编码蛋白panx1和其变体panx1-ts的mrna、及其应用
技术领域
1.本发明属于panx1基因治疗技术领域，涉及编码蛋白panx1和其变体panx1-ts的mrna以及其在制备药物中的应用。
背景技术：2.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)感染是导致器官移植患者术后死亡的重要原因之一。与等其他供体器官移植相比，肝移植患者感染mrsa的风险最高。高达23％的患者发生肝移植后mrsa感染，感染者的30天死亡率高达21％。在临床上，侵入性操作、胆道并发症和广谱抗生素的使用已经确定为mrsa感染的高危因素。在基因水平，目前的研究发现c7和mbl2等几个基因在受者术后感染中起重要作用。此外，肝脏不仅是代谢器官，也是最大的免疫器官，肝移植后受者的免疫状态可能受供者而非受者的肝脏影响。因此，供体肝脏中的遗传易感风险因素，尤其是那些涉及先天免疫防御的风险因素，可能会增加肝移植后mrsa感染的易感性。
3.目前，基因的递送技术通常利用病毒载体及非病毒载体。其中，非病毒载体的mrna递送技术具有很高的应用潜力。mrna的生产过程主要是基于线性化的质粒dna为模板，然后体外转录合成相应的mrna，在通过两端的加帽及加poly(a)。与其他递送技术相比，mrna生产简单，成本不高；mrna表达蛋白的速度快，跳过了dna转录过程；mrna不会整合到细胞基因组长，具有较高的临床安全性。目前，利用mrna作为病毒疫苗或肿瘤疫苗已成为研究的热点。
4.但是现有技术并未有通过mrna递送技术将panx1基因或其变体递送给供体肝脏以实现抑制肝移植后的病原菌尤其是mrsa感染的记载。
技术实现要素：5.为了克服上述技术问题，本发明提供了编码蛋白panx1的mrna或编码蛋白panx1变体panx1-ts的mrna-ts，通过使用一条mrna即可表达panx1基因编码的蛋白panx1或其变体panx1-ts，同时只需要体外转录及脂质体包裹就能制备表达mrna药物，起到有效预防肝移植后受体病原菌尤其是mrsa的感染。
6.本发明第一方面，提供了编码蛋白panx1的mrna，所述mrna的序列如seq id no.1所示。
7.进一步地，本发明还提供了含有上述mrna的重组表达载体，所述重组表达载体的序列如seq id no.3。
8.本发明第二方面，提供了编码蛋白panx1变体panx1-ts的mrna-ts，所述mrna-ts的序列如seq id no.2所示。
9.进一步地，本发明还提供了含有上述mrna-ts的重组表达载体，所述重组表达载体的序列如seq id no.4所示。
10.本发明第三方面，提供了工程化细胞，所述工程化细胞中含有上述第一方面或第
二方面中的重组表达载体。
11.本发明第四方面，还提供了一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒中包含本发明第一方面中编码蛋白panx1的mrna或本发明第二方面中编码蛋白panx1变体panx1-ts的mrna-ts。
12.进一步地，所述脂质体包括但不限于，dmg-peg2000，胆固醇，dodap。
13.本发明第五方面，还提供了一种降低肝移植后受体病原菌感染的药物，所述药物包含本发明第四方面所述的脂质纳米颗粒。
14.本发明第六方面，还提供了本发明第一方面所述的mrna或本发明第二方面所述的mrna-ts在制备降低肝移植后受体病原菌感染的药物中的应用。
15.进一步地，所述病原菌包括但不限于mrsa、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等。
16.本发明相对于现有技术具有的有益效果：
17.1)在肝脏移植手术前，给供体肝脏外源的高表达panx1，会降低肝移植术后的细菌的感染，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染，提高患者的生存率。
18.2)为了提高panx1对下游通路的激活作用，本发明在其c-端添加额外的酪氨酸和丝氨酸磷酸化的位点序列lvepltpsgeapnqallr，并将其命名为panx1-ts。经过试验发现，相对native对照组而言，mrna、mrna-ts灌注组的小鼠生存时间明显延长，各个器官菌载量较少，肝功能等其它器官损伤程度明显减轻。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
20.图1是本发明panx1的mrna质粒结构图谱；
21.图2是本发明panx1-ts的mrna质粒结构图谱；
22.图3是本发明通过像供体肝脏灌输mrna-panx1进行高表达panx1，然后将高表达panx1的肝脏移植到受体小鼠中，在进行mrsa感染或者其它病原菌的感染，观察小鼠的存活率。
具体实施方式
23.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
24.实施例1
25.1、基因片段合成
26.从ncbi上查询panx1蛋白，然后根据人密码子进行相应优化，获得优化后的panx1蛋白mrna，序列如seq id no.1所示。
27.并在上下游加入与puc57互补配对的长15bp的序列，最后通过合成直接获得dna序
列。
