1.本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂、试剂盒及定量方法。
背景技术：2.壳多糖酶3样蛋白1(chitinase3-like protein1，chi3l1)是一种含383个氨基酸，分子量42.6kd的单体糖基化蛋白，是最早在人成骨细胞中发现的糖蛋白，是几丁质酶蛋白家族的一员。它可以结合壳多糖，但没有壳多糖酶的活性。在炎症和组织重塑中起重要作用。chi3l1在炎症、纤维化、肿瘤等许多病理情况下表达增加，参与炎症期间组织重塑、介导巨噬细胞浸润、分化和成熟以及血管生成等过程。血清chi3l1水平在酒精性肝硬化病人中升高，血液中的chi3l1蛋白与丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关。研究发现在肝硬化患者的血清中，chi3l1的浓度可显著升高。在肝脏中富集和特异性表达，作为一种高灵敏度高特异性的肝纤维化分期和诊断的血清检测标志物。
3.我国肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)发生率居于所有肿瘤发生率的第4位，目前肝癌诊断主要依靠影像学检查、血清标志物、穿刺活检等手段。其中血清标志物主要以公认并进入临床应用的甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原等为代表，随着蛋白质及分子生物学技术的发展，不断有新的标志物被发现并逐步应用于临床，如microrna以及磷脂酰肌醇蛋白聚糖、n-糖标志物等，但是仍远远不能满足临床对肝癌早期诊断及疾病分层管理的需求。
4.壳多糖酶3样蛋白1在多种恶性肿瘤中表达水平升高，包括消化系统的胃癌及肝癌、生殖系统子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞皮肤癌等，并提示预后不良。chi3l1可通过促进肿瘤血管生成、增加黏附促进肿瘤侵袭和转移、激活转化生长因子-β/丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶等信号通路在肿瘤的发生发展过程中起调节作用。
5.血清和组织水平的临床对照研究及分层研究表明，肝癌患者chi3l1水平表达增加，且与肝癌的cnlc分期和肿瘤大小相关，检测chi3l1可以更好地评估患者的肿瘤负荷。chi3l1水平在多种炎症及恶性肿瘤中表达升高且与预后不良有关，在肿瘤患者研究中应始终考虑癌症以外的其他因素(炎症、感染、心血管疾病、糖尿病等)，肝硬化患者外周血chi3l1水平高于hcc患者，不适用于高危人群(肝硬化)中原发性肝癌的早期发现，因此chi3l1不能作为肝癌标志物。chi3l1参与炎症反应和促进细胞外基质重塑，在促进肝纤维化/硬化上的作用已近得到大量文献证实，肝癌的发生是一个渐进式的过程,期间炎症反应、纤维化、肿瘤并存并相互影响。
6.目前常见的chi3l1检测方法为elisa和化学发光方法，对判断肝纤维化的发生、发展、恢复，以及相关癌症筛查和复发判断有很好的参考价值。但上述两种方法均为采用单克隆抗体的固相法，并需标记检测抗体，生产制备繁琐，且不适用高通量全自动生化分析仪应用。
技术实现要素：7.基于此，本发明的目的是提供一种壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂、试剂盒及定量方法，以至少解决上述相关技术中的不足。
8.本发明提出一种壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，包括以下组分：
9.第一试剂，包括巯基类还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂以及聚乙二醇、缓冲液、防腐剂、螯合剂以及稳定剂；
10.第二试剂，包括多克隆抗体，所述多克隆抗体经化学共价交联固定在载体上。
11.本发明的有益效果在于：将巯基类还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂以及聚乙二醇组合使用，再配合能够结合壳多糖酶3样蛋白1的多克隆抗体实现对试样中壳多糖酶3样蛋白1含量的快速检测，同时确保测定结果的精度。
12.另外，根据本发明提供的壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，还可以具有如下的技术特征：
13.进一步的，所述还原剂为n-乙酰半胱氨酸、巯基甘油、还原性谷胱甘肽中至少一种。
