1.本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治阿尔茨海默病的药物中的应用。
背景技术：2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)又称老年痴呆，是一种神经退行性脑部疾病。1906年alois alzheimer博士利用脑切片染色法发现老年痴呆患者脑内神经纤维缠结，伴有神经元细胞退化，并且大脑皮层出现很多斑块，于是将这种神经系统疾病命名为“阿尔茨海默病”。随着现代医学的发展，人们发现ad特征性病理变化：大脑β淀粉样蛋白(β-amyloid，aβ)沉积形成老年斑(plaque)，tau蛋白过度磷酸化造成神经纤维缠结(nfts)以及神经元丢失，并伴随胶质细胞增生。然而，ad的发病机理以及治疗依然是世界难题。
3.ad发病率呈逐年上升趋势，成为仅次于心血管病和癌症的高发性疾病。每三秒就有一个人患上痴呆症，目前痴呆症的年成本估计为1万亿美元，到2030年这一数字将翻一番，这对全球来说是极重的医疗负担。然而，目前关于ad药物的研发几乎没有任何突破性进展。由于ad临床表现为记忆能力、定向能力、思维和判断能力减退，以及日常生活能力降低，甚至出现异常精神行为症状等，使患者护理难度较大，给社会和家庭带来沉重负担。目前世界上没有一种药物能够减缓或停止ad导致的神经元损伤。美国fda批准了六种治疗ad的药物，卡巴拉汀、加兰他敏、多奈哌齐、美金刚、美金刚联合多奈哌齐和他克林。除了美金刚外，这些药物都是通过暂时增加大脑中神经递质来改善症状，美金刚则阻止大脑中nmda(n-methyl-d-aspartic acid receptor)受体过度激活对神经细胞的刺激损伤。2019年在中国获批上市的甘露特钠通过重塑肠道菌群平衡、降低外周相关代谢产物苯丙氨酸/异亮氨酸的积累，减轻脑内神经炎症，进而改善认知障碍。这些药物能缓解ad症状，但不能有效预防ad。因此，临床上迫切需要研发对ad具有预防和治疗作用的药物。
技术实现要素：4.基于上述技术问题，本发明的主要目的是提供一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖a提取物的新应用，主要是将脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a提取物用于制备预防和治疗阿尔茨海默病的药物。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治阿尔茨海默病的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物为荚膜多糖a的提取物。
7.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖提取物中所述荚膜多糖a的含量大于95wt％。
8.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。
9.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为80kd-90kd。
10.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的提取物中脂质含量低于0.02wt％。
11.在其中一些实施例中，所述脂质含量低于0.01wt％。
12.在其中一些实施例中，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅料。
13.在其中一些实施例中，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂和等渗或等张调节剂中的一种或者多种。
14.在其中一些实施例中，所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种。
15.在其中一些实施例中，所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种。
16.在其中一些实施例中，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种。
17.在其中一些实施例中，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种。
18.在其中一些实施例中，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种。
19.在其中一些实施例中，所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种。
20.在其中一些实施例中，所述溶剂选自水、油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种。
21.在其中一些实施例中，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种。
22.在其中一些实施例中，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种。
23.在其中一些实施例中，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种。
24.在其中一些实施例中，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇以及触变胶中的至少一种。
25.在其中一些实施例中，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种。
26.在其中一些实施例中，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种
27.在其中一些实施例中，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种。
28.在其中一些实施例中，所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种。
