1.本发明属于生物医药领域，涉及用于肝癌放疗增敏的药物组合物及其应用。
背景技术：2.原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma, phc）是常见的恶性肿瘤类型，严重威胁人民的生命和健康。phc的治疗方法主要包括肝切除术、肝移植术、局部消融治疗、放疗、肝动脉化疗栓塞（tace）及全身治疗等多种手段。然而，phc发病隐匿，确诊时大部分患者已达中晚期，并且伴有多发病灶及并发肝硬化等诸多因素，能获得手术切除机会的患者仅占20%-30%。
3.放射治疗（放疗）所用的x（或γ）射线是致电离辐射射线，这些高能射线具有波粒二象性，除了有波的性质外，还具有粒子性，即光子的性能。x（γ）光子和原子作用发生能量转移交换时促使电子被电离发生电离辐射。大量的研究已经证明，电离辐射的生物效应主要由对dna的损伤所致，一方面，射线直接导致核酸的碱基发生电离断裂（直接作用）；另一方面，由射线与细胞内的其他原子或分子（主要是水分子）相互作用，产生自由基，这些自由基可以扩散一定的距离，达到并损伤关键靶dna（间接作用）。
4.对于肝癌而言，放疗是针对无手术切除或局部消融治疗适应症患者的一个主要方法，可改善局部控制率，明显延长生存时间；也可减轻淋巴结、肺、骨、脑或肾上腺转移所致疼痛、梗阻或出血等症状；一部分无法手术切除的肿瘤放疗后缩小或降期，可转化为手术切除。然而，由于放疗在杀灭肿瘤细胞的同时，也会对肝脏正常组织造成损伤，肝脏放射性损伤后会造成诸多不利影响，藉此，放疗方案的剂量设计就不得超过周围正常组织耐受剂量，这样就会使肿瘤照射剂量不足，最终导致疗效不佳。因此，肿瘤对放疗的敏感性是影响患者预后的重要因素，那么，如何提高放疗敏感性进而减少放疗剂量和次数，是目前亟需解决的临床问题。
5.随着现代精确放疗技术的迅猛发展，以三维适形放疗（3d-crt）、调强适形放疗（imrt）与立体定向放疗（sbrt）等新技术为代表的放射治疗手段，联合手术、肝动脉栓塞化疗（tace）、系统性药物及免疫治疗已然成为原发性肝癌肝内或肝外病灶治疗的重要组成部分。近年来，新放疗技术被逐渐应用于phc的治疗，其放疗后3年生存率可达30%左右；经过预测，65%的原发性肝癌患者在疾病进展的某一或某些阶段需要接受放疗。藉此，nccn指南及csco指南均推荐放疗（根治性或者姑息性）作为原发性肝癌的标准治疗方案。具体在放疗剂量的选择上，一般采用常规分割放射（2gy/天，5次/周，总剂量为50-62gy）方式，这种长程小剂量放疗可以实现对正常肝组织的放射剂量维持在限量以下，又能明显杀伤靶区内肿瘤。
6.然而，对于需在短期内明显控制肿瘤进展的患者，更适用于大分割放射（5gy/次，3次/周，总剂量为50gy）短程治疗模式，这种方式会使肿瘤退缩较快，症状改善明显，但是对正常肝脏的放射损伤较大。射线对正常肝组织的照射剂量累积到一定程度会造成患者在治疗期间出现不良反应，较为严重的直接影响到放疗方案的执行。另外，在放疗结束后一部分患者还会发生典型的或非典型的放射性肝病（rild），以上这些都会给预后带来诸多不利影
响。因此，需要寻找解决方案来实现“既安全，疗效又能保证”的要求，一方面要在技术上精进，实现更加精准的定位和设计；另一方面，就是要筛选鉴定出介导肝癌放疗抵抗的关键靶点，并且基于其作用机制发展一系列干预策略，用于提升肝癌放疗敏感性。
技术实现要素：7.本发明的目的在于解决现有技术中利用治疗前临床分期来预估放化疗敏感性所存在的局限性，从而提供了一种用于肝癌放疗增敏的药物组合物及其应用。通过抑制usp14的表达，可以有效提高肝癌细胞对放疗的敏感性，增加放疗效果；同时通过检测体内生物标记物usp14的表达量，可以预测放疗耐受情况，为后期的治疗方案的制订以及预后评估提供辅助诊断依据。
8.为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
9.本发明第一方面提供了一种用于提高肝癌放疗敏感性的药物组合物，包括usp14抑制剂。
10.作为优选地，所述usp14抑制剂选自小分子化学药物和/或基于usp14设计的sgrna。