14.进一步的，所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、高氯酸钠、碘化物中至少一种。
15.进一步的，所述表面活性剂的浓度为0.01％～1.0％，且所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中至少一种。
16.进一步的，所述分散剂为有机酸、糖类、盐类以及氨基酸中至少一种；
17.其中，所述有机酸的浓度为10mmol/l～200mmol/l，且所述有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸以及琥珀酸中至少一种；
18.所述糖类为蔗糖、甘露糖以及山梨糖醇中至少一种，所述蔗糖浓度为50g/l～300g/l，所述甘露糖的浓度为20mmol/l～150mmol/l，所述山梨糖醇的浓度为50mmol/l～300mmol/l；
19.所述盐类的浓度为50mmol/l～300mmol/l，且所述盐类为氯化钠以及溴化钠中至少一种；
20.所述氨基酸为甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾以及谷氨酸钠中至少一种，所述谷氨酸和所述双甘氨肽的浓度均为20mmol/l～150mmol/l，所述天门冬氨酸钾的浓度为50mmol/l～500mmol/l，所述谷氨酸钠的浓度为20mmol/l～80mmol/l。
21.进一步的，所述缓冲液的浓度为10mmol/l～150mmol/l，且所述缓冲液为mops缓冲液、mopso缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液中至少一种。
22.进一步的，所述多克隆抗体的载体包括液相载体和/或固相载体，所述液相载体为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、高分子聚乙二醇中至少一种，所述固相载体为聚苯乙烯微球。
23.本发明的另一个目的在于提出一种壳多糖酶3样蛋白1的试剂盒，包括上述的测定试剂，所述试剂盒还包括含有已知浓度的壳多糖酶3样蛋白1的标准样本。
24.进一步的，所述标准样本为含有磷酸盐、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙二醇、蔗糖、吐温、防护剂和/或血清混合溶液。
25.本发明的另一个目的在于提出一种壳多糖酶3样蛋白1的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，所述壳多糖酶3样蛋白1的定量方法应用于上述的测定试剂，所述壳多糖
酶3样蛋白1的定量方法包括以下步骤：
26.(1)将试样与含有还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂和促凝剂的第一试剂混合反应，得到第一反应液，所述第一试剂用于排除所述试样中高浓度乳糜和脂质的干扰，以及解离所述试样中结合状态的壳多糖酶3样蛋白1；
27.(2)将所述第一反应液与含有结合壳多糖酶3样蛋白1的多克隆抗体的第二试剂混合反应，得到第二反应液；
28.(3)读取所述第二反应液在相应波长处的吸光度值，计算壳多糖酶3样蛋白1的含量。
29.本发明中，利用还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂和促凝剂来排除高浓度乳糜、脂质的干扰，并解离结合型壳多糖酶3样蛋白1，保证壳多糖酶3样蛋白1的稳定性，进而使得测定结果更加准确。
30.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
31.图1为本发明实施例二中各浓度标准样本吸光度变化及标准曲线；
32.图2为本发明实施例三中试剂盒检测值与化学发光法检测值的对比曲线图；
具体实施方式
33.为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。以下实施例中所描述的实验流程仅用于证明本发明的可行性，本发明的应用并不仅限于此。实施例中所提及的实验操作，如无特殊说明，均为常规实验方法；所提及的试剂耗材，如无特殊说明，均为常规试剂耗材。
34.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
35.实施例一
36.一种壳多糖酶3样蛋白1的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，包括以下步骤：
