一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法
技术领域
1.本发明涉及基因重组技术领域，具体涉及一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法。
背景技术：2.重组蛋白技术是利用基因工程的方法，将体外获得的目的蛋白dna，连接到表达载体上，构建好的表达载体转染到目的细胞内，通过体外培养从而获得目的蛋白质，目前，体外重组蛋白的生产主要分为真核表达系统和原核表达系统两大类：原核表达系统主要利用大肠杆菌e coli，作为表达菌株，其优点是，成本低，效率高，对环境要求低，缺点是，所表达蛋白经常以包涵体形式存在，蛋白无法正常折叠，呈现正确的三维结构，导致所表达的蛋白没有活性，虽然包涵体可以通过复性方法恢复部分蛋白的活性，但复性过程复杂，复性得率低，往往得不到满意的结果，真核表达系统又包括：哺乳动物表达系统(293f chos)，酵母表达系统(s.cerevisiae酵母，pichia酵母)，杆状病毒昆虫表达系统(sf9,sf21)，生长激素(gh)，是生长因子家族的成员，包括催乳素、胎盘催乳素、增殖素和生长激素(1,2)，它主要由垂体前叶的生长激素合成，并储存在分泌颗粒中，gh进入循环的脉冲释放受下丘脑激素、gh释放激素(ghrh)和生长抑制素(sst)－以及外周信号—生长素释放肽(periphery ghrelin)和瘦素(leptin)的协同作用调节，犬生长激素(growth hormone，gh)是由犬脑垂体前叶分泌的一种肽类激素，由190个氨基酸组成，能促进骨骼、内脏和全身生长，促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢，在身体生长发育中起着关键性作用，缺乏生长激素的狗类往往发育不健全，俗称狗侏儒症，据不完全统计，全社会当中饲养宠物得到人数6000多万，其中以宠物狗和宠物猫居多，宠物狗同人类一样，也会患上侏儒症，如果不加以干预，宠物狗最终会走向死亡对于宠物狗来说，此类遭遇是非常不幸的。针对现有技术存在以下问题：
3.通过注射生长激素虽然可以有效解决患有侏儒症的狗类生长缓慢问题，但是目前狗类注射的生长激素为牛来源的生长激素，效果较差，而且大肠杆菌表达系统得率低，活性差，且生长激素用于狗类生长稳定性较差，安全性低，且成本较高。
技术实现要素：4.本发明提供一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，解决了通过注射生长激素虽然可以有效解决患有侏儒症的狗类生长缓慢问题，但是目前狗类注射的生长激素为牛来源的生长激素，效果较差，而且大肠杆菌表达系统得率低，活性差，且生长激素用于狗类生长稳定性较差，安全性低，且成本较高的问题。
5.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
6.一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，由以下步骤组成：
7.步骤一、目的基因的合成，在ncbi网站，查找growth hormone(gh)基因序列，以dog cdna文库为模板，利用设计的上游引物和下游引物进行pcr扩增获得growth hormone(gh)目的基因片段，growth hormone(gh)基因本身带有信号肽，设计引物时不包含信号肽序列；
8.步骤二、目的基因测序，对通过pcr方法获得的growth hormone(gh)目的基因进行测序，所述pcr扩增的条件为：95℃1min预变性，94℃30s、55℃30s、72℃50s，25-30个循环，72℃延伸5min，pcr结束后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，利用tiangen的胶回收试剂盒，回收目的片段，测定浓度后，送测序公司测序；
9.步骤三、growth hormone(gh)基因和表达载体的连接，将测序正确的目的基因片段growth hormone(gh)和载体ptzy1分别用限制性内切酶ecori/xhoi酶进行双酶切，然后通过t4连接酶将酶切后的基因片段growth hormone(gh)和经过ecori/xhoi双酶切的载体ptzy1进行连接获得重组质粒ptzy1-gh，按照目的基因和载体摩尔比3：1的比例，加入t4连接酶16℃连接过夜；
