1.本发明涉及益生菌技术领域，特别涉及一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治精神分裂症的药物中的应用。
背景技术：2.精神分裂症是一种严重影响人类生活的精神疾病，它会让人分不清现实与想象，常常做出的行为也不受主观控制，而且极其痛苦，严重影响生活。
3.精神分裂症的主要临床表现为“主客观世界不统一、情感不协调、行为古怪”。精神分裂症的成因也十分复杂，大致总结也可以分为“心理成因、生理成因、社会化成因”，且多成因交互作用。
4.当下治疗精神分裂症还是以物理治疗、药物治疗为主，心理治疗为辅，同时补充家庭和社会支持系统对患者的关照。
5.按药理作用，临床常用的抗精神分裂症药物分为典型和非典型两类。典型抗精神分裂症药又称传统抗精神分裂症药，代表药物有利培酮、氟哌啶醇等，这类药物对阳性症状(包括幻觉、妄想、联想散漫，敌对性等)治疗效果好，但对阴性症状(包括情感应答、动机、社交及言语减少等)无效，治疗同时往往伴随较严重的锥体外系反应(eps)，患者依从性较差。非典型抗精神分裂症药又称非传统抗精神分裂症药，治疗谱更广，对阴性症状效果明显优于传统药物，短期内副作用小，但是长期使用可导致体重增加，脂质和糖代谢异常趋势增加，从而影响长期治疗价值，血清催乳素升高、q-t间期延长同样也会严重影响患者生活质量；降低服用的依从性。因此，临床上迫切需要研发新的对精神分裂症具有预防和治疗作用的药物。
技术实现要素：6.基于上述技术问题，本发明的主要目的是提供一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖a提取物的新应用，主要是将脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a提取物用于制备防治精神分裂症的药物。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
8.脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治精神分裂症的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物为荚膜多糖a的提取物。
9.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。
10.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为80kd-90kd。
11.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的提取物中脂质的质量低于0.02％。
12.在其中一些实施例中，所述精神分裂症包括偏执型精神分裂、青春型精神分裂、紧张型精神分裂、单纯型精神分裂、未分化型精神分裂或者残留型精神分裂。
13.在其中一些实施例中，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅
料。
14.在其中一些实施例中，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂和等渗或等张调节剂中的一种或者多种。
15.在其中一些实施例中，所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种。
16.在其中一些实施例中，所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种。
17.在其中一些实施例中，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种。
18.在其中一些实施例中，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种。
19.在其中一些实施例中，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种。
20.在其中一些实施例中，所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种。
21.在其中一些实施例中，所述溶剂选自水、油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种。
22.在其中一些实施例中，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种。
23.在其中一些实施例中，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种。
24.在其中一些实施例中，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种。
25.在其中一些实施例中，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇以及触变胶中的至少一种。
26.在其中一些实施例中，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种。
27.在其中一些实施例中，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种
28.在其中一些实施例中，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种。
