1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及肌肉干细胞相关的细胞培养领域，所述培养的肌肉干细胞可用于细胞培养肉的研究和生产。
背景技术：2.全球范围内，随着世界人口的增长和发展中国家经济地位的进一步提升，肉类及其他动物的产品需求将不断增加。依赖传统，以动物为基础的生产方式对于满足不断增长的需求是低效的且容易产生风险。动物养殖，尤其是集中大规模的动物饲养是造成环境压力的主要原因之一，并且会引发人们对于可持续性食品安全、工人安全、公共卫生和动物伦理等一系列担忧。近些年来，细胞培养肉行业发展迅速，细胞培养的肉类有可能提供大量的动物蛋白，有助于提高全球粮食安全，同时为人类健康、环境和动物福利带来好处。
3.细胞培养肉的种子细胞一般为肌肉干细胞。肌肉干细胞是一类具有干性的细胞，位于肌肉组织的基膜下方，含量非常少，且一般处于静息状态。在一定条件下(如，肌肉组织损伤等)，肌肉干细胞被激活，能够进行分化成为肌肉细胞，进一步的，肌肉细胞能够互相融合成为多核细胞，即为肌纤维。在培养肉行业中，首先也是最关键的技术难点在于如何成功分离纯化得到肌肉干细胞，其次分离得到的原代细胞也面临着培养周期短，细胞易衰老死亡等问题。
4.已有的肌肉干细胞分离方法中，均是猪、兔、鼠等体型相对较小的动物肌肉干细胞分离方法，几乎没有系统的涉及到大动物牛的肌肉干细胞分离、培养、鉴定方案，因此开发能够运用至细胞培养肉研究的牛肌肉干细胞分离培养方案至关重要。
5.近些年来，为了降低细胞培养的成本(主要是血清及生长因子的成本)，水解物被大量运用至一些细胞(如cho,293等)的大规模培养中。在细胞培养肉行业中，少有在基础培养基中使用单纯的非动物源水解物进行肌肉干细胞的培养及扩大的报道，为了降低培养肉过程中大规模扩增细胞时使用到的血清成本。同时，为了维持原代肌肉干细胞的增殖，生长因子fgf2被广泛应用到细胞的培养中，生长因子成本昂贵，是阻碍细胞进一步扩大培养的重要因素，所以开发一种能够运用至肌肉干细胞的水解物及低成本的生长因子培养方案非常重要。
技术实现要素：6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种原代肌肉干细胞分离、培养方法、培养基及其应用，本发明尤其适用于牛原代肌肉干细胞的培养，所获得的牛肌肉干细胞进一步应用于培养肉的研究，可以填补牛肌肉干细胞分离手段及培养方法等技术空缺。
7.本发明第一方面提供了一种非动物源水解物作为血清替代物在培养肌肉干细胞中的用途。
8.本发明第二方面提供了一种肌肉干细胞培养基，所述肌肉干细胞培养基包括基础
培养基、非动物源水解物和fgf2。
9.本发明第三方面提供了上述的肌肉干细胞培养基在肌肉干细胞体外培养中的用途。
10.本发明第四方面提供了一种肌肉干细胞体外培养方法，采用如上所述的肌肉干细胞培养基在体外培养肌肉干细胞。
11.本发明第五方面提供了一种肌肉干细胞，由如上所述的肌肉干细胞体外培养方法制备获得。
12.本发明第六方面提供了一种细胞培养肉，采用如上所述的肌肉干细胞在合适形成肌肉纤维和纹理的条件下，培养获得所述细胞培养肉。
13.相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
14.若培养方法或培养基无法满足使得肌肉干细胞在体外长期培养，多次传代的要求，为得到足够多的肌肉干细胞，就必须取非常大的肌肉组织用来分离纯化肌肉干细胞，在实际应用中基本不具有可行性。本发明所述非动物源水解物可促进肌肉干细胞在体外的增殖并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。采用本发明的肌肉干细胞体外培养、传代方法，使得肌肉干细胞可以在体外大量扩增并保持干性，从而大大提高了可以用于细胞培养肉的干细胞的数量。在本发明的培养基中，肌肉干细胞可以增殖多代次(四代以上)，连续传代后仍然能够继续保持干性和分化潜能。
15.本发明采用非动物源水解物尤其是酵母水解物及fgf2联用的方法，一方面极大的降低了肌肉干细胞(优选牛肌肉干细胞)培养中血清的使用量，另一方面，在此培养条件下，细胞多次传代与正常的血清及fgf2的联用达到了持平的水准。