10.步骤四、重组质粒ptzy1-gh的转化，将所述步骤三获得的重组质粒ptzy1-gh采用热激转化的方式导入到大肠杆菌dh5α感受态细胞中进行培养，之后提取重组质粒ptzy1-gh；
11.步骤五、重组质粒的酶切鉴定，将提取的重组质粒用ecori/xhoi双酶切，37℃水浴锅酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；
12.步骤六、无内毒素质粒提取，利用invitrogen无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，用于chos细胞转染；
13.步骤七、chos(仓鼠卵巢)细胞的转染，待到所述步骤五的鉴定结果通过后，将所述步骤六中提取的无内毒素重组质粒ptzy1-gh转染到chos(仓鼠卵巢)细胞中，转染结束后，细胞继续培养4-5天，之后将细胞连同培养上清转移到离心瓶中，5000rpm离心10min并收取上清，弃掉细胞，转染前将chos细胞密度调整为2.0
×
106/ml，不得超过4.0
×
106/ml，采用对数生长期的细胞进行转染，细胞存活率95％以上，转染试剂和质粒质量比为2.5：1，转染试剂为pei25000，稀释液为150mmnacl 25mm hepes，加入顺序为：质粒—孵育5min—转染试剂；
14.步骤八、目的蛋白的纯化，将所述步骤七中收取的上清通过roche的ni离子亲和柱亲和纯化ptzy1-gh蛋白，经sds-page还原和非还原电泳，获取到纯度达到98％以上，单一条带的重组dog gh，经wb鉴定即为growth hormone(gh)，目的蛋白纯化条件为，pbs平衡亲和柱，50mm咪唑洗脱杂蛋白，500mm咪唑洗脱目的蛋白，具体鉴定过程为：将20-100ng不等的蛋白通过湿转电泳仪，转移到pvdf膜上，4℃一抗(商业化抗gh抗体)孵育过夜，pbst漂洗3次，每次5min,5％脱脂牛奶37℃封闭1h，37℃标记有hrp的二抗孵育1h，pbst漂洗3次，每次5min。加入ecl发光底物，暗室曝光胶片，经过分子量比对，结果显示上述所表达目的蛋白为重组dog growth hormone(gh)，还原非还原电泳条件为：非还原电泳loading buffer不含有dtt；
15.步骤九、验证所表达目的蛋白是否具有二硫键，并验证细胞的增殖活性，将所述步骤八中所获目的蛋白分别进行还原和非还原电泳，验证所表达目的蛋白是否具有二硫键，对目的蛋白去内毒素后，加入到nb2-11 rat lymphoma cells中，验证其对细胞的增殖活性，将nb2-11 rat lymphoma cells按照每孔5000cells的密度接种到96孔板中，培养24h后，加入各种浓度的重组dog growth hormone，做好阴性对照，培养48h后，利用cell counting kit-8(cck-8)测定细胞增殖，每孔加入10ulcck-8试剂，孵育1h后，450nm测定吸光值，计算ed50。
gcccagcaga gaaccgacat ggaattgctt cgcttctcgc tgctgctcat ccagtcatgg ctggggcccg tgcagttcct cagcaggatt ttcaccaaca gcctgatgtt cggcacctcg gaccgtgtct atgagaaact gaaggacctg gaagagggca tccaggctct gatgcaggag ctggaagatg gcagcccccg tgttgggcag atcctcaagc aaacctatga caagtttgac gccaacatgc gcagcgacga cgcgctgctc aaaaactatg ggctgctctc ctgcttcaag aaggacctgc acaaagcgga gacctacctg cgggtcatga agtgtcgccg ctttgtggaa agcagctgtg ccttctag
32.氨基酸序列为：fpam plsslfanav lraqhlhqla adtykefera yipegqrysi qnaqaafcfs etipaptgkd eaqqrsdvel lrfsllliqs wlgpvqflsr vftnslvfgt sdrvyeklkd leegiqalmr eledgsprag qilkqtydkf dtnlrsddal lknygllscf kkdlhkaety lrvmkcrrfv esscaf经过计算蛋白分子量大小为22kd.