11.作为优选地，所述小分子化学药物结构式如下所示：。
12.作为优选地，所述基于usp14设计的sgrna序列选自seq id no：1-seq id no：5中的一种或多种。
13.作为优选地，所述放疗选自光子线放疗。
14.作为优选地，所述光子线放疗选自x射线放疗和/或γ射线放疗。
15.本发明第二方面提供了usp14抑制剂在制备用于提高肝癌放疗敏感性的药物中的应用。
16.作为优选地，所述usp14抑制剂选自小分子化学药物和/或基于usp14设计的sgrna。
17.作为优选地，所述小分子化学药物结构式如下所示：
。
18.作为优选地，所述基于usp14设计的sgrna序列选自seq id no：1-seq id no：5中的一种或多种。
19.作为优选地，所述放疗选自光子线放疗。
20.作为优选地，所述光子线放疗选自x射线放疗和/或γ射线放疗。
21.本发明第三方面提供了一种用于检测肝癌放疗敏感性和/或疗效的试剂盒，包括检测usp14基因表达水平的引物和/或检测usp14蛋白含量的试剂。
22.作为优选地，所述所述检测usp14基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：引物对1：上游引物序列如seq id no：6所示，下游引物序列如seq id no：7所示；引物对2：上游引物序列如seq id no：8所示，下游引物序列如seq id no：9所示；引物对3：上游引物序列如seq id no：10所示，下游引物序列如seq id no：11所示；引物对4：上游引物序列如seq id no：12所示，下游引物序列如seq id no：13所示；引物对5：上游引物序列如seq id no：14所示，下游引物序列如seq id no：15所示。
23.引物对6：上游引物序列如seq id no：16所示，下游引物序列如seq id no：17所示；引物对7：上游引物序列如seq id no：18所示，下游引物序列如seq id no：19所示；引物对8：上游引物序列如seq id no：20所示，下游引物序列如seq id no：21所示；引物对9：上游引物序列如seq id no：22所示，下游引物序列如seq id no：23所示；引物对10：上游引物序列如seq id no：24所示，下游引物序列如seq id no：25所示。
24.作为优选地，所述检测usp14蛋白含量的试剂选自usp14单克隆抗体和/或多克隆抗体；最优选地，所述检测usp14蛋白含量的试剂选自cell signaling technology公司的usp14 (d8q6s) rabbit mab（货号：11931）。
25.作为优选地，所述放疗选自光子线放疗。
26.作为优选地，所述光子线放疗选自x射线放疗和/或γ射线放疗。
27.作为优选地，所述试剂盒中还包含pcr酶、pcr缓冲液、dntps、荧光底物中的一种或多种。
28.本发明第四方面提供了检测usp14表达水平的试剂在制备用于检测肝癌放疗敏感性和/或疗效预测的产品中的应用。
29.作为优选地，所述检测usp14表达水平的试剂包括检测usp14基因表达水平的引物和/或检测usp14蛋白含量的试剂。
30.作为优选地，所述检测usp14基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对。
31.引物对1：上游引物序列如seq id no：6所示，下游引物序列如seq id no：7所示；引物对2：上游引物序列如seq id no：8所示，下游引物序列如seq id no：9所示；引物对3：上游引物序列如seq id no：10所示，下游引物序列如seq id no：11所示；引物对4：上游引物序列如seq id no：12所示，下游引物序列如seq id no：13所示；引物对5：上游引物序列如seq id no：14所示，下游引物序列如seq id no：15所示。