16.本发明所述培养基中，无论是国产fgf2还是进口fgf2均可以实现较好的促进肌肉干细胞增殖且保持肌肉干细胞干性的效果。因此，可以采用国产fgf2替代进口fgf2，以大大降低培养肌肉干细胞的成本。
17.本发明提供了一套完整的细胞分离、培养及鉴定方案，为细胞培养肉种子细胞的获得提供了理论和实践依据。在水解物选择过程中对水解成分进行了测试及阐明，同时水解物的使用对于后续的培养扩大方案上具有一定的借鉴意义。本发明不仅解决了细胞培养肉种子细胞获得困难的问题，而且对于解决培养肉过程中存在的血清成本的问题具有很大的指导意义。细胞培养肉能够在一定程度上解决环境、动物福利、肉类提供不足等问题，本发明为此提供了较强的技术依据。
附图说明
18.图1为实施例1牛肌肉干细胞分离培养1至7天内的显微照片。
19.图2为实施例1牛肌肉干细胞干性蛋白pax7鉴定。
20.图3为实施例1牛肌肉干细胞细胞表面干性蛋白cd29/cd56流式鉴定。
21.图4为实施例1国产fgf2与进口fgf2肌肉干细胞培养效果对比。
22.图5为实施例1采用不同水解物及国产fgf2联用培养牛肌肉干细胞四代(p1～p4)的显微照片。
具体实施方式
23.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
24.本发明发现，牛肌肉干细胞在合适含量的非动物源水解物的培养基中进行培养，即使血清含量很低，也可以较好地增殖。牛肌肉干细胞在该新型肌肉干细胞培养基中，可以传代多次，获得的细胞数量和形态均与在高血清培养基中相似，说明本发明的新型肌肉干细胞培养基可以替代现有的高血清培养基，大大降低细胞培养的成本。较强的增殖能力更重要的是，这些用合适含量氨基酸的新型肌肉干细胞培养基培养的细胞可以用于细胞培养肉领域，大大降低牛肌肉细胞的培养成本。
25.本发明首次提出非动物源水解物作为血清替代物在培养肌肉干细胞中的用途。将所述非动物源水解物用于肌肉干细胞的培养，可以全部替代或至少部分替代血清，大大降低血清的用量。
26.所述非动物源水解物优选为酵母水解物。所述酵母水解物可以是任何合适的酵母水解物。在一些优选实施方式中，所述酵母水解物为面包酵母(saccharomyces cerevisiae)水解物；所述面包酵母水解物例如可以采用蛋白酶水解获得；所述蛋白酶包括但不限于木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黑曲霉酸性蛋白酶、风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、肽谷氨酰胺酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种。在一些优选实施方式中，所述酵母水解物含有粗蛋白，氨基酸，小肽和核酸，所述酵母水解物中氨基氮与总氮的质量比为25-50；分子量为大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.5～0.8％、0.8～15％、15～38％、40～60％、10～15％。在一些优选实施方式中，所述酵母水解物氨基氮与总氮的质量比为46；分子量为大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.6％、1.14％、20.06％、56.55％、21.65％，满足该指标要求的产品属于市售产品，如表1中的市售商品即酵母水解物#1(安琪，货号cm-ye-01)。在另一些优选实施方式中，所述酵母水解物氨基氮与总氮的质量比为30.8；分子量为大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.73％、10.24％、33.35％、42.02％、13.66％，满足该指标要求的产品属于市售产品，如表1中的市售商品即酵母水解物#2(安琪，货号cm-ye-03)。