29.在其中一些实施例中，所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种。
30.在其中一些实施例中，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种。
31.在其中一些实施例中，所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种。
32.在其中一些实施例中，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
33.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为片剂或者颗粒剂。
34.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为丸剂或者粉剂。
35.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为胶囊剂或者注射剂。
36.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为口服液或者管饲制剂。
37.在其中一些实施例中，所述药物的给药途径为注射给药或者口服给药。
38.在其中一些实施例中，所述药物还包含其他治疗精神分裂症药物。
39.在其中一些实施例中，所述其他治疗精神分裂症药物选自阿力哌唑、利培酮、氯丙嗪、氯氮平、维思通、奥氮平和氟哌啶醇中的一种或者多种。
40.与传统技术相比，本发明具有如下有益效果：
41.发明人经长期研究，发现脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a能有效改善精神分裂症的症状，且该药效在氯氨酮诱导的精神分裂症动物模型得以验证。采用脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a的提取物制备防治精神分裂症的药物还具有无毒副作用的优势。
附图说明
42.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
43.图1为脆弱拟杆菌荚膜多糖sec-hplc分析结果；
44.图2为脆弱拟杆菌荚膜多糖sec-mals分析结果。
具体实施方式
45.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
46.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
47.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
48.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
49.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
50.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
51.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间
内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
52.脆弱拟杆菌(b.fragilis)属于拟杆菌门，拟杆菌科，拟杆菌属，革兰氏阴性非生孢的严格厌氧杆菌；正常寄居于人体肠道、口腔、呼吸道，对宿主的生理机能有深远影响。
53.脆弱拟杆菌荚膜多糖a是从脆弱拟杆菌制备得到的荚膜多糖，本发明证实脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a可改善精神分裂症模型动物拟精神分裂症的阳性和阴性症状，可在制备防治精神分裂症药物中应用。
54.脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治精神分裂症的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物为荚膜多糖a的提取物。
55.本发明发现脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a能有效改善精神分裂症的症状，且该药效在氯氨酮诱导的精神分裂症动物模型得以验证。采用脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a的提取物制备防治精神分裂症的药物还具有无毒副作用的优势。
56.本发明提供的应用中，荚膜多糖a由重复单元由4个单糖组成，分别为n-乙酰半乳糖胺、β-d呋喃半乳糖、2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-ɑ-d-吡喃半乳糖以及4,6-半乳糖丙酮酸。
57.本发明所用的脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌zy-312(bacteroides fragilis zy-312)，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株是一株非产肠毒脆弱拟杆菌。