32.引物对6：上游引物序列如seq id no：16所示，下游引物序列如seq id no：17所示；引物对7：上游引物序列如seq id no：18所示，下游引物序列如seq id no：19所示；引物对8：上游引物序列如seq id no：20所示，下游引物序列如seq id no：21所示；引物对9：上游引物序列如seq id no：22所示，下游引物序列如seq id no：23所示；引物对10：上游引物序列如seq id no：24所示，下游引物序列如seq id no：25所示。
33.作为优选地，所述检测usp14蛋白含量的试剂选自usp14单克隆抗体和/或多克隆抗体；最优选地，所述检测usp14蛋白含量的试剂选自cell signaling technology公司的usp14 (d8q6s) rabbit mab（货号：11931）。
34.作为优选地，所述放疗选自光子线放疗。
35.作为优选地，所述光子线放疗选自x射线放疗和/或γ射线放疗。
36.在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述引物和/或引物对组是指用于在pcr中合成usp14基因cdna链的pcr引物，从而用于检测usp14基因的表达水平。
37.去泛素化酶（dubs）是将泛素化修饰的蛋白底物的泛素连接剪除的一类功能酶，与泛素连接酶系统功能相反。近年来陆续有研究报道，dubs除了参与正常机体的调控之外，在应激条件下也能快速反应剪除靶蛋白泛素化修饰维持蛋白稳态和功能，有助于细胞缓解外界给予的压力。发明人在研究中发现，去泛素化过程可能对于肝癌放疗耐受诱导存在一定关联。对于此，发明人设计并构建了包含不同类别dubs的sgrna文库，利用此sgrna文库，发现包含usp14在内的多个dubs分别有两条sgrna满足相应的筛选条件，提示这些dubs的缺失
可能会提升肝癌细胞的放疗敏感性。而在随后的进一步研究中发现，usp14的缺失能够大幅度提升肝癌细胞对放疗的敏感性，即在肝癌细胞中usp14明显表现出了介导放疗耐受的功能。
38.而深入的机制研究发现，usp14对放疗耐受产生的主要原因在于：usp14能够快速感知放疗的信号，锁定已泛素化的gpx4和trxr1，解除它们的泛素化状态，进而维持了gpx4和trxr1的稳定性与活性状态，促使slc7a11-gsh-gpx4及trxr-trx双还原系统构筑的铁死亡防御体系得以持续激活，加快脂质过氧化物的清除，最终导致铁死亡的耐受。
39.进一步地，发明人在体外细胞水平进行了功能验证，在hepg2细胞中，经放射干预后，发现稳定敲usp14能显著提升放疗敏感性。在huh7细胞中进一步验证功能，发现稳定敲降usp14均能增敏放疗。此后的体内实验也验证了usp14与放疗耐受的相关性。基于以上功能结果可以明确usp14为肝癌放疗耐受相关基因。
40.本发明相对于现有技术具有如下技术效果：（1）本发明基于lentiv2-sgrna文库与二代测序结合的高通量筛选建立放疗耐受相关基因筛选模型，该筛选模型具备覆盖面广，灵活性强，通量大等特点，可以较为精准的捕获与放疗耐受相关的基因。本发明精确筛选出包含usp14在内的多个未报道的肝癌放疗耐受相关dubs。
41.（2）本发明首先发现去泛素化过程有助于介导肝癌耐受，藉此，通过筛选鉴定，首次提出usp14是通过协助构筑铁死亡防御来促进肝癌放疗抵抗的，为明晰肝癌放疗耐受提供了一种新的分子机制。
42.（3）本发明利用专业药物设计软件进行理性设计与优化，获得一类具备新型结构的高活性usp14抑制剂，为肝癌放疗增敏创新药物的发展提供了坚实的依据，为探究铁死亡防御构筑新的机制提供了一种新的研究方向。
43.（4）本发明首次分析了usp14水平与放疗后肿瘤退缩及预后预测的相关性，其可能会为肝癌放疗敏感性与预后预测提供有效的生物标志物及分子靶标，具有广阔的临床应用价值和社会意义。
附图说明
44.图1为usp14敲除后对hepg2细胞放射敏感性影响示意图。
45.图2为usp14敲除后对huh7细胞放射敏感性影响示意图。
46.图3为usp14敲除后对肿瘤生长影响示意图。