27.在一些优选实施方式中，所述面包酵母水解物的制备方法包括：以面包酵母(saccharomyces cerevisiae)为原料，采用生物定向降解方法获得；具体地，以高密度发酵调控技术培养的面包酵母为原料，采用生物定向降解和膜过滤技术，经浓缩、喷雾干燥得到粉状酵母水解物；所述酵母水解物含有粗蛋白，氨基酸，小肽和核酸，所述酵母水解物中氨基氮与总氮的质量比为25-50；分子量为大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.5～0.8％、0.8～15％、15～38％、40～60％、10～15％。在一些优选实施方式中，所述酵母水解物氨基氮与总氮的质量比为46；分子量为大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.6％、1.14％、20.06％、56.55％、21.65％，满足该指标要求的产品属于市售产
品，如表1中的市售商品即酵母水解物#1(安琪，货号cm-ye-01)。在另一些优选实施方式中，所述酵母水解物氨基氮与总氮的质量比为30.8；分子量为大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.73％、10.24％、33.35％、42.02％、13.66％，满足该指标要求的产品属于市售产品，如表1中的市售商品即酵母水解物#2(安琪，货号cm-ye-03)。
28.本发明还提供了一种新型牛肌肉干细胞培养基，其为采用添加有合适含量的非动物源水解物的细胞培养基，可由在基础细胞培养基中添加合适含量非动物源水解物制备获得；包括基础培养基、非动物源水解物和fgf2。
29.本发明所述新型肌肉干细胞培养基可适用于任何合适的动物肌肉干细胞。优选地，为牛肌肉干细胞，猪肌肉干细胞，兔肌肉干细胞等；优选地，为牛肌肉干细胞。
30.本发明所述新型肌肉干细胞培养基中，所述非动物源水解物为酵母水解物。所述酵母水解物的制备方法包括：以酵母为原料，采用生物定向降解方法获得。具体地，所述酵母水解物的制备方法包括：以高密度发酵调控技术培养的面包酵母为原料，采用生物定向降解和膜过滤技术，经浓缩、喷雾干燥得到粉状酵母水解物。所述酵母水解物中氨基氮与总氮的质量比为25-50；和/或，分子量为大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.5～0.8％、0.8～15％、15～38％、40～60％、10～15％。在一些优选实施方式中，所述酵母水解物为表1中的酵母水解物#1和酵母水解物#2。
31.本发明所述新型肌肉干细胞培养基中，所述非动物源水解物在肌肉干细胞培养基中的浓度为0.1-20mg/ml，可以是0.1-0.5、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5、7.5-8、8-8.5、8.5-9、9-9.5、9.5-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-16、16-18、18-20mg/ml。优选地，所述非动物源水解物在肌肉干细胞培养基中的浓度为3-8mg/ml；优选地，为4-6mg/ml。更优选地，为1mg/ml。
32.本发明所述新型肌肉干细胞培养基中，还可以包含fgf2。所述fgf2在肌肉干细胞培养基中的浓度为1-50ng/ml，可以是1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5、7.5-8、8-8.5、8.5-9、9-9.5、9.5-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-16、16-18、18-20、20-21、21-22、22-23、23-24、24-26、26-28、28-30、30-35、35-40、40-45、45-50ng/ml。优选地，所述非动物源水解物在肌肉干细胞培养基中的浓度为5-20ng/ml；优选地，为8-12ng/ml mg/l。更优选地，为10ng/ml。
33.本发明所述新型肌肉干细胞培养基中，除基础培养基成分、添加的合适含量的非动物源水解物外，为节省成本，其中可以包含或不包含血清，当包含血清时，其中血清的含量是很低的。在一些实施方式中，所述血清的体积占基础培养基体积的0.5-2％，可以是0.5-1、1-1.5、1.5-2％；优选地，本发明加入的血清为0.5％。