29.在其中一些实施例中，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种。
30.在其中一些实施例中，所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种。
31.在其中一些实施例中，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
32.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为片剂或者颗粒剂。
33.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为丸剂或者粉剂。
34.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为胶囊剂或者注射剂。
35.在其中一些实施例中，所述药物的剂型为口服液或者管饲制剂。
36.在其中一些实施例中，所述药物的给药途径为注射给药或者口服给药。
37.在其中一些实施例中，所述药物还包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂，所述荚膜多糖a与所述乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或所述n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂联合使用。
38.在其中一些实施例中，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂包含多奈呱齐、加兰他敏和卡巴拉汀中的一种或者多种。
39.在其中一些实施例中，所述n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂包含美金刚。
40.与传统技术相比，本发明具有以下有益效果：
41.本发明的发明人经过长期的经验积累及大量创造性实验研究，发现脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a能有效预防和治疗阿尔茨海默病，且该药效在经morris水迷宫行为实验在动物模型得以验证。采用脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a的提取物制备防治阿尔茨海默病的药物还具有无毒副作用的优势。
附图说明
42.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
43.图1为脆弱拟杆菌荚膜多糖sec-hplc分析结果；
44.图2为脆弱拟杆菌荚膜多糖sec-mals分析结果。
具体实施方式
45.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
46.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
47.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
48.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
49.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
50.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
51.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
52.本发明所述的防治，包括预防和治疗。
53.脆弱拟杆菌(b.fragilis)属于拟杆菌门，拟杆菌科，拟杆菌属，革兰氏阴性非生孢的严格厌氧杆菌；正常寄居于人体肠道、口腔、呼吸道，对宿主的生理机能有深远影响。
54.本发明涉及的脆弱拟杆菌荚膜多糖a是从脆弱拟杆菌zy-312制备得到的荚膜多糖，本发明证实所涉脆弱拟杆菌zy-312荚膜多糖a可改善ad模型动物的学习记忆能力，可在制备防治ad药物中应用。脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治阿尔茨海默的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物包含荚膜多糖a的提取物。
55.本发明发现脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a能有效预防和治疗阿尔茨海默病，且该药效在经morris水迷宫行为实验在动物模型得以验证。采用脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a的提取物制备防治阿尔茨海默病的药物还具有无毒副作用的优势。
56.本发明所用的脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌zy-312(bacteroides fragilis zy-312)，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株是一株非产肠毒脆弱拟杆菌。
57.在其中一个示例中，所述荚膜多糖提取中所述荚膜多糖a的含量大于95wt％。
58.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。本发明的荚膜多糖a的重均分子量为70kd、71kd、72kd、73kd、74kd、75kd、76kd、77kd、78kd、79kd、80kd、81kd、82kd、83kd、84kd、85kd、86kd、87kd、88kd、89kd、90kd。较优地，本发明的荚膜多糖a的重均分子量为80kd-90kd。
59.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的重均分子量和数均分子量(mw/mn)的比值为1.0-1.3。
60.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的提取物中重均分子量分布于70kd-100kd的部分占总提取物重量的70％-80％；