47.图4为usp14敲除后对肿瘤生长影响定量结果示意图。
48.图5为usp14敲除后对肿瘤生长曲线影响示意图。
49.图6为usp14敲除后的hepg2细胞中回补usp14野生型或usp14失活突变型（cys-114-ala）对放射敏感性的影响。
50.图7为放疗前后细胞中usp14定位变化情况示意图。
51.图8为dna损伤的同源重组修复（hr）与非同源末端链接修复（nhej）报告系统原理示意图。
52.图9为肝癌细胞中usp4敲除对hr与nhej修复影响流式结果示意图。
53.图10为肝癌细胞中usp4敲除对hr于nhej修复影响定量分析结果示意图。
54.图11为肝癌细胞中在放疗后引发脂质过氧化结果示意图。
55.图12为肝癌细胞中在放疗后引发铁死亡结果示意图。
56.图13为usp14对放疗后引发脂质过氧化结果示意图。
57.图14为usp14对放疗后引发铁死亡结果示意图。
58.图15为usp14敲除对脂质过氧化物的“产生”和“清除”相关的蛋白水平的影响结果示意图。
59.图16为在usp14敲除细胞中导入野生型和失活突变型的usp14对放疗后gpx4/trxr1蛋白水平的影响结果示意图。
60.图17为放疗前后usp14与gpx4/trxr1的互作情况影响示意图。
61.图18为肝癌细胞中在usp14存在下，敲除gpx4与外加trxr抑制剂后放疗引发脂质过氧化的影响示意图。
62.图19为肝癌细胞中在usp14敲除下，敲除gpx4与外加trxr抑制剂后放疗引发脂质过氧化的影响示意图。
63.图20为不同处理方式对小鼠体内肿瘤生长体积的影响示意图。
64.图21为不同处理方式各组内小鼠体内肿瘤生长体积的影响示意图。
65.图22为不同处理方式对荷瘤小鼠体重影响示意图。
66.图23为不同处理方式对荷瘤小鼠总体生存率影响示意图。
67.图24为肿瘤组织内肿瘤细胞中usp14表达水平对肝癌放疗患者总体生存率影响示意图。
具体实施方式
68.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
69.在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括hepg2、huh7、h22及skhep-1等细胞系均按照现有技术进行培养，所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）短串联重复分析鉴定，并使用pcr检测试剂盒（上海biothrive sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如dna提取、全基因组测序、引物设计、免疫组化、western blot、细胞实验、动物实验等均为本领域的常规方法和技术。
70.生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean
±
sd和mean
±
sem展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验至少重复两次。数据采用graphpad prism 8.0或spss 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
71.实施例1 肝癌放疗耐受基因的筛选（1）将包含88个dubs（含268条sgrna）的人类慢病毒载体sgrna文库（lentiv2 human pooled sgrna）转染至sk-hep-1细胞中；
triton-x-pbs 1ml将其溶解；一抗：按照抗体说明书按比例用抗体稀释液配置一抗；二抗：按1:1000的比例用抗体稀释液配置荧光二抗，注意避光，注意不同种属的二抗需选用不同波长的荧光；dapi：用pbs将dapi配置成1ug/ml。