37.(1)将试样与含有还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂和促凝剂的第一试剂混合反应，得到第一反应液，所述第一试剂用于排除所述试样中高浓度乳糜和脂质的干扰，以及解离所述试样中结合状态的壳多糖酶3样蛋白1；
38.(2)将所述第一反应液与含有结合壳多糖酶3样蛋白1的多克隆抗体的第二试剂混合反应，得到第二反应液；
39.(3)读取所述第二反应液在600nm波长处的吸光度值，计算壳多糖酶3样蛋白1的含量。
40.需要说明的是，上述定量方法所使用的仪器是本领域常规仪器，可以为日立7180全自动生化分析仪。
41.本实施例中的定量方法利用还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂和促凝剂来排除高浓度乳糜、脂质的干扰，并解离结合型壳多糖酶3样蛋白1，保证壳多糖酶3样蛋白1的稳定性，进而使得测定结果更加准确。
42.上述方法中采用的试剂为一种壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，包括以下组分：
43.第一试剂，包括巯基类还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂以及聚乙二醇、缓冲液、防腐剂、螯合剂以及稳定剂；
44.第二试剂，包括多克隆抗体，所述多克隆抗体经化学共价交联固定在载体上。
45.在本实施例中，第一试剂是含有还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂和促凝剂的组合，其中，还原剂选自硫基类还原剂，表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂，分散剂选自有机酸、糖、盐、氨基酸，促凝剂选择聚乙二醇；在本技术中，在试样中包含游离形态chi3l1和与蛋白结合的结合形态chi3l1，通过第一试剂，能够具有以下作用：1、排除高浓度乳糜、脂质的干扰；2、解离结合形态的壳多糖酶3样蛋白1(以下简称chi3l1)，分散暴露被测蛋白，3、保持chi3l1抗原结构的稳定性。
46.在本实施例中，还原剂为疏基类还原剂，选用n-乙酰半胱氨酸，还可以采用疏基甘油、还原型谷胱甘肽。所述疏基类还原剂可解离chi3l1多聚体，解离chi3l1与样本中其它蛋白的结合，而不破坏抗原结构，从而提高chi3l1抗原与抗体的结合效率，增加测定准确性。
47.具体的，所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、高氯酸钠、碘化物中至少一种，其作用是展开或解离大分子结构，而不破坏免疫特异性活性。应用于本发明所述测定试剂的离液离子。
48.在本实施例中，优选的，所述离液离子选用溴化钠。
49.进一步的，第一试剂中的表面活性剂是与所述离液离子协同作用的重要试剂，进一步促进结合形态chi3l1解离，并有助于保持游离形态chi3l1蛋白结构的稳定性。所述表面活性剂可以选用阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的组合中任意一种，其浓度范围在0.01％～1.0％；
50.上述第一试剂中的表面活性剂中，可选的非离子表面活性剂，例如：吐温-20、吐温-80、triton x-100、tritonx-405；阴离子表面活性剂，如胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠；两性离子表面活性剂如chaps、chapso；分散剂选自有机酸、糖、盐、氨基酸，如：蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、氯化钠、溴化钠、磷酸盐、甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾、谷氨酸钠；促凝剂选择聚乙二醇。
51.在本实施例中，该表面活性剂选用非离子表面活性剂：吐温-20，其浓度为0.05％～0.5％。
52.具体的，上述有机酸，选自柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸中的一种或多种。所述有机酸也可以选用其盐形式，如柠檬酸钠、酒石酸钾钠、苹果酸钠、琥珀酸钠。有机酸的浓度为10mm～200mm。
53.在本实施例中，有机酸选用柠檬酸，其浓度为20mm～100mm。