61.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的提取物中结合脂质的重量含量＜0.02％。
62.本发明上述应用中，荚膜多糖a的提取物的制备，可以，包括但不限于，包括以下步骤：
63.(1)脆弱拟杆菌发酵液经过离心，收集细菌沉淀(菌泥)；
64.(2)菌泥中加入纯化水，充分搅拌，使细菌重悬；
65.(3)调节细菌重悬液的ph至酸性；
66.(4)细菌重悬液转移至提取容器中，加热提取，离心取上清；
67.(5)超滤除小分子杂质，收集截留液；
68.(6)柱交换层析；
69.(7)柱层析收集液经超滤除盐、浓缩后，冷冻干燥，密封保存。
70.上述制备工艺主要概括为：脆弱拟杆菌厌氧发酵
→
离心收集菌体沉淀
→
菌泥混悬
→
酸提
→
离心收集上清
→
超滤除小分子杂质
→
离子交换一步层析
→
冻干工艺制备。该工艺更简单、环保、荚膜多糖纯度高且得率高。制备的荚膜多糖a可满足：蛋白残留＜1％；核酸残留＜0.05％；结合脂质＜0.02％；不含脂多糖或其他污染性多糖组分；分子量分布均一，重均分子量为70kd-90kd，mw/mn＜1.3。
71.在其中一个示例中，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅料。
72.可以理解得是，所述辅料例如为稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂、等渗或等张调节剂等，可以含一种，也可以含两种或者两种以上。所述的辅料可以选自，包括但不限于，如下：稀释剂为淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类；所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种；所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种；所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；所述溶剂选自水、油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种；所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种；所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇以及触变胶中的至少一种；所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种；所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
73.可以理解得是，所述药物可以根据临床需求制备成合适的剂型，例如片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、管饲制剂等。
74.可以理解得是，所述药物可以根据临床需求通过合适的给药途径进行给药，例如注射给药、口服给药等。
75.在其中一个示例中，所述药物还包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂，所述荚膜多糖a与所述乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或所述n-甲基-d-天冬氨酸
受体拮抗剂联合使用。
76.在其中一个示例中，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂包含多奈呱齐、加兰他敏和卡巴拉汀中的一种或者多种。
77.在其中一个示例中，所述n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂包含美金刚。
78.实施例1、脆弱拟杆菌荚膜多糖a的制备
79.脆弱拟杆菌发酵液离心，收集菌泥。
80.(1)方法1：酸提取法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖a
81.1)取50g菌泥，加入300g纯化水使菌体重悬，用1mol/l盐酸溶液调节其ph至4.5，90℃提取1.5h，冷却至室温，12000g常温离心10min，取上清，得到粗糖溶液。
82.2)粗糖溶液经10kd超滤膜超滤浓缩，收集截流液。
83.3)截流液中加入等体积40mmol/l tris-hcl(ph8.5)缓冲溶液转盐；deae sepharose fast flow离子交换柱层析(16mm
×
200mm)，流速20ml/min，20mmol/l tris-hcl(ph8.5，含0.2mol/l nacl)缓冲溶液梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100ml/瓶(组分)，sec-hplc跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，10kd超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干；平行2次试验，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖分别命名为“s1”和“s2”，检测结果参见图1和图2。
84.(2)方法2：苯酚/水法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖a
85.①
取50g菌泥，加入0.15mol/l氯化钠溶液200ml，洗涤后12000g常温离心20min，收集菌泥。
86.②
加入750ml纯化水，使菌体重悬，再加入等体积75％苯酚水溶液(m/m)，68℃搅拌提取30min，16000g室温离心30min，去沉淀。
87.③
上清用等体积乙醚萃取3次，收集水相；水相经旋转蒸发仪浓缩，透析后冻干。
88.④
