕脱，重复上述粘贴-撕脱操作多次以去除角质层，每次粘贴-撕脱过程均需更换胶带，待小鼠皮肤变红、发亮，但没有规律出血时，停止粘贴。将上述制备好的10μl菌悬液均匀涂抹于小鼠皮肤受损处，持续感染24h，建立小鼠皮肤浅表损伤模型。
[0115]
(3)局部治疗药对模型的验证
[0116]
将小鼠随机分为4组，分别为空白对照组(control)、低浓度x给药组(low-concentration group，具体浓度为0.1μm)、高浓度x给药组(high-concentration group，具体浓度为100μm)和夫西地酸给药组(fusidic acid group，即阳性对照组)，每组5只。空白对照组在治疗开始的前一日全部处死，以量化细菌接种量。三组给药组于感染后每日给药两次(分别为上午8点和下午20点)，连续3天，低浓度x给药组和高浓度x给药组给药量均为50μl/只/次，夫西地酸给药组给药量为0.1g/只/次。每天至少观察两次小鼠的采食、饮水情况及精神状况。实验结束后，处死小鼠。
[0117]
(4)感染创面活菌量检查
[0118]
处死小鼠后，立即切除约1cm2的创面，并将其与1ml生理盐水、磁珠一起放入组织匀浆管中进行组织匀浆。将100μl组织匀浆液用生理盐水进行101、102、103、104倍梯度稀释后，各稀释液取100μl均匀涂抹于lb平板上，倒置过夜培养12-24h后，菌落计数,并换算成每平方厘米组织中的细菌含量(cfu/cm2)。
[0119]
实验结果
[0120]
(1)如图10所示，小鼠在接受贝利司他和夫西地酸治疗3天后，相较于空白对照组，皮损部位的菌量显著减少，且菌落数具有统计学意义(如图11所示，p.value＝0.0006《0.01)。
[0121]
(2)从创面修复效果来看(如图10所示)，低浓度x给药组伤口恢复速度明显快于高浓度x给药组与夫西地酸给药组，可能因为贝利司他本身为抗癌药物，具有一定的抑制细胞生长的能力，故药物浓度越高，伤口愈合速度反而变慢，但从皮损部位载菌量可以看出，两种浓度下药物杀菌效果相当，均能明显地降低创口的细菌负荷。
[0122]
尽管本实验中使用的贝利司他为非软膏型，其粘度比阳性对照组(夫西地酸软膏)低得多，但仍然取得了很好的疗效。根据试验结果，在贝利司他在给药量比市售夫西地酸低的情况下仍表现出与其相当的抗菌能力，显示出贝利司他具有很大的发展前景。
[0123]
鉴于实验中所用贝利司他和夫西地酸剂型不同，因此现将药物物质的量作为参数进行比较：n
夫西地酸
＝0.1
×
0.02/516.345＝3.87
×
10-6
mol；n
贝利司他低浓度组
＝0.1
×
10-6
×
50
×
10-6
＝5
×
10-12
mol；n
贝利司他高浓度组
＝100
×
10-6
×
50
×
10-6
＝5
×
10-9
mol。可见不论高浓度给药组、低浓度给药组，贝利司他的给药量远低于夫西地酸的给药量，但疗效优于夫西地酸。
[0124]
本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵
盖在本发明的范围内。

技术特征：
1.贝利司他或其药学上可接受的盐在制备治疗感染的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、悬浮液、溶液、分散剂、用于口服或非口服给药的缓释制剂、静脉注射制剂、皮下注射制剂、吸入制剂、透皮制剂、直肠或阴道栓剂。3.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染选自：皮肤感染、胃肠道感染、泌尿道感染、生殖-泌尿道感染、呼吸道感染、窦感染、中耳感染、全身感染、伤口感染、中枢神经感染、腹内感染、肾盂肾炎、肺炎、细菌性阴道炎、链球菌性咽喉痛、慢性细菌性前列腺炎、妇科及骨盆感染、性传播性细菌疾病、眼部和耳部感染。4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染为细菌感染、真菌感染、寄生虫感染和病毒感染。5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染为由选自以下的一种或多种细菌引起的感染：枯草芽孢杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌。6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由革兰氏阳性细菌引起的感染，优选选自金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌和屎肠球菌的革兰氏阳性细菌。7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由革兰氏阴性细菌引起的感染，优选选自流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和嗜肺性军团病杆菌的革兰氏阴性细菌引起的感染。8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由对一种或多种抗生素具有耐药性的细菌引起的感染。9.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由对四环素或第一和第二代四环素抗生素的任何成员具有耐药性的细菌引起的感染。10.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由对甲氧西林具有耐药性的细菌引起的感染。11.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由由对万古霉素具有耐药性的细菌引起的感染。12.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由对喹诺酮或氟喹诺酮具有耐药性的细菌引起的感染。13.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由对替加环素(tigecycline)或任何其它四环素衍生物具有耐药性的细菌引起的感染。14.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由是由对β-内酰胺或头孢菌素抗生素具有耐药性的细菌或对青霉烯类或碳青霉烯类具有耐药性的细菌引起的感染。15.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其特征在于，所述感染是由由对大环内酯、林可酰胺(lincosamides)、链霉杀阳菌素抗生素、噁唑烷酮和截短侧耳素具有耐药性的细菌引起的感染。16.一种治疗感染的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的贝利司他或其药学上可接受的盐。17.贝利司他或其药学上可接受的盐，用于治疗感染。
18.根据权利要求16所述的方法或权利要求17所述贝利司他或其药学上可接受的盐，其中所述感染选自：皮肤感染、胃肠道感染、泌尿道感染、生殖-泌尿道感染、呼吸道感染、窦感染、中耳感染、全身感染、伤口感染、中枢神经感染、腹内感染、肾盂肾炎、肺炎、细菌性阴道炎、链球菌性咽喉痛、慢性细菌性前列腺炎、妇科及骨盆感染、性传播性细菌疾病、眼部和耳部感染。19.根据权利要求16所述的方法或权利要求17所述贝利司他或其药学上可接受的盐，其中所述感染为细菌感染、真菌感染、寄生虫感染和病毒感染。20.贝利司他或其药学上可接受的盐在制备hu蛋白抑制剂中的用途。21.噬菌体gp46蛋白在制备hu蛋白的抑制剂中的用途。

技术总结
本发明涉及医药领域。特别地，本发明涉及贝利司他或其药学上可接受的盐在制备治疗感染的药物中的用途。染的药物中的用途。染的药物中的用途。


技术研发人员：刘冰 刘登辉 王昕 张沛沛 王亚文 徐迟 乔楠
受保护的技术使用者：西安交通大学第一附属医院
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5