58.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。本发明的荚膜多糖a的重均分子量为70kd、71kd、72kd、73kd、74kd、75kd、76kd、77kd、78kd、79kd、80kd、81kd、82kd、83kd、84kd、85kd、86kd、87kd、88kd、89kd、90kd。较优地，本发明的荚膜多糖a的重均分子量为80kd-85kd。
59.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的重均分子量和数均分子量(mw/mn)的比值为1：(1.0-1.3)。
60.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的提取物中重均分子量分布于70kd-100kd的部分占总提取物重量的70％-80％；
61.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的提取物中，脂质的重量含量＜0.02％。例如脂质的含量为0、0.001％、0.005％、0.01％、0.015％、0.02％。
62.在其中一个示例中，所述精神分裂症包括偏执型精神分裂、青春型精神分裂、紧张型精神分裂、单纯型精神分裂、未分化型精神分裂或者残留型精神分裂。
63.本发明上述应用中，荚膜多糖a的提取物的制备，可以，包括但不限于，包括以下步骤：
64.(1)脆弱拟杆菌发酵液经过离心，收集细菌沉淀(菌泥)；
65.(2)菌泥中加入纯化水，充分搅拌，使细菌重悬；
66.(3)调节细菌重悬液的ph至酸性；
67.(4)细菌重悬液转移至提取容器中，加热提取，离心取上清；
68.(5)超滤除小分子杂质，收集截留液；
69.(6)柱交换层析；
70.(7)柱层析收集液经超滤除盐、浓缩后，冷冻干燥，密封保存。
71.上述制备工艺主要概括为：脆弱拟杆菌厌氧发酵
→
离心收集菌体沉淀
→
菌泥混悬
→
酸提
→
离心收集上清
→
超滤除小分子杂质
→
离子交换一步层析
→
冻干工艺制备。制备的荚膜多糖a可满足：蛋白残留＜1％；核酸残留＜0.05％；结合脂质＜0.02％；不含脂多糖或其他污染性多糖组分；分子量分布均一，重均分子量为70kd-90kd，mw/mn＜1.3。
72.在其中一个示例中，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅料。
73.可以理解得是，所述辅料例如为稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂、等渗或等张调节剂等，可以含一种，也可以含两种或者两种以上。所述的辅料可以选自，包括但不限于，如下：稀释剂为淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类；所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种；所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种；所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；所述溶剂选自水、油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种；所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种；所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇以及触变胶中的至少一种；所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种；所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
74.可以理解得是，所述药物可以根据临床需求制备成合适的剂型，例如片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、管饲制剂等。
75.可以理解得是，所述药物可以根据临床需求通过合适的给药途径进行给药，例如注射给药、口服给药等。
76.在其中一个示例中，所述药物还包含其他治疗精神分裂症药物。
77.在其中一个示例中，所述其他治疗精神分裂症药物选自阿力哌唑、利培酮、氯丙嗪、氯氮平、维思通、奥氮平和氟哌啶醇中的一种或者多种。
78.实施例1、脆弱拟杆菌荚膜多糖a的制备方法
79.脆弱拟杆菌zy-312发酵液离心，收集菌泥。
80.(1)方法1：酸提法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖a
81.1)取50g菌泥，加入300g纯化水使菌体重悬，用1mol/l盐酸溶液调节其ph至4.5，100℃提取1.5h，冷却至室温，12000g常温离心10min，取上清，得到粗糖溶液。
82.2)粗糖溶液经10kd超滤膜超滤浓缩，收集回流液；
83.3)回流液中加入等体积40mmol/l tris-hcl(ph8.5)缓冲溶液转盐；deae sepharose fast flow离子交换柱层析(16mm
×
200mm)，流速20ml/min，20mmol/l tris-hcl(ph8.5，含0.2mol/l nacl)缓冲溶液梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100ml/瓶(组分)，sec-hplc跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，10kd超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干；平行2次试验，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖分别命名为“s1”和“s2”，对应的检测结果参见图1和图2。