34.本发明所述新型肌肉干细胞培养基中，基础培养基成分一般选自：平衡盐水、ph调节液、抗生素、动物血清、维生素、葡萄糖等。所述平衡盐水成分如氯化钙、硝酸铁、硫酸镁、氯化钾、氟化钠、氯化钠、磷酸钠等；所述ph调节液如碳酸氢钠、hepes溶液、丙酮酸钠等；所述抗生素如青霉素、链霉素等；常用的动物血清主要有牛血清和马血清。维生素如氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、维生素b6、核黄素、硫胺素等。
35.在一些实施方式中，本发明所述新型肌肉干细胞培养基中，所述基础培养基可选
自如dmem、rpmi 1640、mem、deme/f12、f10、cd293、medium 231、medium 106以及以此为基础改良的基础培养基中的至少一种。本发明实施例具体优选在dmem培养基中添加各种非动物源水解物的牛肌肉干细胞培养基。
36.在一些优选实施方式中，所述新型肌肉干细胞培养基为含非动物源水解物培养基，包括：dmem培养基、非动物源水解物、fgf2、血清。
37.其中，所述非动物源水解物在肌肉干细胞培养基中的浓度为0.1-20mg/ml，可以是0.1-0.5、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5、7.5-8、8-8.5、8.5-9、9-9.5、9.5-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-16、16-18、18-20mg/ml。优选地，所述非动物源水解物在肌肉干细胞培养基中的浓度为3-8mg/ml；优选地，为4-6mg/ml。更优选地，为1mg/ml。
38.其中，所述fgf2在肌肉干细胞培养基中的浓度为1-50ng/ml，可以是1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5、7.5-8、8-8.5、8.5-9、9-9.5、9.5-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-16、16-18、18-20、20-21、21-22、22-23、23-24、24-26、26-28、28-30、30-35、35-40、40-45、45-50ng/ml。优选地，所述非动物源水解物在肌肉干细胞培养基中的浓度为5-20ng/ml；优选地，为8-12ng/ml。更优选地，为10ng/ml。
39.其中，所述血清的体积占在肌肉干细胞培养基体积百分比为0.5-2％，可以是0.5-1、1-1.5、1.5-2％；优选地，本发明加入的血清为1％。
40.在一些实施方式中，所述含非动物源水解物培养基的配制步骤包括：首先称取相应量的水解物，将其溶解至dmem培养基中，再加入血清和fgf2，即可配制成为含非动物源水解物培养基。
41.在一些优选实施方式中，本发明提供了一种牛肌肉干细胞的培养方法，包括步骤：
42.(1)组织收集
43.收集牛肌肉组织，对其进行初步除菌处理。
44.(2)组织破碎及消化
45.将牛肌肉组织破碎，然后加入蛋白酶进行消化，获得消化液。
46.步骤(1)中，所述牛肌肉组织可以是任何合适的肌肉组织；由于冰冻组织长时间会导致细胞死亡，无法提取细胞，因此不推荐使用冰冻肌肉组织；本发明优选新鲜的组织；进一步优选为屠宰时长在3小时以内的新鲜牛肌肉组织。
47.步骤(1)中，在初步除菌前还包括取出表面组织的步骤。
48.步骤(1)中，初步除菌处理可采用任何合适的除菌液。优选地，采用75％酒精进行除菌处理，更优选，采用在冰浴中的酒精进行除菌处理。除菌的时间可以根据实际需要进行设定，可以是1-10min，优选为2min。
49.步骤(1)中，初步除菌后的组织转移至含青霉素-链霉素双抗的pbs缓冲液中。优选地，采用在冰浴中的含青霉素-链霉素双抗的pbs缓冲液。所述青霉素-链霉素双抗浓度可以根据实际需要进行设定，本发明优选青霉素-链霉素双抗在pbs缓冲液中的浓度为10％(v/v)。加入双抗的目的是去除组织上带有的细菌、避免后续组织提取及细胞培养过程中细菌污染。
50.步骤(2)中，所述破碎在无菌环境中进行。破碎过程中注意机械剪切力，防止造成
细胞损伤。可以使用合适的工具破碎细胞，如手术剪刀等。可以将所述组织破碎为任意大小，但是要有利于组织的消化，又不会使得其中的细胞受到损伤。在一些优选实施方式中，本发明将组织破碎为0.5mm3左右。