79.（2）细胞处理：干预过程需在玻璃底培养皿中进行，干预结束后，弃培养基，用pbs清洗3次；（3）固定：弃pbs，加入多聚甲醛1ml，室温固定20min；（4）洗涤：弃多聚甲醛，加入pbs 1ml，垂直摇床60rpm室温洗涤5min，重复3次；（5）封闭：弃pbs，加入封闭液，37℃封闭1h；（6）一抗孵育：弃封闭液，加入一抗，覆盖玻璃面即可，4℃孵育过夜，注意同时检测两种蛋白时，需选用不同种属的一抗；（7）洗涤：回收一抗（可重复使用2～3次），加入pbs 1ml，垂直摇床60rpm室温洗涤5min，重复3次；（8）二抗孵育：从这一步开始，以下须避光操作；弃pbs，加入二抗，覆盖玻璃面即可，避光室温孵育1h；（9）洗涤：弃二抗，加入pbs 1ml，垂直摇床60rpm避光室温洗涤5min，重复3次；（10）细胞核染色：弃pbs，加入dapi，覆盖玻璃面即可，避光室温孵育2min；（11）洗涤：弃dapi，加入pbs 1ml，垂直摇床60rpm避光室温洗涤5min，重复3次；（12）用激光共聚焦显微镜观察、拍照。
80.检测结果如图7所示，结果显示，在采用剂量为6gy的放疗处理6h后，usp14由核内向胞质、胞质内向细胞膜处聚集，效应明显。
81.同源重组修复（hr）和非同源末端连接（nhej）修复是细胞应对dna dsbs损伤的两种主要修复方式。因此，我们着重考察usp14是否影响了这两种dna的修复方式，利用hr和nhej的报告系统实验来完成验证。报告质粒检测nhej和hr活性的原理如图8所示。nhej报告质粒是在gfp的中间插入一段序列，序列前后有i-scei内切酶切割位点，当使用i-scei和nhej质粒共转细胞后，首先切除红色部分ad exon，形成末端不匹配的dna双链断裂；若有nhej修复发生，则该双链重新连接，使gfp正常表达，从而能通过流式检测绿色荧光。hr报告质粒是由一个中间存在22个碱基缺失的gfp和一个缺少atg启动子的第一段gfp外显子组成，而第一段的gfp片段中的22个碱基两端拥有i-scei的内切酶切割位点。i-scei酶切割导致第一个gfp出现双链断裂且缺失22个碱基，发生hr修复时，缺乏atg的第一段gfp被用作同源模板修复前一个gfp的dsb-22个碱基缺失，完成同源重组修复，正常表达gfp。我们通过分析gfp阳性细胞占比来判断这两种修复通路的活性。
82.具体操作上，利用慢病毒使肝癌细胞（hepg2）稳定表达hr或nhej报告质粒，用g418筛选稳定细胞株。而后，向细胞中瞬时转染pcmv-nls-i-scei和pcmv-dsred质粒，48h后，通过流式细胞仪检测细胞的红、绿荧光比例，hr/nhej修复效率=绿色荧光细胞比例/红色荧光细胞比例。结果如图9-10所示。结果显示，在肝癌细胞中敲除usp14后对hr/nhej修复效率不产生影响。
83.进一步地，利用序列为seq id no：2-seq id no：5所示的sgrna（分别对应sgrna-2~sgrna-5）重复上述实验，结果与之类似，即sgrn-2~sgrna-5能够成功敲除hepg2细胞内usp14，经usp14敲除后的hepg2细胞对hr/nhej修复效率不产生影响。
84.实施例3 放疗诱导肝癌细胞发生脂质过氧化与usp14的关系研究（1）分别对hepg2、skhep1、huh7以及snu449细胞进行放射处理（ir-6gy）；（2）放射处理24h后，利用bodipy 581/591 c11 dye染料分别对四种细胞细胞膜上的过氧化脂质（pufa-pls-ooh）进行染色，随后通过流式细胞仪进行检测，检测结果如图11所示；（3）在hepg2和skhep1细胞中提前加入铁死亡抑制剂（ferrostatin-1，fer-1，5μm）；（4）孵育2h后，对细胞进行放射处理（hepg2-6gy，skhep1-12gy）；（5）放射处理72h后，通过cck8检测细胞生存率，检测结果如图12所示。
85.结果显示，放疗（ir-6gy）后24小时，能诱导四株细胞（hepg2/skhep1/huh7/snu449）发生脂质过氧化；且与与dmso对照组相比，ferrostatin-1的加入能够明显提高细胞的生存率，促进放疗耐受。
