一种氟-18标记的cd63靶向化合物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于医学影像技术领域，具体涉及一种氟-18标记的cd63靶向化合物及其制备方法和应用。
背景技术：2.cd63是一种重要的溶酶体跨膜蛋白，参与肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换，从而导致大量新生血管的生成，促进了肿瘤的生长与侵袭。因此，cd63的过度表达通常与肿瘤侵袭性强、预后差、转移和复发几率高有关。可见，对cd63进行示踪将有利于对肿瘤疾病及其进展的理解。但是，目前缺乏可靠的显像策略来实现cd63的可视化研究。
3.以pet和spect为代表的核医学显像技术突破了光学显像和电子显微镜穿透深度低、mri和ct显像灵敏度低等壁垒，是实现cd63靶向显像的理想技术。而pet比spect具有更高的灵敏度和空间分辨率，并且可以进行精准定量，因此更适合cd63的在体靶向显像研究。本发明使用自主筛选的cd63靶向核酸适配体x为cd63靶向基团，将其5’端连接一个乙胺基，再使用[
18
f]sfb与x中的乙胺基发生化学反应，成功得到了一种cd63靶向化合物[
18
f]xapf。实验证实，[
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f]xapf有很高的放射化学产率和放射化学纯度，并且在生理盐水和乙醇中稳定性良好。更重要的是，在cd63高表达的胰腺癌荷瘤小鼠模型中，肿瘤对[
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f]xapf有高摄取以及低背景摄取，并且肿瘤对[
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f]xapf的摄取能被x5核酸适配体有效抑制，证明cd63靶向化合物[
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f]xapf的特异性。另外，[
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f]xapf的制备方法简单、成本低，有望实现临床转化和应用。
技术实现要素：[0004]
本发明的首要目的在于提供一种氟-18标记的cd63靶向化合物。
[0005]
本发明的另有目的在于提供上述氟-18标记的cd63靶向化合物的制备方法。
[0006]
本发明的再一目的是提供上述氟-18标记的cd63靶向化合物在制备用于正电子发射断层显像的试剂中的应用。
[0007]
本发明的具体技术方案如下：其中，氟-18标记的cd63靶向化合物的具体结构式如下：x为cd63靶向核酸适配体x1或x2或x3或x4或x5；
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f为放射性信号基团；cd63靶向核酸适配体选自x1、x2、x3、x4和x5中的任意一个。x1的核苷酸序列如seq id no:1所示；x2的核苷酸序列如seq id no:2所示；x3的核苷酸序列如seq id no:3所示；x4的核苷酸序列如seq id no:4所示；x5的氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0008]
氟-18标记的cd63靶向化合物的合成与标记方法，包括如下步骤：
（1）化合物1的合成：以4-(二甲氨基)苯甲酸乙酯（edb）和三氟甲磺酸甲酯为原料，于室温下反应，即可得化合物1；（2）化合物2的合成：化合物1经氟化反应得到化合物2；（3）化合物3的合成：化合物2在氢氧化钠和盐酸的作用下，得到化合物3；（4）化合物4（[
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f]sfb）的合成：化合物3与氢氧化四丙基胺和2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯（tstu）反应，得到化合物4（[
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f]sfb）；（5）化合物5的合成：化合物5中的核酸适配体x1、x2、x3、x4和x5由筛选得到，并分别在其5’端连接一个乙胺基，用于放射性标记；（6）[
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f]xapf的合成：将化合物5加到化合物4中，在40℃下反应20 min，分离纯化后，得到[
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f]xapf； 。
[0009]
氟-18标记的cd63靶向化合物[
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f]xapf是pet显像剂，用于cd63阳性肿瘤的早期诊断和疗效评估。
[0010]
本发明的有益效果是：（1）本发明中的一种氟-18标记的cd63靶向化合物[
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f]xapf，是一种新型的cd63靶向pet显像剂。[
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f]xapf制备方法简便易行，有很高的放射化学产率和放射化学纯度，并且在生理盐水和乙醇中稳定性良好，可用于cd63阳性肿瘤的体内pet成像。
[0011]
（2）本发明中的一种氟-18标记的cd63靶向化合物[