51.步骤(2)中，所述蛋白酶选自胰蛋白酶、i型胶原蛋白酶、iii型胶原蛋白酶；优选地，为胰蛋白酶。
52.步骤(2)中，所述消化的温度可以根据实际需要进行选择，可以是30-40℃，例如是30-32℃，32-34℃，34-36℃，36-38℃，38-40℃优选地，为32-38℃；在一更优选实施方式中，所述消化的温度为37℃。
53.步骤(2)中，所述消化的时间可以根据实际需要进行选择，例如根据消化后的组织液的形态等方式进行判断可以是0.5-5小时，例如是0.5、1、2、3、4、5小时；在一更优选实施方式中，所述消化的时间为1小时。
54.步骤(2)中，所述消化过程中，为使得组织能够消化充分，优选每隔一段时间，对组织液进行震荡处理，更优选每隔5分钟进行震荡处理。
55.步骤(2)中，所述终止消化采用加入dmem培养基的方式，优选采用加入含有20％(v/v)血清的dmem培养基终止消化。
56.(3)组织过滤
57.消化结束之后，对消化液进行过滤，然后对过滤液进行离心，获得细胞沉淀。
58.步骤(3)中，所述过滤采用40-300μm网筛进行过滤；优选地，先通过大孔径网筛进行粗筛，然后经过小孔径网筛进行二次过滤。在一优选实施方式中，所述过滤是指，先将消化后的组织液先通过灭菌的200μm大孔径进行初次过滤，去除消化不充分的组织，然后使用灭菌的40μm小孔径的网筛对组织裂解液进行二次过滤，以最大限度地去除未消化完全的组织残渣。
59.步骤(3)中，由于转速大于2000rpm会造成细胞损伤，导致肌肉干细难以维持自身的增殖活性，因此本发明该步骤所述离心的转速为500-2000rpm，可以是500-800、800-1000、1000-1200、1200-1500、1500-1800、1800-2000；优选地，为500-1800rpm；进一步优选地，为800-1200rpm；更进一步优选地，为1000rpm。
60.步骤(3)中，所述离心的时间可以根据实际需要进行选择，可以是1-10min，例如是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min；在一更优选实施方式中，所述消化的时间为4min。
61.(4)细胞接种、培养
62.将离心得到的细胞沉淀使用dmem培养基重悬，并接种至培养皿中。
63.步骤(4)中，所述dmem培养基中含有生长因子，优选地，所述生长因子为fgf2。所述生长因子的含量可根据实际需要进行确定，可以是1-50ng/ml，可以是1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50ng/ml；优选地，所述fgf2在培养基中的用量为5-20ng/ml；更优选地，为10ng/ml。
64.在一优选实施方式中，所述dmem培养基为含有高含量血清的培养基。所述血清在培养基中的用量为15-30％(v/v)，优选地，为20％(v/v)。
65.步骤(4)中，所述培养的温度可以根据实际需要进行选择，可以是30-40℃，例如是30-32℃，32-34℃，34-36℃，36-38℃，38-40℃；优选地，为32-38℃；在一更优选实施方式中，所述培养的温度为37℃。
66.步骤(4)中，所述培养的时间可以根据实际需要进行选择，例如根据细胞的生长密度来判断是否可以收获细胞或进行下一步的传代。优选地，本发明在细胞密度达到90％及以上时，可以收获细胞。通常达到90％细胞密度，需要培养3-5天。在一些优选实施方式中，在培养的过程中，还包括对培养基进行换液的步骤，由于干细胞贴壁较慢，因此细胞贴壁需要约2天，贴壁后，用pbs缓冲液清洗3次，去除漂浮杂质，加入上述新鲜高血清培养基进行培养，获得p0代细胞，p0代细胞总培养时间为3天以上。
67.(5)传代
68.将p0代细胞在培养皿密度达到90％时进行细胞传代，在新型肌肉干细胞中进行培养。
69.步骤(5)中，所述p0代细胞为在培养皿密度达到90％时，或培养为3天的细胞。
70.(6)传代
71.p0代细胞在培养皿密度达到90％时进行细胞传代，并使用新型肌肉干细胞进行培养，细胞贴壁生长3天，获得第一代(p1)代细胞，然后采用同样的方式进行第二代(p2)、第三代(p3)、第四代(p4)细胞的培养。