54.在本技术中，上述糖类有助于维持和稳定解离的chi3l1蛋白，可以是蔗糖、甘露糖以及山梨糖醇中一种或多种的组合；选用蔗糖的浓度范围为50g/l～300g/l；选用甘露糖的浓度范围为20mm～150mm；选用山梨糖醇的浓度范围为50mm～300mm。
55.在本实施例中，糖类选用蔗糖，浓度为100g/l～250g/l。
56.具体的，上述盐类具有协同解离作用，可以是氯化钠以及溴化钠中一种或多种的组合；选用氯化钠的浓度范围为50mm～500mm；选用溴化钠的浓度范围为50mm～500mm。
57.在本实施例中，盐类选用氯化钠，浓度范围为100mm～350mm。
58.进一步的，上述氨基酸有助于维持和稳定解离的chi3l1蛋白，可以是甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾以及谷氨酸钠中一种或多种的组合；其中选用甘氨酸的浓度为20mm～150mm；选用双甘氨肽的浓度为20mm～150mm；选用天门冬氨酸钾的浓度为50mm～500mm；选用谷氨酸钠的浓度为20mm～80mm。
59.在本实施例中，氨基酸选用甘氨酸，浓度为50mm～100mm。
60.进一步的，所述缓冲液的浓度为10mmol/l～150mmol/l，且所述缓冲液为mops缓冲液、mopso缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液中至少一种。
61.在本实施例中，缓冲液选用mops缓冲液，浓度为10mmol/l～150mmol/l。
62.另外，作为本技术中第一试剂的添加剂，防腐剂选用叠氮钠，在一些可选实施例中，该防腐剂还可以选用proclin300，螯合剂选用edta；稳定剂选用牛血清白蛋白，在一些可选实施例中，稳定剂还可以选用酪蛋白。
63.在本技术中，第二试剂中结合chi3l1的多克隆抗体，所述多克隆抗体的载体包括液相载体和/或固相载体，所述液相载体为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、高分子聚乙二醇中至少一种，在本实施例中，所述液相载体为牛血清白蛋白；所述固相载体为聚苯乙烯微球，所述多克隆抗体经化学共价交联固定在乳胶微球表面，用于实现结合试样中chi3l1抗原的工序。包括任何能够特异识别和结合chi3l1的抗体或抗体片段，例如人源或动物源抗体、重组抗体、嵌合抗体。例如市售thermofisher公司兔多抗，abcam公司兔多抗，义翘神舟生物科技公司的兔多抗。
64.作为chi3l1多克隆抗体的载体，包括各种微孔板、试管、试纸条、乳胶微球、磁性颗粒。固定可通过化学共价交联或物理吸附工艺进行。优选的，通过化学共价交联固定，具有偶联效率高、灵敏度高、稳定性好的优点。
65.常用的偶联方法可采用以碳二亚胺(edc)为交联剂的一步法，或以碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)为交联剂的两步法。以乳胶微球为例：
66.一步法工艺采用如下步骤：
67.(1)将所述多克隆抗体与羧基微球按照质量比1:80混匀于ph6.20、25mmol/l mes偶联缓冲液中；按照与乳胶微球所含羧基的摩尔比1:5加入edc，37℃混合搅拌2小时；
68.(2)离心，弃上清，加入含0.5％bsa的ph8 tris缓冲溶液重悬浮，离心清洗2次；
69.(3)加入含0.5％bsa的ph8 tris缓冲液重悬浮，使所述乳胶微球溶液的终浓度为0.3％(w/v)；备用。
70.在所述一步法工艺中，步骤(1)中多克隆抗体与羧基微球按照质量比的范围为1:50～100，与乳胶微球所含羧基的摩尔比范围为1:3～10，混合搅拌的时间为2～3小时；步骤(2)中所加入的含bsa的tris缓冲溶液中，bsa的含量范围为0.1％～2.0％，ph范围为7.80～8.50，离心清洗的次数为2～3次；步骤(3)中所加入的含bsa的tris缓冲溶液中，bsa的含量范围为0.1％～2.0％，ph范围为7.80～8.50，乳胶微球溶液的终浓度范围为0.1％～0.8％。
71.二步法工艺采用如下步骤：
72.(1)将羧基微球悬浮于25mm，ph6.1 mes缓冲液中；
73.(2)按照edc与乳胶微球表面羧基含量的摩尔比3:1，向步骤(1)的溶液中加入edc；按照nhs或sulfo-nhs与edc的摩尔比为3:1，缓慢加入nhs或sulfo-nhs，搅拌25分钟；
74.(3)离心，弃上清，加入40mm ph8.00硼酸缓冲液重悬浮，离心清洗2次；再加入40mm ph8.00硼酸缓冲液重悬浮；
75.(4)在步骤(3)溶液中，按终浓度240微克/毫升，缓慢加入所需固定的多抗，边加入边搅拌；并持续搅拌2小时；