33.上游引物为：cggaattcttcccggccatgcccttg下游引物为：ccgctcgagctagaaggcacagctgctttccac引物两端添加酶切位点和保护碱基，酶切位点为：ecori/xhoi pcr扩增的条件为：95℃1min预变性，94℃30s、55℃30s、72℃50s，25-30个循环，72℃延伸1min；pcr反应的体系为：总体积50ul，10
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buffer 5μl,dog cdna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，高保真pfu酶1μl，dntp 5μl，双蒸水36μl；
34.步骤二、目的基因测序，对通过pcr方法获得的growth hormone(gh)目的基因进行测序，pcr扩增的条件为：95℃1min预变性，94℃30s、55℃30s、72℃50s，25-30个循环，72℃延伸5min，pcr结束后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，利用tiangen的胶回收试剂盒，回收目的片段，测定浓度后，送测序公司测序；
35.步骤三、growth hormone(gh)基因和表达载体的连接，将测序正确的目的基因片段growth hormone(gh)和载体ptzy1分别用限制性内切酶ecori/xhoi酶进行双酶切，然后通过t4连接酶将酶切后的基因片段growth hormone(gh)和经过ecori/xhoi双酶切的载体ptzy1进行连接获得重组质粒ptzy1-gh，按照目的基因和载体摩尔比3：1的比例，加入t4连接酶16℃连接过夜；
36.步骤四、重组质粒ptzy1-gh的转化，将步骤三获得的重组质粒ptzy1-gh采用热激转化的方式导入到大肠杆菌dh5α感受态细胞中进行培养，之后提取重组质粒ptzy1-gh；
37.步骤五、重组质粒的酶切鉴定，将提取的重组质粒用ecori/xhoi双酶切，37℃水浴锅酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；
38.步骤六、无内毒素质粒提取，利用invitrogen无内毒素质粒提取试剂盒，提取用于转染的ptzy1-gh重组质粒，最后质粒浓度不低于1.0ug/ul，内毒素含量低于0.1eu/ul；
39.步骤七、chos(仓鼠卵巢)细胞的转染，待到步骤五的鉴定结果通过后，将步骤六中提取的无内毒素重组质粒ptzy1-gh转染到chos(仓鼠卵巢)细胞中，转染结束后，细胞继续培养4-5天，之后将细胞连同培养上清转移到离心瓶中，5000rpm离心10min并收取上清，弃掉细胞，转染前将chos细胞密度调整为2.0
×
106/ml，不得超过4.0
×
106/ml，采用对数生长期的细胞进行转染，细胞存活率95％以上，转染试剂和质粒质量比为2.5：1，转染试剂为pei25000，稀释液为150mmnacl 25mm hepes，加入顺序为：质粒—孵育5min—转染试剂，重组质粒的转染具体步骤为：
40.a、转染当天，需要确定细胞的数量，对于种子细胞的密度必须在3
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106
–4×
106个活细胞/ml，且细胞存活率》95％，细胞不能有聚团，方可进行转染；
41.b、根据细胞悬液的体积计算转染所需要的试剂，对于每个30ml转染体系，需要6
×
107个活细胞；
42.c、转染时将细胞的密度调整为2.0
×
106个/ml活细胞，体系为30ml，培养箱温度37℃，湿度合适，5％-8％co2浓度，转速为125转/min，培养30min；
43.d、稀释60μg的质粒dna到500μl的nacl中，轻轻地混均后，加入细胞悬液中，在培养箱中37℃，湿度合适，8％co2，转速为125转/min，震荡培养5min；
44.e、稀释150μg的pei25000到500μl的nacl中，轻轻混均后，加入到细胞悬液中；
45.f、转染18-24小时后，加入750μl丁酸钠(母液100mm)和1.5ml en3到细胞悬液中；
46.g、大约72h后收集细胞上清用于蛋白纯化；