72.本发明进一步提供了一种细胞培养肉的制备方法，包括下列步骤：
73.1)按照上述方法培养获得牛肌肉干细胞；
74.2)收获所述牛肌肉干细胞，在合适形成肌肉纤维和纹理的条件下，培养获得的细胞培养肉。
75.本发明进一步提供了一种细胞培养肉，其由上述培养方法获得的肌肉干细胞培养获得。
76.本发明揭示了含合适氨基酸和多肽的非动物源水解物，可在基础培养基中仅含有较低血清的条件下促进肌肉干细胞的增殖，并使体外增殖的肌肉干细胞保持干性。
77.fgf2作为成纤维细胞生长因子家族的成员之一，由155个氨基酸组成，能够促进细胞有丝分裂从而促进细胞增殖，参与了多种生物学过程。fgf2广泛存存在于牛的神经组织、垂体、肾上腺皮质等部位。本发明中提及和使用到的牛源fgf2均来自于大肠杆菌体外表达纯化，具有非常高的生物活性。
78.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
79.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
80.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、细胞培养、及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，
81.以下实施例中，若无特殊说明，培养基中各成分的用量均是指相对于肌肉干细胞培养基的浓度或百分比。
82.实施例1国产fgf2替代进口fgf2
83.本实施例使用的进口fgf2产品信息为fgf2-r&d 2099-fb。
84.由于进口fgf2存在供货周期长、价格昂贵等问题，所以本发明对细胞培养过程中必须的fgf2进行了国产替代，主要通过实验过程中的对于细胞在两种不同来源的fgf2生长情况进行比较得出相应的结论，具体的实验过程为，取原代培养的肌肉干细胞接种于96孔板，三组实验，分别为无fgf2对照组(ctrl)，进口fgf2(fgf2-r&d)，国产fgf2(国产fgf2)，每组实验三个复孔，每孔接种细胞数为2000个。待细胞贴壁之后进行不同培养条件的培养，对照组为dmem+20％fbs，进口fgf2组为dmem+20％fbs+10ng/ml fgf2，国产fgf2组为dmem+20％fbs+10ng/ml fgf2。细胞培养5天，分别在第1天，第3天，第5天进行cck8细胞增殖检测，检测完毕之后进行数据的处理，并绘图。
85.结果如图4所示，从图4可以看出，无fgf2细胞增殖缓慢，反应在od值小，加入国产及进口fgf2能够显著促进肌肉干细胞增殖，并且可以看到国产及进口fgf2对于细胞增殖的促进作用相当，因此可以得出结论，国产的fgf2能够取代价格高并且货期长的进口fgf2。
86.实施例2牛肌肉干细胞分离培养
87.(1)组织收集
88.收集市场上屠宰时长在3小时以内的新鲜牛肌肉组织；使用手术刀将肌肉表面0.5cm组织切除，将10g剩下的肌肉组织浸泡在冰浴的含75％酒精的50ml离心管中，2分钟，进行初步除菌处理；随后转移至冰浴的含有10％(v/v)青霉素-链霉素双抗的pbs缓冲液的50ml离心管中。
89.(2)组织破碎及消化
90.将获得的牛肌肉组织转移至无菌室进行细胞分离操作。从pbs缓冲液中取出组织，置于10cm培养皿中，使用灭菌的手术剪剪碎组织，大小为0.5mm3左右(剪碎过程中注意机械剪切力，防止造成细胞损伤)；并将其转移至50ml离心管内，加入两倍体积的胰蛋白酶消化液(组织消化过程中如果出现明显的组织消化不完全，可将消化中的组织分至两个50ml离心管，再加入一倍体积的胰蛋白酶消化液，进行消化)，并将其转移至37℃恒温培养箱内进行消化处理，消化期间每隔5分钟，进行震荡处理(目的是消化充分)，消化时长为1小时；将消化的组织液分成两份，加入等体积的含有20％(v/v)血清的dmem培养基至30ml，终止消化；
91.(3)组织过滤
92.消化结束之后，先使用灭菌的200μm大孔径进行初次过滤，去除消化不充分的组织，然后使用灭菌的40μm小孔径的网筛对组织裂解液进行二次过滤(目的是最大限度地去除未消化完全的组织残渣)，对过滤之后的细胞悬液进行离心，离心条件为1000rpm 4min；