86.随后，在usp14敲除（sgrna-1，敲除方法同实施例2）的细胞中重复上述实验。流式检测结果显示，放疗后，usp14敲除能大幅度增加脂质过氧化的程度（参见图13）；cck8检测的结果显示，usp14-ko组在提前加入ferrostatin-1孵育后，对放疗产生的杀伤作用和dmso对照组之间不存在显著性差异，和usp14-wt组的差异完全不同（参见图14）。
87.进一步地，利用序列为seq id no：2-seq id no：5所示的sgrna（分别对应sgrna-2~sgrna-5）重复上述实验，结果与之类似，即sgrn-2~sgrna-5能够成功敲除hepg2、skhep1、huh7以及snu449细胞内usp14，经usp14敲除后均能能大幅度增加细胞内脂质过氧化的程度，且ferrostatin-1的加入对于usp14-ko细胞放疗杀伤作用于对照组间无显著性差异。
88.实施例4 usp14对pufa-pls-ooh相关的蛋白的影响对hepg2细胞进行放射处理6h（6gy），放射6h后收获细胞提取蛋白，采用western blot（wb）检测放疗前后usp14缺失（利用sgrna-1进行敲除，敲除方法同实施例2）与否对pufa-pls-ooh的“产生”和“清除”相关的蛋白水平的影响。检测结果如图15所示。
89.结果显示，1、产生环节：放疗前后，usp14存在与否对acac、lpcat3等关键酶和铁平衡相关的fth1、ncoa4的水平影响不大；acsl4则是在放疗后略微上升，然而这一过程与usp14无关。2、清除环节：放疗后，在usp14缺失的情况下gpx4与trxr1蛋白水平都出现了大幅度的下降，在usp14存在的情况下gpx4与trxr1则是略有上升。然而，在未放疗组中，usp14的缺失并未影响到gpx4或trxr1的水平；而对于slc7a11，fsp1或gch1等因子，放疗后水平都出现了不同程度的上升，与usp14存在与否无关。
90.随后，在hepg2-usp14-ko细胞中，通过分子克隆的手段分别外源导入野生型（wt）及失活突变型（c114a）的usp14，以空载体（vector）作为对照，来观察放疗前后对gpx4或trxr1的影响，具体为：采用放射剂量6gy的射线处理细胞，放射6h后收取细胞蛋白，通过wb进行相关蛋白的检测。检测结果如图16所示。结果显示，在usp14-ko株中回补usp14（wt），能显著提升放疗后gpx4或trxr1的蛋白水平，然而，回补usp14（c114a）则不能挽救放疗诱导gpx4或trxr1水平的下调。
91.采用上述同样方法对细胞进行处理后，通过免疫共沉淀-蛋白免疫阴极（co-ip-wb）的手段，拉取沉降带flag标签的usp14，检测与其互作蛋白的水平。检测结果如图17所示。结果显示，在放疗后2h，就可以明显看到usp14与gpx4和trxr1的相互作用。
92.进一步地，为了明确usp14是否通过维持gpx3和/或trxr1的稳态来介导铁死亡耐受，在hepg2的usp14-wt与usp14-ko细胞中，敲除gpx4，再进行放射（剂量为6gy），24小时后通过流式细胞仪进行检测，检测结果如图18-19所示。结果显示，在usp14-wt的细胞中敲除gpx4，放疗后，相比于对照组能略微提升脂质过氧化的程度；然而，在加入trxr抑制剂trxri-2a预处理6小时，再进行放疗的结果，相比于对照组，引发脂质过氧化的程度更大；在usp14-ko的细胞中敲除gpx4，无论是否加入trxri-2a抑制剂预处理，放疗后与gpx4-wt的细胞相比，脂质过氧化的程度均处于较高的水平，组间未见明显的差异。更进一步地利用序列为seq id no：2-seq id no：5所示的sgrna（分别对应sgrna-2~sgrna-5）重复上述实验，结果与之类似。