84.(2)方法2：苯酚/水法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖a
85.①
取50g菌泥，加入0.15mol/l氯化钠溶液200ml，洗涤后12000g常温离心20min，收集菌泥；
86.②
加入750ml纯化水，使菌体重悬，再加入等体积75％苯酚水溶液(m/m)，68℃搅拌提取30min，16000g室温离心30min，去沉淀；
87.③
上清用等体积乙醚萃取3次，收集水相；水相经旋转蒸发仪浓缩，透析后冻干。
88.④
上述样品用0.1mol/l乙酸钠溶液(含有10mmol/l cacl2和10mmol/lmgcl2)溶解，加入2mg脱氧核糖核酸酶和10mg核糖核酸酶，37℃搅拌2h，再次加入2mg脱氧核糖核酸酶和10mg核糖核酸酶，37℃搅拌过夜；调节ph至7.0，加入20mg链霉蛋白酶，37℃搅拌2h，再次加入20mg链霉蛋白酶，37℃搅拌过夜；加入无水乙醇至终浓度为80％，4℃过夜，12000g离心10min，取沉淀。
89.⑤
沉淀中加入5％乙酸溶液复溶，100℃水解1h，透析除盐后，deae sepharose fast flow离子交换柱层析，分段收集，sec-hplc跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤除盐、冻干；平行2次试验，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖a分别命名为“s3”和“s4”。
90.(3)实验结果
91.两种制备方法所得脆弱拟杆菌荚膜多糖的比较结果见表1。
92.表1、两种制备方法所得脆弱拟杆菌荚膜多糖a的质量属性比较
[0093][0094]
四个样品分别记为：s1-psa、s2-psa、s3-psa、s4-psa。
[0095]
实施例2、脆弱拟杆菌荚膜多糖a治疗精神分裂症的效果验证
[0096]
一、实验方法
[0097]
动物：用于实验的sprague-dawley(sd)大鼠(200-250g,雄性)均购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。分笼饲养(鼠笼规格：485mm
×
350mm
×
200mm)，室温保持在25℃
±
1℃，自由进食和饮水，用标准啮齿类动物饲料喂养，房间湿度维持在50％左右，明暗周期为
12h。大鼠适应性喂养一周后进行实验，所有的行为学实验都在9:00-12:00完成。所有的动物实验过程严格遵守国际卫生研究机构关于动物使用伦理学的原则。
[0098]
动物分组：90只sd大鼠，随机分为9组，每组10只。分别为阴性对照组(空白对照)，模型组，阳性药组(利培酮)，s1-psa的低、中、高剂量组、s4-psa的低、中、高剂量组，详见表2。
[0099]
精神分裂症模型制备：每日清晨对阴性对照组注射生理盐水(1ml/kg)7天，其余5组注射等量氯氨酮(30mg/kg)7天以建立氯氨酮诱导的精神分裂症动物模型。
[0100]
给药：实验药物用量按体表面积比率换算，s1-psa和s4-psa的高、中、低剂量组分别配置以5mg/kg、3mg/kg、1mg/kg灌胃。阳性药组(利培酮)配置以5mg/kg灌胃。阴性对照组与模型组大鼠每日给予生理盐水灌胃。各组灌胃容积为1ml/kg，连续灌胃10天，详见表2。
[0101]
表2、动物分组及给药
[0102][0103]
动物症状及认知功能检测：造模第1天记为d1，在造模7天(d7)结束后及治疗药物干预10天(d17)结束后，分别对所有大鼠按组别依次进行相同时间的旷场实验和强迫游泳实验。
[0104]
①
旷场实验：由4个规格为50cm
×
50cm
×
40cm的无顶灰色观察箱、摄像机和smart 3.0动物行为学视频分析系统组成。在实验过程中，同时将4只大鼠放入观察箱，smart系统自动记录大鼠的运动轨迹和距离，自由运动时间30min。每个观察箱被分为3
×
3共9个区域，设为外周区和中心区。对不同区域和不同时间段对大鼠的探究行为及自主活动进行分析，用于研究精神分裂症的阳性症状。用中央区域和前10min(t1)的活动路程代表大鼠的探究行为，外周区域和后20min(10min-20min为t2、后10min为t3)的活动路程代表大鼠的自主活动。
[0105]
②
强迫游泳实验：将高40cm、直径25cm的玻璃烧杯倒入温水。实验时将每只大鼠放入温水中使其强行游泳5min并记录其累计不动(以大鼠能够漂浮在水中而不挣扎为指标)的时间，计算不动时间百分比，用于研究精神分裂症的阴性症状。
[0106]
统计学分析：使用spss 18.0软件进行统计，数据用均数
±
标准差表示，应用因素方差分析(snk-q)和配对t检验，p《0.05为差异有统计学意义。
[0107]
二、结果与分析
[0108]
1.各组活动路程比较
[0109]
各组大鼠在药物干预前外周区活动路程、活动总路程、t1、t2及t3活动路程的差异具有统计学意义(p《0.01)，进一步比较结果显示模型组、阳性药组、低剂量组、中剂量组和高剂量组这8个造模组大鼠的外周区活动路程、活动总路程及3个时间段的活动路程与阴性对照组间差异均有统计学意义(p《0.05或p《0.01)；提示模型建立成功。
[0110]