28.2、重组质粒puc57-panx1的制备方法如下，
29.puc57载体用saci和hindiii双酶切，酶切体系20μl：puc57载体＜1μg，hindiii 1μl，saci 1μl，10
×
cutsmart buffer 2μl，ddh2o将体系补足20μl。37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μl cip，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物通过dna纯化柱子纯化后，以30μl elution buffer洗脱。
30.分别取panx1基因片段与双酶切载体puc57载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝3:1，2
×
recombinase mix 5μl，ddh2o将体系补足10μl，50℃连接30分钟。将连接产物按体积1:10与大肠杆菌dh5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴1min，加入预热的lb培养基涂布于lb平板(lb-amp平板：含50μg/ml amp的lb平板)，37℃培养16-20h。
31.酶切验证：筛选阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以saci和hindiii进行酶切，将酶切混合物与6
×
loading buffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94v)。
32.测序验证：提取酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃，携带阳性质粒图谱如图1所示，含有氨苄霉素抗性基因(amp)、t7启动子基因、humanβ-globulin5’utr基因、panx1基因、humanβ-globulin 3’utr基因；b是本发明的mrna-panx1-c-ter质粒结构图谱，含有氨苄霉素抗性基因(amp)、t7启动子基因、humanβ-globulin 5’utr基因、6
×
panx1-c-ter基因、humanβ-globulin 3’utr基因，序列如seq id no.3所示。
33.3、puc57-panx1质粒用hindiii酶切线性化及回收方法如下，
34.puc57-panx1质粒10μg，hindiii 1μl，10
×
nebuffer 3.1 5μl，ddh2o将体系补足50μl，50℃水浴1h酶切质粒。将酶切混合物与6
×
loading buffer混合，电泳(1％琼脂糖，94v)并胶回收相应长度的片段，以30μl elution buffer洗脱。
35.实施例2
36.线性化后puc57-panx1质粒使用t7 rna聚合酶开始的体外转录反应(ivt)，turbodnase酶对模板dna进行降解，和加帽酶(vaccinia capping enzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，称为cap 0)加至转录的mrna的5’端，具体方法如下。
37.10x reaction buffer 2μl，ntp每种0.5mm，线性化puc57-panx11μg，t7 rnapolymerase 2μl，补水至20μl，37℃反应1小时后加入，1μlturbotmdnas，10x cappingbuffer 4μl，gtp(10mm)2μl，sam(2mm)2μl，vaccinia capping enzyme 2μl，总体积补水至总体积40μl，37℃反应1小时。使用加帽酶将7-甲基化鸟苷酸帽结构加至转录的mrna的5’端,使用poly(a)polymerase在mrna的3’端加入poly(a)。后补水至200μl再加入7.5m氯化锂120μl混匀后，14000g 4℃离心10分钟，弃上清后用70％酒精清洗沉淀，14000g 4℃离心2分钟，弃上清后风干2分钟，溶解在40μl水内。用分光光度计定量并用aglient 2000验证rna的长度。
38.mrna-panx1与脂类包裹步骤：mrna与脂类(组成包括dmg-peg2000，cholesterol，dodap，5a2-sc8)通过nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mrna包裹进入lnp内。mrna-lnp复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。
39.实施例3
40.western blot检测mrna-panx1在供体肝脏中的表达情况。将供体肝脏灌输mrna-panx1，移植到受体小鼠2天后，切取部分肝脏进行wb检测panx1度表达情况。具体方法：
41.1)供体肝灌注：供肝获取后，将供肝连接至常温机械灌注系统，机械灌注系统温度维持在35-38℃，灌注液中加入携带表达panx1 mrna的lnp，灌注液通过膜氧合器(含氧)氧合后流入门静脉，以2ml/g/min(按肝脏湿重)的速率持续循环灌注，维持门静脉压为10-12mm h2o，持续灌注4-6小时。