76.(5)离心，弃上清，加入稀释液重悬浮，离心清洗2次；再加入稀释液重悬浮，使所述乳胶微球溶液的终浓度为0.3％(w/v)，备用；所述稀释液为50mm tris-双甘氨肽缓冲液，含2％吐温-20，1.0％nan3，ph7.50。
77.在所述二步法工艺中，步骤(1)中mes缓冲液的浓度范围为15～30mm，ph值范围为5.5～6.5；步骤(2)中edc与乳胶微球表面羧基含量的摩尔比范围为2～10:1，nhs或sulfo-nhs与edc的摩尔比范围为2～5:1，搅拌时间为10～30分钟；步骤(3)中所加入的硼酸缓冲液的浓度范围为30～～100mm，离心清洗次数为1～3次；步骤(4)中终浓度范围为10～1000微克/毫升，持续搅拌时间为2～3小时；步骤(5)中反复离心清洗的次数为1～3次，乳胶微球溶液的终浓度为0.1％～0.8％(w/v)，tris-双甘氨肽缓冲液的浓度范围为10～200mm，吐温-20的含量为0.1～5.0％，ph值范围为7.20～8.50。
78.作为第二试剂的稀释液，其化剂组分并未特别限制，只要能悬浮其中的乳胶微球，保持抗体稳定，各种配方均可。
79.在本技术中，所述的乳胶微球的直径范围为100～350nm，本实施例中所述的乳胶微球，为直径大小150nm的市售产品。
80.本发明另一目的在于提出一种壳多糖酶3样蛋白1的试剂盒，包括上述的测定试剂，所述试剂盒还包括含有已知浓度的壳多糖酶3样蛋白1的标准样本。
81.其中，所述的试剂盒定标液是含有已知浓度壳多糖酶3样蛋白1的标准样本，作为标准样本中含有的已知浓度的chi3l1，其中chi3l1可来源于患者的血清，或经基因工程学表达发酵获得。标准样本是含有1～6个不同浓度的chi3l1标准样本，在本实施例中，该标准样本采用1～5个不同浓度的chi3l1标准样本。chi3l1标准样本的形态是缓冲液溶液或冻干制品，本实施例中为冻干制品，使用前用纯水复溶。所述缓冲液溶液是含有但不局限于：磷酸钠、牛血清白蛋白、氯化钠、蔗糖、吐温-20、聚乙二醇6000，ph7.00～7.60的混合水和/或牛血清溶液。
82.所述标准试样的缓冲液溶液，是含有如下组分及浓度的水和/或牛血清溶液：磷酸钠浓度为20mm～300mm，本实施例中为150mm；牛血清白蛋白浓度为0.1％～6.0％，本实施例中为3.0％；氯化钠浓度为50mm～500mm，本实施例中为150mm；蔗糖浓度为20g/l～500g/l，本实施例中为200g/l；吐温-20浓度为0.1％～1.0％，本实施例中为0.3％；聚乙二醇6000浓度为2g/l～60g/l，本实施例中为45g/l。
83.所述标准试样的缓冲液溶液，还含有防护剂，选自叠氮钠、庆大霉素、咪唑烷基脲、2-氯乙酰胺，在本实施例中，选用叠氮钠。
84.所述定标液可以制成液体溶液或冻干品。
85.所述试剂盒检测试样中壳多糖酶3样蛋白1的含量是在全自动生化分析仪上实施。
86.以下通过实施例具体说明本发明，但本发明不受以下实施例限定。
87.实施例二
88.1.试剂
89.试剂a作为第一试剂(r1)
90.50mm、ph6.50磷酸钠缓冲液；
91.30mm柠檬酸；
92.200mm溴化钠；
93.5.0g/l peg 20000；
94.0.2％吐温-20；
95.0.05％bsa；
96.试剂b作为第二试剂(r2)
97.(1)将chi3l1多抗与200nm粒径羧基含量为78ueq/g微球按照质量比1:25混匀于ph6.15、50mmol/l mes偶联缓冲液中；按照与乳胶微球所含羧基的摩尔比1:2加入edc，37℃混合搅拌2.5小时；
98.(2)离心，弃上清，加入含1.0％bsa的ph8.00 tris缓冲溶液重悬浮，离心清洗2次；
99.(3)加入含bsa 1.0％的ph8.05 tris缓冲液重悬浮，使所述乳胶微球溶液的终浓度为0.2％(w/v)，备用。
100.2.标准试样
101.100mm、ph7.4磷酸钠缓冲液；
102.10.0g/l牛血清白蛋白；
103.0.9％氯化钠；
104.100g/l蔗糖；
105.0.3％吐温-20；
106.50.0g/l聚乙二醇6000；
107.15％牛血清；
108.0.1％叠氮钠；
109.在上述缓冲液中分别加入5个浓度的chi3l1纯品，50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml，以纯水作为0.0ng/ml。
110.3.测定参数
111.测定设备日立7180生化分析仪；
112.分析法两点终点法，测定波长600nm(不设副波长)；试剂样品比r1:s:r2＝200:10:50。
113.结果：定标曲线如图1。