47.步骤八、目的蛋白的纯化，将步骤七中收取的上清通过roche的ni离子亲和柱亲和纯化ptzy1-gh蛋白，经sds-page还原和非还原电泳，获取到纯度达到98％以上，单一条带的重组dog gh，经wb鉴定即为growth hormone(gh)，具体操作步骤为：取2mlroche ni亲和介质于层析柱中，pbs缓冲液平衡10个柱体积，收集的上清缓慢通过层析柱，pbs+50mm咪唑溶液洗杂，pbs+500mm咪唑洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白，取小样用于电泳，具体鉴定过程为：将20-100ng不等的蛋白通过湿转电泳仪，转移到pvdf膜上，4℃一抗(商业化抗gh抗体)孵育过夜，pbst漂洗3次，每次5min,5％脱脂牛奶37℃封闭1h，37℃标记有hrp的二抗孵育1h，pbst漂洗3次，每次5min。加入ecl发光底物，暗室曝光胶片，经过分子量比对，结果显示上述所表达目的蛋白为重组dog growth hormone(gh)，还原非还原电泳条件为：非还原电泳loading buffer不含有dtt；
48.步骤九、验证所表达目的蛋白是否具有二硫键，并验证细胞的增殖活性，将步骤八中所获目的蛋白分别进行还原和非还原电泳，验证所表达目的蛋白是否具有二硫键，对目的蛋白去内毒素后，加入到nb2-11 rat lymphoma cells中，验证其对细胞的增殖活性，将nb2-11 rat lymphoma cells按照每孔5000cells的密度接种到96孔板中，培养24h后，加入0-100ng/ml不等浓度的重组dog growth hormone于接种了细胞的96孔板中，做好阴性对照。培养48h后，每孔加入10ulcck-8试剂，孵育1h后，450nm测定吸光值，利用cell counting kit-8(cck-8)测定细胞增殖，结果显示重组dog gh具有很好的细胞增殖活性，计算ed50＝1.8-6.2ng/ml。
49.上文一般性的对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对于技术领域的一般技术人员是显而易见的。因此，在不脱离本发明思想精神的修改或改进，均在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：由以下步骤组成：步骤一、目的基因的合成；步骤二、目的基因测序；步骤三、growth hormone(gh)基因和表达载体的连接；步骤四、重组质粒ptzy1-gh的转化；步骤五、重组质粒的酶切鉴定；步骤六、无内毒素质粒提取；步骤七、chos(仓鼠卵巢)细胞的转染；步骤八、目的蛋白的纯化；步骤九、验证所表达目的蛋白是否具有二硫键，并验证细胞的增殖活性。2.根据权利要求1所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤一还包括：在ncbi网站，查找growth hormone(gh)基因序列，以dog cdna文库为模板，利用设计的上游引物和下游引物进行pcr扩增获得growth hormone(gh)目的基因片段，growth hormone(gh)基因本身带有信号肽，设计引物时不包含信号肽序列。3.根据权利要求1所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤二还包括：对通过pcr方法获得的growth hormone(gh)目的基因进行测序，所述pcr扩增的条件为：95℃1min预变性，94℃30s、55℃30s、72℃50s，25-30个循环，72℃延伸5min，pcr结束后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，利用tiangen的胶回收试剂盒，回收目的片段，测定浓度后，送测序公司测序，所述步骤三还包括：将测序正确的目的基因片段growth hormone(gh)和载体ptzy1分别用限制性内切酶ecori/xhoi酶进行双酶切，然后通过t4连接酶将酶切后的基因片段growth hormone(gh)和经过ecori/xhoi双酶切的载体ptzy1进行连接获得重组质粒ptzy1-gh，按照目的基因和载体摩尔比3：1的比例，加入t4连接酶16℃连接过夜。4.根据权利要求3所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤四还包括：将所述步骤三获得的重组质粒ptzy1-gh采用热激转化的方式导入到大肠杆菌dh5α感受态细胞中进行培养，之后提取重组质粒ptzy1-gh。