42.2)供体肝移植：采用“二袖套法”将mrna-panx1灌注的供体肝脏原位移植入受体小鼠腹腔，术后动物恒温毯复温，复苏后自由进食水，分笼单独喂养，移植2天后二氧化碳处死，取样行进一步检测。
43.3)蛋白样品的处理：在72小时后的肝细胞中加入200μl细胞ripa裂解液后，通过组织研磨进行裂解，待裂解完全后加入sds loading buffer,95℃金属浴5分钟。放在冰上备用。
44.4)western blot检测：
45.电泳：precast sds-page胶，蛋白上样量20μl，电泳条件为200v，30min。
46.电转：使用nc膜，在genscript快速转膜仪中转膜10分钟。
47.封闭：使用1x pbst配制5％fat-free milk作为封闭液,室温封闭20分钟。
48.一抗孵育：使用封闭液将panx1抗体(proteintech)以1：1000进行稀释，在室温下孵育1小时。用1x pbst洗3次，每次5分钟。
49.二抗孵育：使用封闭液稀释二抗，稀释比为1：10000，在室温下孵育1小时。用1xpbst洗3次，每次5分钟。
50.显影：显影液a液：b液＝1：1，在成像系统中进行显影。
51.实施例5
52.在蛋白panx1的c-端添加额外的酪氨酸和丝氨酸磷酸化的位点序列lvepltpsgeapnqallr，并将其命名为panx1-ts，获得优化后的panx1-ts蛋白mrna，序列如seq id no.2所示，并按照实施例1中的质粒构建方法获得携带阳性质粒图谱如附图2所示，序列如seq id no.4所示。
53.同时，按照实施例1-3记载的方法对其在细胞中的表达情况进行验证。
54.实施例4
55.构建小鼠肝移植模型，依据供肝是否经mrna灌注分为native对照组和mrna-panx1,mrna-panx1-ts灌注组，移植后7天待小鼠状态稳定后，分别使用mrsa(107、尾静脉注射)感染两组小鼠，观察小鼠的生存状况，检测小鼠的肝肾功能，血常规以及各个器官的菌载量，以及各个器官的he染色等技术指标，结果如图3所示，表明mrna-panx1-ts灌注组的小鼠生存时间明显延长，各个器官菌载量较少，肝功能等其它器官损伤程度明显减轻。
56.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
技术特征：1.编码蛋白panx1的mrna，其特征在于，所述mrna的序列如seq id no.1所示。2.编码蛋白panx1变体panx1-ts的mrna-ts，其特征在于，所述mrna-ts的序列如seq id no.2所示。3.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有权利要求1所述的mrna或含有权利要求2所述的mrna-ts，所述重组表达载体的序列如seq id no.3或seq id no.4所示。4.工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞中含有权利要求3所述的重组表达载体。5.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质纳米颗粒中包含权利要求1所述的mrna或含有权利要求2所述的mrna-ts。6.根据权利要求5所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质体包括但不限于，dmg-peg2000，胆固醇，dodap。7.一种降低肝移植后受体病原菌感染的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求6所述的脂质纳米颗粒。8.权利要求1所述的mrna或权利要求2所述的mrna-ts在制备降低肝移植后受体病原菌感染的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病原菌包括但不限于mrsa、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等。
技术总结本发明提供了编码蛋白PANX1的mRNA以及编码蛋白PANX1变体PANX1-TS的mRNA-TS，其序列分别如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，同时本发明还提供了含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的mRNA的重组表达载体、工程化细胞及脂质纳米颗粒。更重要的是，本发明在体外制备了含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的mRNA，并将其灌输供体肝脏，移植到受体小鼠2天后发现，本发明提供的mRNA能够有效预防肝移植后受体病原菌尤其是MRSA的感染，为导致器官移植患者术后死亡的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的预防和治疗提供了有效途径，提高了患者的生存率。存率。存率。
技术研发人员：李浩 蒋望 钟林 阙伟涛 王普森
受保护的技术使用者：蒋望
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/5