93.(4)细胞接种
94.将离心得到的细胞沉淀使用含有20％(v/v)血清和10ng/ml fgf2生长因子的dmem培养基(高血清培养基)缓慢重悬浮，并接种至10cm培养皿，转移至37℃恒温培养箱进行培养；
95.(5)细胞培养扩大
96.干细胞贴壁较慢，因此细胞贴壁需要48小时，贴壁后，用pbs缓冲液清洗3次，去除漂浮杂质，加入上述新鲜高血清培养基进行培养，获得p0代细胞，p0代细胞总培养时间为3天以上。
97.表1
[0098][0099]
an/tn(％)是指ammonia nitrogen/total nitrogen(％dh)，即氨基氮与总氮的质量比值。
[0100]
kda是指多肽的分子量；其相应的数值代表该分子量范围的多肽在酵母水解物中总肽的百分含量。
[0101]
两种水解物的信息为，安琪cm-ye-01(货号)，安琪cm-ye-03(货号)。
[0102]
表1中，水解物#1和水解物#2为以高密度发酵调控技术培养的面包酵母为原料，采用生物定向降解和膜过滤技术，经浓缩、喷雾干燥得到的粉状产品。
[0103]
本实施例含非动物源水解物培养基的配制：首先称取相应量的水解物，将其溶解至dmem培养基中，再加入0.5％(v/v)的血清和10ng/ml国产fgf2，即可配制成为含非动物源水解物培养基。第一代细胞在传代过程中，细胞计数之后，取30万细胞，分为三组，每组10万细胞，接种至6孔板三个孔，该过程的培养基为含有20％血清及10ng/ml fgf2的dmem培养基，待细胞贴壁之后，将对应的培养基加至3个孔内，五组培养基组成分别如下(除dmem外的成分，均以dmem为基准进行说明)：
[0104]
dmem+20％fbs+10ng/ml fgf2(对照组，ctrl)；
[0105]
dmem+0.5％fbs+1mg/ml水解物#1+10ng/ml fgf2(国产)(水解物1)；
[0106]
dmem+0.5％fbs+1mg/ml水解物#2+10ng/ml fgf2(国产)(水解物2)。
[0107]
(6)传代
[0108]
p0代细胞在培养皿密度达到90％时进行细胞传代，细胞计数之后取30万细胞，分为三组，每组10万细胞，接种至6孔板的三个孔，并使用含非动物源水解物培养基进行培养，细胞贴壁生长3天，获得第一代(p1)代细胞，然后采用同样的方式进行第二代(p2)、第三代(p3)、第四代(p4)细胞的培养；采用不同水解物培养牛肌肉干细胞四代(p1～p4)的显微照片如图4所示。由图可看出，水解物1和水解物2均能实现细胞的增殖和传代，含水解物1的培养基能够维持细胞多代次长时间增殖与对照组细胞增殖持平；含水解物2的培养基能够基本维持细胞正常增殖和传代。
[0109]
(7)细胞生长过程及状态检测
[0110]
干性鉴定：对p2细胞进行干性鉴定，使用的蛋白标志物为肌肉干细胞经典的蛋白标志物-pax7。测定步骤为：p1代细胞在培养皿密度达到90％时进行细胞传代，细胞计数之后取2万细胞至铺有玻片的24孔板内，待细胞贴壁之后即可进行蛋白检测，使用经典的免疫荧光操作步骤进行抗体的孵育及染色，最终在荧光显微镜下进行荧光镜检，结果如图2所示，由图2可知，pax7阳性细胞占比达到约90％以上，说明获得的细胞均为肌肉干细胞，细胞
分离提取成功。
[0111]
流式干性鉴定：使用肌肉干细胞细胞表面标志性干性蛋白fitc-cd56、apc-cd29对p1代细胞进行流式干性鉴定。测定步骤为：p1代细胞在培养皿密度达到90％时，取p1代细胞20万，分为两组，每组各10万细胞，根据经典的细胞流式方法进行细胞染色，其中一组不加，抗体另外一组加入两种抗体，细胞经过孵育染色之后进行流式细胞仪上机检测及分析，结果如图3所示，由图3可知，p2代细胞cd56及cd29双阳性细胞占比达到85.7％，进一步说明所得到的细胞为肌肉干细胞。
[0112]
综上所述，本发明肌肉干细胞体外培养方法、培养基及其应用有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0113]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