93.实施例5 usp14抑制剂在体内对放疗增敏的功能研究（1）选取鼠源肝癌细胞系h22进行小鼠皮下成瘤，构建裸鼠荷瘤模型；（2）成瘤后，将小鼠随机分为4组，编号为1-4，每组6只；（3）对组1小鼠不进行任何处理，组2小鼠给予usp14抑制剂，剂量为1mg/kg，给药方式为灌胃，连续给药9天；组3小鼠给予x射线处理（rs2000 x线辐射仪，源皮距以100cm为标准，采用中长程日均等剂量照射；非瘤区采用小鼠专用铅制配套容器遮挡），1gy/天，连续处理10天；组4小鼠给予usp14抑制剂，剂量为1mg/kg，给药方式为灌胃，连续给药9天，同时给予x射线处理（rs2000 x线辐射仪，源皮距以100cm为标准，采用中长程日均等剂量照射；非瘤区采用小鼠专用铅制配套容器遮挡），1gy/天，连续处理10天；其中usp14抑制剂结构式如下所示：；（4）治疗期间定期测量小鼠肿瘤体积，治疗结束后记录小鼠生存时间，并测量终末期小鼠体重。
94.结果如图20-23所示。结果显示，使用x射线放射处理的组3对于小鼠肿瘤生长作用具有一定的抑制作用；而使用usp14抑制剂进行处理后，并没有对小鼠肿瘤生长产生明显的抑制作用，其与对照组组1无显著性差异；当同时使用usp14抑制剂与x射线处理时，能够更为显著地抑制小鼠体内肿瘤的生长；同时usp14抑制剂和x射线联合处理，相对于单独x射线处理的组3，小鼠总体生存率获得了更为明显的提升。
95.进一步地，选取鼠源肝癌细胞系h22，采用实施例2中方法构建usp14敲低（sgrna-3）细胞株，使用wb验证加入四环素诱导后过表达与敲低的情况；中构建好的usp14-dox敲降细胞进行皮下成瘤，构建裸鼠荷瘤模型。通过喂养四环素-蔗糖溶液来实现诱导表达，以单蔗糖溶液组作为对照。成瘤后采用瘤区辐照方式（rs2000 x线辐射仪，源皮距以100cm为标
准，采用中长程日均等剂量照射；非瘤区采用小鼠专用铅制配套容器遮挡），2gy/天，连续7天，定期测量肿瘤体积，比较不组在经放疗或为放疗后的肿瘤生长情况。在治疗后4周处死，剥离肿瘤，称重，各个放疗组与对应的未放疗对照组比较，计算抑瘤率。
96.试验结果与上述类似。结果显示，在利用靶向usp14的sgrna-1对细胞内usp14表达进行敲低后，相对于usp14正常表达的小鼠，在进行放疗处理后对小鼠体内肿瘤的抑制率得到了明显的提升，该差异相对于usp14正常表达组具有统计学意义（图中未示出）；利用sgrna-2~sgrna-5重复上述试验，取得了相类似的结果，在此不再赘述。
97.综合上述结果可知，通过对细胞内usp14的表达进行抑制，能够有效提高肝癌治疗过程中对于放疗的敏感性，从而抑制或逆转放疗耐受性，提高放疗的治疗效果。
98.实施例6 usp14对放疗治疗的肝癌患者生存情况研究（1）选取中山大学附属第一医院原发性肝癌患者治疗前活检样本77例；对于每个入选病例，患者入选要求为确诊肝癌；既往未接受过放化疗，未接受肝癌手术；无肿瘤出血、急慢性感染等合并症状。对于所有纳入研究的病例，其临床病理资料均来自于中山大学附属第一医院病案报告，相应的随访资料来自于中心随访科。患者的肿瘤分级均按照uicc/ajcc（第八版）的标准分级。病人在放疗结束后两年内每三个月随访一次，放疗结束后三到四年内每半年随访一次，放疗结束后五年及以后每一年随访一次，随访记录患者复发/转移/死亡情况并记录日期；（2）将活检新鲜组织包埋于石蜡封存，石蜡标本室温保存，切取的白片保存于4℃冰箱。实验时取出77例石蜡切片白片，经过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、0.3% h2o2溶液去除组织中过氧化物酶、枸橼酸盐溶液微波修复、cell signaling technology 公司anti-usp14抗体（1：200）和相应种属二抗孵育、dab与苏木素显色、盐酸酒精分化、梯度酒精脱水，二甲苯通透两次后，中性树胶封片；（3）组织标本的染色评估由100-200
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倒置显微镜拍照，整个组织面取5-10个视野/病例。评分方式：ihc染色后由两名以上病理科医生对蛋白水平进行双盲评分，评分根据染色强度和染色面积两大指标采用12分法：染色强度分为强阳性（3分）、阳性（2分）、弱阳性（1分）、阴性（0分），染色面积分为0-25%（1分）、25%-50%（2分）、50%-75%（3分）、75%-100%（4分），总评分=染色强度分数