5.根据权利要求1所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤五还包括：将提取的重组质粒用ecori/xhoi双酶切，37℃水浴锅酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。6.根据权利要求5所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤六还包括：利用invitrogen无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，用于chos细胞转染。7.根据权利要求6所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤七还包括：待到所述步骤五的鉴定结果通过后，将所述步骤六中提取的无内毒素重组质粒ptzy1-gh转染到chos(仓鼠卵巢)细胞中，转染结束后，细胞继续培养4-5天，之后将细胞连同培养上清转移到离心瓶中，5000rpm离心10min并收取上清，弃掉细胞，转染前将chos细胞密度调整为2.0
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106/ml，不得超过4.0
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106/ml。
8.根据权利要求7所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤八还包括：将所述步骤七中收取的上清通过roche的ni离子亲和柱亲和纯化ptzy1-gh蛋白，经sds-page还原和非还原电泳，获取到纯度达到98％以上，单一条带的重组dog gh，经wb鉴定即为growth hormone(gh)，目的蛋白纯化条件为，pbs平衡亲和柱，50mm咪唑洗脱杂蛋白，500mm咪唑洗脱目的蛋白，具体鉴定过程为：将20-100ng不等的蛋白通过湿转电泳仪，转移到pvdf膜上，4℃一抗(商业化抗gh抗体)孵育过夜，pbst漂洗3次，每次5min,5％脱脂牛奶37℃封闭1h，37℃标记有hrp的二抗孵育1h，pbst漂洗3次，每次5min。加入ecl发光底物，暗室曝光胶片，经过分子量比对，结果显示上述所表达目的蛋白为重组dog growth hormone(gh)，还原非还原电泳条件为：非还原电泳loading buffer不含有dtt。9.根据权利要求8所述的一种高效表达活性dog growth hormone(gh)生长激素的方法，其特征在于：所述步骤九还包括：将所述步骤八中所获目的蛋白分别进行还原和非还原电泳，验证所表达目的蛋白是否具有二硫键，对目的蛋白去内毒素后，加入到nb2-11 rat lymphoma cells中，验证其对细胞的增殖活性，将nb2-11 rat lymphoma cells按照每孔5000cells的密度接种到96孔板中，培养24h后，加入各种浓度的重组dog growth hormone，做好阴性对照，培养48h后，利用cell counting kit-8(cck-8)测定细胞增殖，每孔加入10ulcck-8试剂，孵育1h后，450nm测定吸光值，计算ed50。
技术总结本发明公开了一种高效表达活性Dog Growth Hormone(GH)生长激素的方法，涉及基因重组技术领域，由以下步骤组成：步骤一、目的基因的合成，步骤二、目的基因测序，步骤三、Growth Hormone(GH)基因和表达载体的连接，步骤四、重组质粒PTZY1-GH的转化，步骤五、重组质粒的酶切鉴定，步骤六、无内毒素质粒提取，步骤七、CHOS(仓鼠卵巢)细胞的转染，步骤八、目的蛋白的纯化，步骤九、验证所表达目的蛋白是否具有二硫键，并验证细胞的增殖活性。本发明通过表达的蛋白质量稳定，产量高，可达1-2g/L，产品均一，细胞培养采用国产化培养基，相较于进口培养基可大幅节约原料成本，易于大规模生产，同时重组Dog Gh重组蛋白具有Nb2-11细胞增殖活性，可用作狗生长激素药物的后续开发。可用作狗生长激素药物的后续开发。可用作狗生长激素药物的后续开发。
技术研发人员：王元涛
受保护的技术使用者：武汉天正源生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.21
技术公布日：2022/7/5