上述样品用0.1mol/l乙酸钠溶液(含有10mmol/l cacl2和10mmol/lmgcl2)溶解，加入2mg脱氧核糖核酸酶和10mg核糖核酸酶，37℃搅拌2h，再次加入2mg脱氧核糖核酸酶和10mg核糖核酸酶，37℃搅拌过夜；调节ph至7.0，加入20mg链霉蛋白酶，37℃搅拌2h，再次加入20mg链霉蛋白酶，37℃搅拌过夜；加入无水乙醇至终浓度为80％，4℃过夜，12000g离心10min，取沉淀。
89.⑤
沉淀中加入5％乙酸溶液复溶，100℃水解1h，透析除盐后，deae sepharose fast flow离子交换柱层析，分段收集，sec-hplc跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤除盐、冻干；平行2次试验，得到脆弱拟杆菌荚膜多糖a分别命名为“s3”和“s4”。
90.(3)实验结果
91.两种制备方法所得脆弱拟杆菌荚膜多糖的比较结果见表1。
92.表1、两种制备方法所得脆弱拟杆菌荚膜多糖a的质量属性比较
93.94.上述样品分别记为：s1-psa、s2-psa、s3-psa、s4-psa。
95.实施例2、脆弱拟杆菌荚膜多糖a防治ad的效果验证
96.一、实验方法
97.动物：本实验选取spf级sd大鼠90只，8周龄，雌雄各半，体质量200g-240g。
98.动物分组：90只sd大鼠，雌雄各半，按照随机数字表法分为9组，每组雌雄各5只，分别为假手术组，模型组，s1-psa低、中、高剂量组，s3-psa低、中、高剂量组，盐酸多奈哌齐组(阳性药组)，详见表2。
99.ad模型制备：9组大鼠均用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，剃去脑顶局部毛发，把大鼠平颅头部固定在脑立体定位仪上，碘伏常规皮肤消毒，用无菌手术刀在头皮正中线位置切一纵行切口，长约1.5cm，充分暴露前卤，根据大鼠脑立体定位图谱在脑正中线左右旁开2.0mm，前囟后3.0mm两侧分别用无菌牙科钻钻孔，钻孔深度为3mm，避免颅脑内出血。除假手术组，各组大鼠均缓慢注射5μl凝聚态aβ
1-40
(β-淀粉样蛋白，1μl/min)，进针深度4.0mm。假手术组注射等体积生理盐水溶液，注射完毕均留针5min，之后缝合伤口，并于伤口处使用阿米卡星喷雾，预防伤口感染。术后常规饲养1周。1周后，所有大鼠进行水迷宫试验，造模大鼠逃避潜伏期与假手术组相比逃避潜伏期长且有明显差异，则判定造模成功，最终全部造模成功。
100.给药：实验药物用量按体表面积比率换算，s1-psa高、中、低剂量组和s3-psa高、中、低剂量组分别配置以5mg/kg、3mg/kg、1mg/kg灌胃。盐酸多奈哌齐组将盐酸多奈哌齐片研碎成粉末，制成混悬液以1.02mg
·
kg-1
灌胃，相当于成人日用剂量的6倍。假手术组与模型组大鼠每日予生理盐水灌胃。各组灌胃容积为10ml/kg，连续灌胃10周，详见表2。
101.表2、动物分组及给药
[0102][0103]
morris水迷宫简介：morris水迷宫是英国心理学家morris于20世纪80年(1981)代初设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段，其在ad研究中的应用非常普遍。较为经典的morris水迷宫，测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。其中定位航行试验历时数天，每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻
找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期)。一般ad越严重，大鼠的逃避潜伏期越长。空间探索试验是在定位航行试验后去除平台，然后任选一个入水点将大鼠放入水池中，记录其在一定时间内的游泳轨迹，考察大鼠对原平台的记忆。一般ad越严重，大鼠穿越平台次数越少，有效区域停留时间越短，有效区域运动路程越短。
[0104]
morris水迷宫行为实验：连续灌胃10周结束后，进行morris水迷宫行为实验。实验连续5天，分为进行定位航行和空间探索实验。定位航行实验历时4天，记录动物从投放入水至寻找并爬上站台所需时间，即逃避潜伏期。如120s内未找到站台，潜伏期记录为120s。第5天进行空间搜索实验，撤下原有站台，记录大鼠120s内穿越平台次数、有效区(站台直径2倍范围)停留时间及有效区游泳路程。
[0105]
统计学分析：数据以表示，采用spss 23.0进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(anova)，方差齐时，组间均值两两比较采用snk法；若方差不齐，改用邓尼特t3(dunnett t3)检验，以p《0.05表示差异有统计学意义。
[0106]
二、结果与分析
[0107]
口服脆弱拟杆菌荚膜多糖a对aβ诱导的sd大鼠的影响结果见表3和表4。
[0108]
表3、荚膜多糖a对aβ诱导的sd大鼠在水迷宫测试中逃避潜伏期的影响
[0109][0110]
注:与假手术组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01；与模型组比较
#
p＜0.05，
##
p＜0.01。
[0111]
如表3所示，各给药组雌雄大鼠在水迷宫的逃避潜伏期随着训练时间及次数的增加而缩短。第4天，与假手术组比较，模型组雌雄大鼠的逃避潜伏期显著延长(p＜0.01)，说明造模成功；与模型组比较，脆弱拟杆菌荚膜多糖a给药组雌雄大鼠的逃避潜伏期明显缩短
(p＜0.05，p＜0.01)，说明脆弱拟杆菌的荚膜多糖a可以改善aβ诱导的sd大鼠的ad症状。
[0112]
表4、荚膜多糖a对aβ诱导的sd大鼠在水迷宫测试中空间探索的影响
[0113]
组别穿越平台次数/次有效区域停留时间/s有效区域运动路程/mm假手术5.38
±
0.745.98
±
0.68837.31
±
75.03模型3.25
±
0.74
**
3.71
±
0.54
**
624.74
±
82.42
**
多奈哌齐4.13
±
0.43
##
4.34
±
0.60
##
691.60
±
43.00
##
s1-psa低剂量组4.19
±
0.63
#
4.43
±
0.45
#
703.58
±
73.55
##
s1-psa中剂量组4.62
±
0.60
#
5.18
±
0.66
##
757.38
±
93.64
##
s1-psa高剂量组4.35