114.实施例三
115.1.试剂
116.试剂a作为第一试剂(r1)
117.ph7.80 tris缓冲液；
118.150mm氯化钠；
119.30mm硫氰酸钠；
120.7.5g/l peg 20000；
121.0.3％吐温-20；
122.0.06％bsa；
123.试剂b作为第二试剂(r2)
124.(1)将280nm粒径羧基含量为150ueq/g微球悬浮于20mm，ph6.10 mes缓冲液中；
125.(2)按照edc与乳胶微球表面羧基含量的摩尔比3:1，向步骤(1)的溶液中加入edc；按照nhs或sulfo-nhs与edc的摩尔比为2.5:1，缓慢加入nhs或sulfo-nhs，搅拌25分钟；
126.(3)离心，弃上清，加入30mm ph8.00硼酸缓冲液重悬浮，离心清洗1次；再加入30mm ph8.00硼酸缓冲液重悬浮；
127.(4)在步骤(3)溶液中，按终浓度350微克/毫升，缓慢加入所需固定的多抗，边加入边搅拌；并持续搅拌3小时；
128.(5)离心，弃上清，加入稀释液重悬浮，离心清洗2次；再加入稀释液重悬浮，使所述乳胶微球溶液的终浓度为0.3％(w/v),备用；所述稀释液为150mm tris-双甘氨肽缓冲液，含3.5％吐温-20，1.0％nan3，ph8.10。
129.2.试样
130.已经化学发光法确值的临床血清标本25份
131.3.测定参数
132.测定设备日立7180生化分析仪
133.分析法两点终点法，测定波长600nm(不设副波长)；试剂样品比r1:s:r2＝200:10:40；
134.结果：如图2所示，本发明试剂盒与比对化学发光法有显著相关性。
135.实施例四
136.1.试剂
137.采用实施例二中的第一试剂(r1)，与实施例三中的第二试剂(r2)
138.2.试样
139.13份正常人血浆标本和10份癌症患者血浆标本
140.3.测定参数同实施例三
141.结果：如下表1显示，本试剂盒能显著区分临床血浆标本中chi3l1的水平。
142.[0143][0144]
实施例五
[0145]
定标液的稳定性
[0146]
采用如下缓冲液组分配制标准试样作为定标液，将相同3份的其中一份密闭放置2-8℃作为对照，其余两份分别开瓶放置于2-10℃一份和密闭放置37℃一份，结果如表2所示，定标液的稳定性满足日常检测要求。
[0147]
定标液组分：
[0148]
100mm、ph7.42磷酸钠缓冲液；
[0149]
6.0g/l牛血清白蛋白；
[0150]
0.9％氯化钠；
[0151]
250g/l蔗糖；
[0152]
0.3％吐温-20；
[0153]
3.0g/l聚乙二醇6000；
[0154]
0.1％叠氮钠；
[0155]
在上述缓冲液中加入chi3l1纯品。
[0156]
表2：定标液的稳定性数据
[0157]
2-8℃密闭2-10℃开瓶1天37℃密闭7天37℃密闭15天867ng/ml869ng/ml873ng/ml917ng/ml
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综上，根据本发明提供的试剂盒，第一试剂是至少含有有机酸、离液离子溴化钠、表面活性剂、分散剂和促凝剂的组合，通过第一试剂能够排除高浓度乳糜、脂质的干扰，解离结合型chi3l1，分散暴露被测蛋白，且保持chi3l1抗原结构的稳定性，此外，第二试剂是含有结合chi3l1多克隆抗体的组合物，能够与试样中chi3l1充分结合，从而用于实现测定浊度的工序，使测定结果更加准确，且该试剂盒能够用于筛查大量人群的高通量应用，本发明有助于癌症疾病标记物的确定和鉴别确定。
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以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。
技术特征：1.一种壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，其特征在于，包括以下组分：第一试剂，包括巯基类还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂以及聚乙二醇、缓冲液、防腐剂、螯合剂以及稳定剂；第二试剂，包括多克隆抗体，所述多克隆抗体经化学共价交联固定在载体上。2.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，其特征在于，所述还原剂为n-乙酰半胱氨酸、巯基甘油、还原性谷胱甘肽中至少一种。3.