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染色面积分数；（4）所有患者术均采用常规长程小剂量放疗方式进行治疗，2gy*25次；（5）根据77例肝癌病例的总生存期数据，利用roc曲线最高特异性和最强灵敏度的点来确定usp14的表达临界值（cutoff＝7），将usp14分为高表达和低表达两个等级，然后使用spss 20.0软件中的kaplan-meier方法对病人预后进行分析。
99.其中高水平表达是指cutoff评分≥7；cutoff指免疫组化染色强度
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阳性比率。
100.结果如图19所示，结果显示，肿瘤组织中低表达usp14（cutoff＜7）的患者其总生存率显著长于肿瘤组织中高表达usp14（cutoff≥7）的患者，进一步表明usp高表达水平与肝癌放疗效果存在明显相关性，并且与不良预后正相关，阐明了usp14是肝癌放疗的耐受因素，能够指示患者对放疗的敏感程度。
101.由上述可以明确，usp14是一个与肝癌等放疗耐受极为相关的基因，usp14较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测肝癌等放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。同时，本发明通过揭示usp14基因与肝癌等
放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为大幅度提升肝癌疗效提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。
102.以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
技术特征：1.usp14抑制剂在制备用于提高肝癌放疗敏感性的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述usp14抑制剂选自小分子化学药物和/或基于usp14设计的sgrna。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化学药物结构式如下所示：。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基于usp14设计的sgrna序列选自seq id no：1-seq id no：5中的一种或多种。5.一种用于提高肝癌放疗敏感性的药物组合物，其特征在于，包括usp14抑制剂，所述usp14抑制剂选自小分子化学药物和/或基于usp14设计的sgrna，所述小分子化学药物结构式如下所示：；所述基于usp14设计的sgrna序列选自seq id no：1-seq id no：5中的一种或多种。6.检测usp14表达水平的试剂在制备用于检测肝癌放疗敏感性和/或疗效预测的产品中的应用。
技术总结本发明涉及一种用于肝癌放疗增敏的药物组合物及其应用。本发明通过研究发现，USP14是一个与肝癌等放疗耐受极为相关的基因，USP14较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的正相关性，可以用以预测肝癌等放疗耐受以及敏感程度，为患者接受术前治疗的联系提供提前评估。同时，本发明通过揭示USP14基因与肝癌等放疗耐受的关联性，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类大幅度提升肝癌放疗疗效提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。前景。前景。
技术研发人员：岳欣 彭振维 王雪涔 陈勇
受保护的技术使用者：中山大学附属第一医院
技术研发日：2022.05.24
技术公布日：2022/7/5