各组药物干预后外周区活动路程、活动总路程与药物干预前相比差异均有统计学意义。与阴性对照组相比，模型组外周区活动路程、活动总路程均显著增多(p《0.01)；与模型组相比，阳性药组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的外周区活动路程、活动总路程均显著减少(p《0.01)。高剂量组、中剂量组和低剂量组相比各活动路程差异无统计学意义；低剂量组、中剂量组和高剂量组与阳性药组相比差异也无统计学意义(p》0.05)。对药物干预前后配对t检验结果表明，模型组大鼠给药前后数据差异无统计学意义(p》0.05)，阳性药组、低剂量组、中剂量组和高剂量组药物干预后的外周区活动路程、活动总路程与干预前相比，差异具有统计学意义(p《0.01)。见表3。
[0111]
表3、药物干预前后各组大鼠旷场实验不同区域活动路程的比较(n＝10)
[0112][0113]
注：snk-q两两比较：与阴性对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，##p《0.01。配对t检验：与药物干预前相比，
△
p《0.05，
△△
p《0.01。
[0114]
2.各组强迫游泳时间比较
[0115]
与阴性对照组比，药物干预前模型组、阳性药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组5组大鼠的游泳不动时间百分比提高显著，提示模型建立成功。
[0116]
分别用利培酮和脆弱拟杆菌荚膜多糖a三个剂量10天后，与模型组比较，阳性药组降低强迫游泳不动时间百分比有显著性差异，与模型组比较，脆弱拟杆菌荚膜多糖a低剂量组、中剂量组和高剂组降低强迫游泳不动时间百分比有显著性差异(p《0.01)。见表4。
[0117]
表4、药物干预后各组大鼠强迫游泳实验比较
[0118]
组别n不动时间百分比(％)阴性对照组1025
±
10模型组1063
±
14
**
阳性药组(利培酮)107.0
±
4.0
##
s1-psa低剂量组1016
±
16
##
s1-psa中剂量组1010
±
11
##
s1-psa高剂量组105.8
±
6.6
##
s4-psa低剂量组1019
±
15
##
s4-psa中剂量组1014
±
13
##
s4-psa高剂量组109
±8##
[0119]
注：snk-q两两比较：与阴性对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，##p《0.01。
[0120]
由以上实验结果可见，脆弱拟杆菌荚膜多糖a可以有效减轻精神分裂症模型动物拟精神分裂症的阳性症状，特别是方法1提供的脆弱拟杆菌荚膜多糖a治疗效果更显著。
[0121]
实施例3、脆弱拟杆菌荚膜多糖a联合阿立哌唑改善精神分裂症状的药效试验
[0122]
1.实验方法
[0123]
1)实验动物：用于实验的sprague-dawley(sd)大鼠(200-250g,雄性)均购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。分笼饲养(鼠笼规格：485mm
×
350mm
×
200mm)，室温保持在25℃
±
1℃，自由进食和饮水，用标准啮齿类动物饲料喂养，房间湿度维持在50％左右，明暗周期为12h。大鼠适应性喂养一周后进行实验，所有的行为学实验都在9:00-12:00完成。所有的动物实验过程严格遵守国际卫生研究机构关于动物使用伦理学的原则。
[0124]
2)实验分组：随机将110只sd大鼠分为11组，每组10只，分别为阴性对照组(空白对照)，模型组，阳性药组(阿立哌唑)，s2-psa低剂量组、s2-psa(低、中、高)联用阿立哌唑组，s3-psa低剂量组、s3-psa(低、中、高)联用阿立哌唑组。
[0125]
动物模型：对sd大鼠进行7.5mg/kg环苯己哌啶(pcp)，1次/d连续腹腔注射14d，成功建立精神分裂症大鼠模型。
[0126]
给药：具体给药方案见表5，各组灌胃容积为1ml/kg，连续灌胃10天。
[0127]
表5、分组及给药方案
[0128][0129]
3)高架十字迷宫实验
[0130]
十字迷宫是聚酯塑料制成，由两个开放臂和两个闭合臂十字交叉形成，开臂和闭臂均长30cm，宽5.8cm，闭臂有15cm高的围墙，迷宫整体离地50cm。四个臂中间交叉的正方形区域地叫中央区，上方装有摄像机记录(apple inc.,cupertino,california,usa)，能实时记录动物在十字迷宫的进臂行为。实验在安静且较暗照明环境下进行，在最后一次给药完成后20min，再迅速将笼中大鼠转移到行为学测试室中使其提前适应10min，等适应结束后后将大鼠背朝实验人员、面朝开臂方向，轻柔地放置在十字迷宫的的中央，让其自由探索5min，实验过程由中央区上方的摄像机记录，实验结束后再进行数据分析(noldus information technology,wageningen,netherlands)。检测分析系统自动对大鼠进入闭合臂和开放臂的次数和时间记录。测验完成后将大鼠放回饲养笼内，测试完一只大鼠后，用50％酒精溶液清洁十字迷宫气味，以免动物遗留的气味对后面测试动物的行为检测造成影响，每只大鼠只评价一次，掉落高架的大鼠数据不计入统计。
[0131]
4)脑组织中氧化应激水平的测定
[0132]
高架十字迷宫实验后，对大鼠进行深度麻醉，随后大鼠处死后在冰上解剖取脑组织。用事先冷冻的生理盐水进行匀浆，生理盐水的重量是脑组织的九倍，然后在低温离心机在3500rpm转速下离心10min，上清取出用相应试剂盒测定其超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛、一氧化氮的含量，用以评价大鼠脑内的氧化应激水平。