±
0.77
#
4.75
±
0.76
#
733.21
±
64.29
##
s3-psa低剂量组4.33
±
0.63
#
4.56
±
0.35
#
722.53
±
80.25
##
s3-psa中剂量组4.89
±
0.45
#
5.43
±
0.62
##
789.64
±
87.20
##
s3-psa高剂量组4.45
±
0.77
#
4.82
±
0.79
#
754.29
±
68.39
##
[0114]
注：与假手术组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01；与模型组比较
#
p＜0.05，
##
p＜0.01。
[0115]
从表4结果可以看出，与假手术组比较，模型组雌雄大鼠穿越平台次数、有效区域停留时间及运动路程均显著减少(p＜0.01)；与模型组比较，给药多奈哌齐和脆弱拟杆菌荚膜多糖a均能提高大鼠穿越平台次数、有效区域停留时间及运动路程，其中脆弱拟杆菌荚膜多糖a组雌雄大鼠穿越平台次数、有效区域停留时间及运动路程增加更显著(p＜0.05，p＜0.01)。
[0116]
由以上实验结果可见，本发明提供的脆弱拟杆菌荚膜多糖a可以防治ad。
[0117]
实施例3、脆弱拟杆菌荚膜多糖a联合多奈哌齐防治ad的效果验证
[0118]
一、实验方法
[0119]
动物：本实验选取spf级sd大鼠90只，8周龄，雌雄各半，体质量200g-240g。
[0120]
动物分组：110只sd大鼠，雌雄各半，按照随机数字表法分为11组，每组雌雄各5只，分别为假手术组，模型组，s2-psa中剂量组，s2-psa低、中、高剂量联合多奈哌齐组，s4-psa中剂量组，s4-psa低、中、高剂量多奈哌齐组，盐酸多奈哌齐组(阳性药组)，详见表5。
[0121]
ad模型制备：11组大鼠均用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，剃去脑顶局部毛发，把大鼠平颅头部固定在脑立体定位仪上，碘伏常规皮肤消毒，用无菌手术刀在头皮正中线位置切一纵行切口，长约1.5cm，充分暴露前卤，根据大鼠脑立体定位图谱在脑正中线左右旁开2.0mm，前囟后3.0mm两侧分别用无菌牙科钻钻孔，钻孔深度为3mm，避免颅脑内出血。除假手术组，各组大鼠均缓慢注射5μl凝聚态aβ
1-40
(β-淀粉样蛋白，1μl/min)，进针深度4.0mm。假手术组注射等体积生理盐水溶液，注射完毕均留针5min，之后缝合伤口，并于伤口处使用阿米卡星喷雾，预防伤口感染。术后常规饲养1周。1周后，所有大鼠进行水迷宫试验，造模大鼠逃避潜伏期与假手术组相比逃避潜伏期长且有明显差异，则判定造模成功，最终全部造模成功。
[0122]
给药：实验药物用量按体表面积比率换算，s2-psa中剂量组，s2-psa高、中、低剂量联合多奈哌齐组，s4-psa中剂量组，s4-psa高、中、低剂量联合多奈哌齐组，高中低剂量psa分别配置以5mg/kg、3mg/kg、1mg/kg灌胃。盐酸多奈哌齐组将盐酸多奈哌齐片研碎成粉末，制成混悬液以1.02mg
·
kg-1
灌胃，相当于成人日用剂量的6倍。假手术组与模型组大鼠每日予生理盐水灌胃。各组灌胃容积为10ml/kg，连续灌胃10周，详见表5。
[0123]
表5、动物分组及给药
[0124][0125]
较为经典的morris水迷宫，测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。其中定位航行试验历时数天，每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期)。一般ad越严重，大鼠的逃避潜伏期越长。空间探索试验是在定位航行试验后去除平台，然后任选一个入水点将大鼠放入水池中，记录其在一定时间内的游泳轨迹，考察大鼠对原平台的记忆。一般ad越严重，大鼠穿越平台次数越少，有效区域停留时间越短，有效区域运动路程越短。
[0126]
morris水迷宫行为实验：连续灌胃10周结束后，进行morris水迷宫行为实验。实验连续5天，分为进行定位航行和空间探索实验。定位航行实验历时4天，记录动物从投放入水至寻找并爬上站台所需时间，即逃避潜伏期。如120s内未找到站台，潜伏期记录为120s。第5天进行空间搜索实验，撤下原有站台，记录大鼠120s内穿越平台次数、有效区(站台直径2倍范围)停留时间及有效区游泳路程。
[0127]
统计学分析：数据以表示，采用spss 23.0进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(anova)，方差齐时，组间均值两两比较采用snk法；若方差不齐，改用邓尼特t3(dunnett t3)检验，以p《0.05表示差异有统计学意义。
[0128]
二、结果与分析
[0129]
表6、荚膜多糖a联用多奈哌齐对aβ诱导的sd大鼠在水迷宫测试中逃避潜伏期的影响
[0130][0131][0132]
注:与假手术组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01；与模型组比较
#
p＜0.05，
##
p＜0.01，
###
p＜0.001。
[0133]
如表6所示，各给药组雌雄大鼠在水迷宫的逃避潜伏期随着训练时间及次数的增加而缩短。与假手术组比较，模型组雌雄大鼠的逃避潜伏期显著延长(p＜0.05，p＜0.01)，说明造模成功；与模型组比较，脆弱拟杆菌荚膜多糖a组和多奈哌齐的雌雄大鼠的逃避潜伏期明显缩短(p＜0.01)，联用组比单用组具有更短的逃避潜伏期(p＜0.001)。
[0134]
表7、荚膜多糖a联用多奈哌齐对aβ诱导的sd大鼠在水迷宫测试中空间探索的影响
[0135][0136][0137]
注:与假手术组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01；与模型组比较
#
p＜0.05，
##
p＜0.01，
###
p＜0.001。
[0138]
从表7结果可以看出，与假手术组比较，模型组雌雄大鼠穿越平台次数、有效区域停留时间及运动路程均显著减少(p＜0.01)；与模型组比较，脆弱拟杆菌荚膜多糖a单用组和多奈哌齐单用组的雌雄大鼠穿越平台次数、有效区域停留时间及运动路程均增加(p＜0.01)，脆弱拟杆菌荚膜多糖a与多奈哌齐联用组的大鼠穿越平台次数、有效区域停留时间及运动路程具有更明显的增加(p＜0.01，p＜0.001)。