技术特征：1.非动物源水解物作为血清替代物在培养肌肉干细胞中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非动物源水解物为酵母水解物。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述酵母水解物为面包酵母水解物。4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述酵母水解物中氨基氮与总氮的质量比为25-50；和/或，分子量位于大于2kda、1-2kda、400da-1kda、180-400da、小于180da范围的多肽在总多肽中的质量百分比分别为0.5～0.8％、0.8～15％、15～38％、40～60％、10～15％。5.一种肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述肌肉干细胞培养基包括基础培养基、如权利要求1～4任一项所述的用途中所述的非动物源水解物和fgf2。6.如权利要求5所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，包括以下至少任一项：1)以非动物源水解物干重计，所述非动物源水解物在肌肉干细胞培养基中的浓度为0.1-20mg/ml；2)所述fgf2在肌肉干细胞培养基中的浓度为1-50ng/ml；3)所述基础培养基选自dmem、rpmi 1640、mem、dmem/f12、f10、cd293、medium 231、medium 106以及以此为基础改良的基础培养基中的至少一种；优选地，所述基础培养基为dmem。7.如权利要求5所述的肌肉干细胞培养基，其特征在于，所述肌肉干细胞培养基还包括血清；优选地，所述血清在肌肉干细胞培养基中的体积百分比为0.5-2％。8.如权利要求5～7任一项所述的肌肉干细胞培养基在肌肉干细胞体外培养中的用途。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述非动物源水解物用于促进肌肉干细胞在体外的增殖，且使肌肉干细胞保持干性。10.一种肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，采用如权利要求5～7任一项所述的肌肉干细胞培养基在体外培养肌肉干细胞。11.一种肌肉干细胞体外培养方法，其特征在于，所述方法还包括肌肉干细胞的分离步骤；优选地，所述培养方法包括：(1)组织收集收集肌肉组织，进行除菌处理；(2)组织破碎及消化将肌肉组织破碎，然后加入蛋白酶进行消化，获得消化液；(3)组织过滤对所述消化液进行过滤，离心，获得细胞沉淀；(4)细胞接种、培养采用如权利要求5～7任一项所述的肌肉干细胞培养基重悬将所述细胞沉淀，并接种至培养皿中进行培养。12.一种肌肉干细胞，其特征在于，由如权利要求10或11所述的体外培养方法培养获得。13.一种细胞培养肉，其特征在于，包括下列步骤：1)按照权利要求10或11所述的体外培养方法培养获得肌肉干细胞；2)收获所述肌肉干细胞，在合适形成肌肉纤维和纹理的条件下，培养获得所述细胞培
养肉。14.如权利要求1～4任一项所述的用途或如权利要求5～7任一项所述的肌肉干细胞培养基或如权利要求8或9所述的用途或如权利要求10或11所述的培养方法或如权利要求12所述的肌肉干细胞或如权利要求14所述的细胞培养肉，其特征在于，所述肌肉干细胞为牛肌肉干细胞，猪肌肉干细胞，兔肌肉干细胞至少任一；优选地，所述肌肉干细胞为牛肌肉干细胞。
技术总结本发明属于细胞培养领域，公开了一种牛肌肉干细胞体外分离培养方法、培养基及其应用。本发明的肌肉干细胞体外培养方法，为采用非动物源水解物的细胞培养基体外培养肌肉干细胞。本发明还进一步公开了用于培养所述肌肉干细胞的培养基。采用本发明的培养基，可以在不添加或添加较少的血清的基础上，即可获得细胞数量和细胞形态均理想的肌肉干细胞，所述肌肉干细胞可在连续传代多次后，仍可保持干性和分化潜能。本发明利用体外培养的肌肉干细胞用于细胞培养肉领域，具有广泛应用前景。具有广泛应用前景。
技术研发人员：王飞 黄彬璐 陈佳沁
受保护的技术使用者：上海食未生物科技有限公司
技术研发日：2022.04.21
技术公布日：2022/7/5