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，其特征在于，所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、高氯酸钠、碘化物中至少一种。4.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，其特征在于，所述表面活性剂的浓度为0.01％～1.0％，且所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中至少一种。5.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，其特征在于，所述分散剂为有机酸、糖类、盐类以及氨基酸中至少一种；其中，所述有机酸的浓度为10mmol/l～200mmol/l，且所述有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸以及琥珀酸中至少一种；所述糖类为蔗糖、甘露糖以及山梨糖醇中至少一种，所述蔗糖浓度为50g/l～300g/l，所述甘露糖的浓度为20mmol/l～150mmol/l，所述山梨糖醇的浓度为50mmol/l～300mmol/l；所述盐类的浓度为50mmol/l～300mmol/l，且所述盐类为氯化钠以及溴化钠中至少一种；所述氨基酸为甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾以及谷氨酸钠中至少一种，所述谷氨酸和所述双甘氨肽的浓度均为20mmol/l～150mmol/l，所述天门冬氨酸钾的浓度为50mmol/l～500mmol/l，所述谷氨酸钠的浓度为20mmol/l～80mmol/l。6.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，其特征在于，所述缓冲液的浓度为10mmol/l～150mmol/l，且所述缓冲液为mops缓冲液、mopso缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液中至少一种。7.根据权利要求1所述的壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，其特征在于，所述多克隆抗体的载体包括液相载体和/或固相载体，所述液相载体为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、高分子聚乙二醇中至少一种，所述固相载体为聚苯乙烯微球。8.一种壳多糖酶3样蛋白1的试剂盒，包括如权利要求1至7任一项所述的测定试剂，其特征在于，所述试剂盒还包括含有已知浓度的壳多糖酶3样蛋白1的标准样本。9.根据权利要求8所述的壳多糖酶3样蛋白1的试剂盒，其特征在于，所述标准样本为含有磷酸盐、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙二醇、蔗糖、吐温、防护剂和/或血清混合溶液。10.一种壳多糖酶3样蛋白1的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，所述壳多糖酶3样蛋白1的定量方法应用于权利要求1至7任一项所述的测定试剂，其特征在于，所述壳多糖酶3样蛋白1的定量方法包括以下步骤：(1)将试样与所述第一试剂混合反应，得到第一反应液，所述第一试剂用于排除所述试样中高浓度乳糜和脂质的干扰，以及解离所述试样中结合状态的壳多糖酶3样蛋白1；(2)将所述第一反应液与所述第二试剂混合反应，得到第二反应液；
(3)读取所述第二反应液在相应波长处的吸光度值，计算壳多糖酶3样蛋白1的含量。
技术总结本发明提供一种壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂，包括以下组分：第一试剂，包括巯基类还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂以及聚乙二醇、缓冲液、防腐剂、螯合剂以及稳定剂；第二试剂，包括多克隆抗体，所述多克隆抗体经化学共价交联固定在载体上。本发明将巯基类还原剂、离液离子、表面活性剂、分散剂以及聚乙二醇组合使用，再配合能够结合壳多糖酶3样蛋白1的多克隆抗体实现对试样中壳多糖酶3样蛋白1含量的快速检测，同时确保测定结果的精度。同时确保测定结果的精度。同时确保测定结果的精度。
技术研发人员：万蒙 王学忠
受保护的技术使用者：江西乐成生物医疗有限公司
技术研发日：2022.03.21
技术公布日：2022/7/5