[0139]
由以上实验结果可见，本发明提供的脆弱拟杆菌荚膜多糖a联用多奈哌齐具有更显著的防治ad效果。
[0140]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
[0141]
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的
分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
技术特征：1.脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治阿尔茨海默病的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物包含荚膜多糖a。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖提取物中所述荚膜多糖a的含量大于95wt％。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd；优选的，所述荚膜多糖a的重均分子量为80kd-90kd。4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a中脂质的含量低于0.02wt％。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a中脂质含量低于0.01wt％。6.根据权利要求1至3和5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅料。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂和等渗或等张调节剂中的一种或者多种。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种；或/和，所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种；或/和，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种；或/和，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；或/和，所述溶剂选自水、油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；或/和，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种；或/和，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种；或/和，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；或/和，所述助悬剂选自甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇以及触变胶中的至少一种；或/和，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；或/和，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；或/和，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；或/和，所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种；或/和，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；或/和，所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；或/和，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。9.根据权利要求1至3、5、7和8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液或者管饲制剂；或/和，所述药物的给药途径
为注射给药或者口服给药。10.根据权利要求1至3、5、7和8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂，所述荚膜多糖a与所述乙酰胆碱酯酶抑制剂和/或所述n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂联合使用；优选的，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂包含多奈呱齐、加兰他敏和卡巴拉汀中的一种或者多种；优选的，所述n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂包含美金刚。
技术总结本发明提供一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备防治阿尔茨海默病的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为CGMCC NO.10685，所述荚膜多糖提取物包含荚膜多糖A。与传统技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的发明人经过长期的经验积累及大量创造性实验研究，发现脆弱拟杆菌ZY-312的荚膜多糖A能有效预防和治疗阿尔茨海默病，且该药效在经Morris水迷宫行为实验在动物模型得以验证。采用脆弱拟杆菌ZY-312的荚膜多糖A的提取物制备防治阿尔茨海默病的药物还具有无毒副作用的优势。尔茨海默病的药物还具有无毒副作用的优势。尔茨海默病的药物还具有无毒副作用的优势。
技术研发人员：权利要求书2页说明书13页附图1页
受保护的技术使用者：广州知易生物科技有限公司
技术研发日：2022.02.16
技术公布日：2022/7/5