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f]xapf具有优良的生物学性能。在cd63高表达的荷瘤小鼠模型中，肿瘤对[
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f]xapf有高摄取以及低背景摄取，且摄取具有特异性，满足用作cd63靶向pet探针的条件。
附图说明
[0012]
图1为本发明的合成线路图。
[0013]
图2为[
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f]xapf及标记前体x5的hplc分析，[
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f]xapf与x5在hplc上的出峰时间相近，证实[
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f]xapf被成功标记。
[0014]
图3为radio-tlc分析cd63靶向pet探针[
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f]xapf在生理盐水和乙醇中的稳定性。
[0015]
图4为在共注射或者不注射x5核酸适配体的情况下，cd63靶向pet探针[
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f]xapf在荷cfpac1瘤裸鼠体内的pet显像（如a所示），圆圈和箭头指示肿瘤；以及肿瘤中[
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f]xapf摄取的对比（如b所示）；肿瘤与肌肉摄取的比值（如c所示）。
具体实施方式
[0016]
下面结合实施例和附图说明对本发明做进一步说明和描述。
[0017]
如图1所示，基于cd63靶向核酸适配体x5的氟-18标记的cd63靶向化合物[
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f]xapf的制备步骤具体如下：（1）化合物1的合成：将0.9g (3.5 mmol)4-(二甲氨基)苯甲酸乙酯（edb）溶于10 ml二氯甲烷，然后向其中加入0.4 ml(3.5 mmol)三氟甲磺酸甲酯，密封，于室温下反应约20 h。反应结束后，蒸发溶剂，经二氯甲烷/正己烷重结晶两次即可得纯产物，称重为1.36g，产率为84%。
[0018]
（2）化合物2的合成：
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f-水溶液通过sep-pak qma阴离子交换盒(水)去除富含
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o的水，用1.5 ml的k
222
/k2co
3 (13 mg k
222
, 3 mg k2co
3 溶于90%乙腈溶液) 将
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f-洗脱进5 ml的mini-vial管中，116℃共沸干燥两次，溶剂蒸发生成无水k
222
/k[
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f]配合物。再向盛有干燥
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f-的反应瓶中加入化合物1（10 mg，31.2
ꢀµ
mol，溶于 0.2 ml无水乙腈），在80℃加热10 min，得到化合物2。
[0019]
（3）化合物3的合成：将上述反应液冷却后，加入0.5 mol/l的naoh 0.5 ml，在90℃反应5 min，冷却，然后加入1 mol/l的hcl 0.7 ml。反应液通过一活化的sep-pak c18柱，先用2 ml的0.01 mol/l盐酸淋洗，用n
2 吹干sep-pak c18柱，然后用3 ml的乙腈洗脱得到化合物3。
[0020]
（4）化合物4（[
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f]sfb）的合成：向化合物3的乙腈溶液中加入20
ꢀµ
l氢氧化四丙基胺的水溶液，在100℃共沸干燥，然后向其中加入12 mg的tstu（溶于0.25 ml乙腈中），在80℃反应5 min。用3 ml的 5%醋酸酸化，最后用6 ml的水稀释。将上述溶液通过一激活的sep-pak c18柱，先用10 ml乙腈/水(v:v=1:3)混合液淋洗，然后用n
2 吹干sep-pak c18柱，最后用2 ml无水乙腈洗脱，得到化合物4（[
18
f]sfb）的乙腈溶液。[
18
f]sfb在hplc上的保留时间为15.49 min，与其非放射性参照物对甲酰基苯甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯[
19
f]sfb（商业途径购买，cas：60444-78-2）在hplc上的保留时间（15.29 min）近似，因此认为[
18
f]sfb被成功标记。
[0021]
（5）化合物5的合成：化合物5中的核酸适配体x5由筛选得到，并在其5’端连接一个乙胺基。
[0022]
（6）[
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f]xapf的合成：将1 mg的化合物5加到化合物4的乙腈溶液中，混匀后在40℃下反应20 min。并用hplc进行分离，hplc条件为：使用半制备型xbridge ost柱（2.5μm，50
×
10 mm，waters）纯