[0133]
5)前额皮层c-fos蛋白水平分析
[0134]
(a)总蛋白提取：取脑组织，分离大脑组织前额皮层组织样本。裂解液中加入含蛋白酶抑制剂pmsf(pmsf:ripa＝1:99)，在冰上用匀浆器匀浆1min，在4℃下摇床摇晃30min使组织裂解。然后用低温高速离心机在12000g转速下离心15min后取上清，测定上清液蛋白溶
度后。根据蛋白不同浓度进行稀释，使最终的上样体积相同。加入loading buffer后95℃煮沸变性10min，-20℃冰箱冷藏备用。
[0135]
(b)蛋白分析：等量(50μg)蛋白样本用10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳分离之后，转印到聚偏二氟乙烯膜(pvdf)上。5％脱脂奶粉室温封闭1h后分别4℃过夜孵育一抗兔抗大鼠c-fos。第二天用tbst清洗5min
×
6次后分别对应进行辣根酶标记的二抗(浓度均是1:5000)孵育2h。用tbst清洗pvdf膜5min
×
3次后抗原抗体结合，然后曝光，观察并记录。以β-actin作为内参，根据目标条带与内参β-actin的灰度值比值来计算蛋白表达量。
[0136]
6)数据处理与统计方法数据分析采用spss19.0软件，两组间的数据间比较用student’t检验分析方法，多组间的数据比较用方差分析(anova)方法，p《0.05表明差异具有统计学显著性意义，p《0.01表明差异具有统计学极显著性意义。实验数据用均数
±
标准差来(mean
±
sd)表示。
[0137]
2.实验结果与分析
[0138]
1)对高架十字迷宫行为学的影响
[0139]
根据大鼠进入开臂的次数占进臂总次数的百分比以及在开臂滞留时间占在臂滞留总时间的百分比这两个值作为评价焦虑的指标。这两个指标间一般呈高度相关。如果一个药物能使大鼠进入开臂的次数和在开臂滞留时间占总数的百分比增加，而同时不改变进臂的总次数，认为该药具有抗焦虑的作用。
[0140]
表6、荚膜多糖a联用阿立哌唑对高价十字迷宫行为的影响
[0141][0142][0143]
注：与阴性对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01。
[0144]
与阴性对照组相比，模型组的开臂次数占比显著降低(p《0.01)，说明小鼠出现焦虑情绪。联合用药组与阿立哌唑组的开臂次数占比相比模型组明显增加(p《0.05)，而联合用药组与阿立哌唑单独用药组的开臂次数占比无显著差异(p＞0.05)。
[0145]
与模型组相比，联合用药中、高剂量组的开臂时间占比显著增加(p《0.01)。
[0146]
2)对脑组织氧化应激水平的影响
[0147]
表7、对精神分裂症大鼠脑组织中sod、mda、no含量的影响
[0148][0149][0150]
注：与阴性对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01。
[0151]
与阴性对照组相比，模型组的脑组织中的mda显著增加(p《0.01)，而sod和no显著降低(p《0.01)。与模型组相比，联用药组和阿立哌唑组的mda含量下降明显(p《0.01)，sod和no含量明显增加(p《0.01)(表7)。另外，联用组的抗氧化性能好于阿立哌唑单独用药组。
[0152]
3)对前额皮层c-fos蛋白的影响
[0153]
c-fos蛋白是c-fos早期基因的蛋白产物，其表达水平常作为判断神经元活动高低的标志物，神经元的功能异常与c-fos蛋白的表达有一定的相关性。
[0154]
表8、对大鼠前额皮层中c-fos的影响
[0155]
组别c-fos/β-actin阴性对照组0.62
±
0.11模型组1.34
±
0.21
**
阳性药组(阿立哌唑)0.98
±
0.15
#
s2-psa低剂量组0.87
±
0.23
#
s2-psa(低)+阿立哌唑组1.12
±
0.18
##
s2-psa(中)+阿立哌唑组1.18
±
0.20
##
s2-psa(高)+阿立哌唑组1.22
±
0.09
##
s3-psa低剂量组0.91
±
0.17
#
s3-psa(低)+阿立哌唑组1.03
±
0.21
##
s3-psa(中)+阿立哌唑组1.10
±
0.10
##
s3-psa(高)+阿立哌唑组1.17
±
0.20
##
[0156]
注：与阴性对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，#p《0.05，##p《0.01。
[0157]
与对照组相比，模型组前额皮层中的c-fos蛋白显著(p《0.01)增加。与模型组相比，阿立哌唑和psa单独用药组(50,100,150mg/kg)均使c-fos蛋白含量降低。联合用药组均相对模型组显著降低了(p《0.01)大鼠的前额皮层的c-fos蛋白含量。
[0158]
本发明制备的脆弱拟杆菌荚膜多糖重均分子量为80kd-90kd，mw/mn为1.0-1.3，分子量分布于70kd-100kd的部分占总量的70％-80％；结合脂质含量低于0.02％，蛋白残留低于1％，核酸残留低于0.05％，该多糖对精神分裂症有防治作用，可开发应用于防治精神分裂症的药物、药物组合物。
[0159]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
[0160]
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
技术特征：1.脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治精神分裂症的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物为荚膜多糖a的提取物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的重均分子量为80kd-90kd。4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的提取物中脂质的质量低于0.02％。5.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述精神分裂症包括偏执型精神分裂、青春型精神分裂、紧张型精神分裂、单纯型精神分裂、未分化型精神分裂或者残留型精神分裂。6.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅料。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂和等渗或等张调节剂中的一种或者多种；优选地，所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种；优选地，所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种；或/和，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；优选地，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种；优选地，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；优选地，所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；优选地，所述溶剂选自水、油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；优选地，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种；优选地，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种；优选地，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；优选地，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇以及触变胶中的至少一种；优选地，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；优选地，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；优选地，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；优选地，所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种；优选地，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；优选地，所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；优选地，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。8.根据权利要求1至3和7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗
粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂口服液或者管饲制剂；或/和，所述药物的给药途径为注射给药或者口服给药。9.根据权利要求1至3和7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包含其他治疗精神分裂症药物。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述其他治疗精神分裂症药物选自阿力哌唑、利培酮、氯丙嗪、氯氮平、维思通、奥氮平和氟哌啶醇中的一种或者多种。
技术总结本发明提供一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治精神分裂症的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为CGMCC NO.10685，所述荚膜多糖提取物为荚膜多糖A的提取物。与传统技术相比，本发明具有如下有益效果：发明人经长期研究，发现脆弱拟杆菌ZY-312的荚膜多糖A能有效改善精神分裂症的症状，且该药效在氯氨酮诱导的精神分裂症动物模型得以验证。采用脆弱拟杆菌ZY-312的荚膜多糖A的提取物制备防治精神分裂症的药物还具有无毒副作用的优势。治精神分裂症的药物还具有无毒副作用的优势。治精神分裂症的药物还具有无毒副作用的优势。
技术研发人员：权利要求书2页说明书13页附图1页
受保护的技术使用者：广州知易生物科技有限公司
技术研发日：2022.02.16
技术公布日：2022/7/5