化，乙腈和0.1m的三乙基乙酸铵(teaa)缓冲液用作流动相，流动相梯度为：0-3 分钟：0%乙腈，3-12 分钟：5-30%乙腈，12-15 分钟：30-90% 乙腈，流速为5 ml/min。所得的产物溶液用氮吹仪吹干。如图2所示，[
18
f]xapf及其标记前体核酸适配体x5在hplc上的保留时间相近，说明[
18
f]xapf被成功标记。同时测得[
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f]xapf的放射化学产率为87.5%，[
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f]xapf的放射化学纯度＞98%。
[0023]
以上述[
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f]xapf显像剂为例，实验结果表明，其基本性能如下：（1）[
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f]xapf在生理盐水和乙醇中的稳定性选择了生理盐水以及乙醇两种体系来对[
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f]xapf的体外稳定性进行研究。监测生理盐水或乙醇中的稳定性需取一定量的[
18
f]xapf溶于生理盐水或乙醇中，于室温下孵育0.5、1和2小时，再通过tlc来监测[
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f]xapf的放射化学纯度来判断其是否稳定。如图3所示[
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f]xapf在生理盐水和乙醇中孵育2小时时依然保持稳定。
[0024]
（2）[
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f]xapf在胰腺癌荷瘤小鼠体内的pet成像选用8周大的balb/c裸鼠，于右腿种植cd63阳性的cfpac1胰腺癌细胞。待肿瘤长至直径为0.5-1 cm时进行pet显像，每只裸鼠通过尾静脉注射约0.4 mci/200μl的[
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f]xapf注射液，共注射或者不注射x5核酸适配体，并于注射后1小时用异氟烷进行吸入式麻醉，俯卧固定后进行静态pet扫描。胰腺癌荷瘤小鼠的[
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f]xapf-pet显像结果如图4所示，由显像结果可知，[
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f]xapf在cd63阳性的cfpac1胰腺癌肿瘤有很高的富集，并且还有很高的肿瘤与肌肉的比值，充分说明[
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f]xapf对cd63阳性的肿瘤有高靶向性。
[0025]
相比之下，[
18
f]xapf与x5核酸适配体共注射的结果显示，x5核酸适配体能够有效抑制[
18
f]xapf的摄取，充分说明[
18
f]xapf对cd63阳性的肿瘤有高特异性。
[0026]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
技术特征：1.一种氟-18标记的cd63靶向化合物，其特征在于：其结构式为；其中，x为cd63靶向核酸适配体x1或x2或x3或x4或x5；
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f为放射性信号基团；cd63靶向核酸适配体选自x1、x2、x3、x4和x5中的任意一个。2.如权利要求1所述的一种氟-18标记的cd63靶向化合物，其特征在于：x1的核苷酸序列如seq id no:1所示；x2的核苷酸序列如seq id no:2所示；x3的核苷酸序列如seq id no:3所示；x4的核苷酸序列如seq id no:4所示；x5的氨基酸序列如seq id no:5所示。3.权利要求1所述的一种氟-18标记的cd63靶向化合物的制备方法，包括如下步骤：（1）化合物1的合成：以4-(二甲氨基)苯甲酸乙酯（edb）和三氟甲磺酸甲酯为原料，于室温下反应，即可得化合物1；（2）化合物2的合成：化合物1经氟化反应得到化合物2；（3）化合物3的合成：化合物2在氢氧化钠和盐酸的作用下，得到化合物3；（4）化合物4（[
18
f]sfb）的合成：化合物3与氢氧化四丙基胺和2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯（tstu）反应，得到化合物4（[
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f]sfb）；（5）化合物5的合成：化合物5中的核酸适配体x1、x2、x3、x4和x5由筛选得到，并分别在其5’端连接一个乙胺基，用于放射性标记；（6）[
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f]xapf的合成：将化合物5加到化合物4中，在40℃下反应20 min，分离纯化后，得到[
18
f]xapf；
ꢀ
。4.权利要求1或2所述的一种氟-18标记的cd63靶向化合物在制备用于正电子发射断层显像的试剂中的应用。
技术总结本发明公开了一种氟-18标记的CD63靶向化合物[
技术研发人员：单鸿 许多 李丹 罗慧 杨帆 王皓帆
受保护的技术使用者：中山大学附属第五医院
技术研发日：2022.05.24
技术公布日：2022/7/5
