基于mcf-7细胞系构建的rar
α
效应物体外筛选方法
技术领域
1.本发明属于环境内分泌干扰物(edcs)离体筛选检测技术领域，特别是涉及一种维甲酸受体α(rarα)转录激活试验方法。
背景技术：2.内分泌干扰物(endocrine disrupting compounds,edcs)指的是能够干扰生物体内激素平衡的一类化合物。由于大多数edcs与内源性激素化合物在结构上具有相似性，因此表现出相应的功能，进而使体内天然激素水平失衡。生物体摄入这些化合物后能够干扰内分泌系统的正常功能，表现为促进或者抑制，从而引起神经、生殖以及免疫等疾病的发生发展。随着越来越多的新型化学品被不断生产和释放，在我们生存的周围环境中已有超过10万种化学品被频繁检出，涉及工业、农业、食品和日用品等诸多行业。而目前已报道的edcs只有1,000多种，仅为已知化学品的冰山一角，仍有更多的未知环境污染物亟待进一步筛查并鉴定其生物学效应。
3.鉴于edcs对人类健康的潜在危害，因此研究化合物的内分泌干扰效应的筛选检测及其作用机制对于化合物的健康风险评价尤为重要。相较于活体筛选方法，离体筛选具有更多的优势，包括响应灵敏度高、检测速度快、经济效益好、适用于高通量检测等。由于edcs干扰机体内分泌系统的途径主要是通过核受体介导的，因此在离体筛选中也多用关键核受体作为独立靶点进行相应配体的筛选。目前较有影响力的直接影响核受体功能的离体筛选方法主要有基于雌激素受体(er)的转录激活试验和竞争结合试验、基于雄激素受体(ar)的竞争结合试验等。此外，还有一些edcs是通过影响激素合成以干扰内分泌系统的，针对这类化合物的离体筛选方法主要有类固醇合成试验和芳香化酶合成试验等。
4.目前针对维甲酸受体(rars)已经开发了几种生物测定法来筛选rars的潜在配体，旨在发现更多具有内分泌干扰作用的污染物，并评估其环境污染带来的健康风险。基于rars的edcs离体筛选方法主要包括酵母双杂交试验和luc报告基因试验。
5.通过使用报告基因、人rars基因和共激活因子tif2构建的重组酵母模型是一种流行的酵母双杂交检测方法。这种方法已成功应用于各种研究，包括筛选多种化学物质的rars激动活性，鉴定废水和城市河流中具有维甲酸受体α(retinoic acid receptorα，rarα)激动或拮抗作用的edcs污染。将含有人视黄酸受体γ(rarγ)基因的质粒与含有共激活因子tif2的质粒共同转入酵母细胞后得到重组酵母，并利用此酵母细胞开展化合物筛查，发现有机氯农药、烷基酚等多种化合物具有一定的rarγ激活作用。除了利用酵母细胞构建筛选体系，人类和哺乳类离体细胞也常用于构建筛选体系。例如，以人源hela细胞构建的含有报告基因及不同亚型rars基因的重组细胞系用于有机氯农药的筛选，已达到区分化合物对rarα、rarβ和rarγ的激动或拮抗作用。
6.针对rars的离体筛选方法的开发尚处于起步阶段，有待更多更新的方法开发以评估化合物调控维甲酸受体产生的内分泌干扰效应。其中rarα亚型在脊椎动物的生殖、内稳态、突触可塑性、肿瘤发生等生理和病理过程中尤为重要，使其更易成为edcs的靶点。因此，
有必要针对rarα亚型建立较为完善的edcs离体筛选体系。
7.本技术发明人在研究中发现：现有的rarα介导的离体筛选体系多应用酵母双杂交系统，尽管该方法为靶向rarα的edcs筛查提供了一定的支持，但仍然存在一定的局限性：1.我们知道，较低等的酵母细胞缺乏更多转录过程所必须的辅因子，而真实细胞环境有阻遏因子的存在，因此只转入一个tif2共激活因子并不能真实反映化合物对rarα的转录激活或抑制，可能会产生与人类健康效应不一致的结果；2.与哺乳动物细胞相比，酵母细胞的传代次数较少，无法维持细胞活力，不适合自动化高通量筛选。因此，仍需要在更为复杂的哺乳类细胞基础上构建rarα介导的筛选体系，以更准确地评价污染物对人体产生的潜在内分泌干扰效应。
技术实现要素：8.为了解决上述问题本发明提供了一种以人乳腺癌细胞系mcf-7为宿主、通过瞬时转染luc报告基因载体与人rarα表达载体而构建的rarα效应物体外筛选方法，目的在于更真实的反映化合物对rarα产生的激动/拮抗作用，从而起到准确评估化学品安全使用的作用。本发明是通过如下技术方案实现的：
9.一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，包括以下步骤：
10.step1，构建rarα表达载体
11.1)通过基因合成人源rarα受体的转录本序列nm_000964.4，其两端含有nhei和ecori的酶切位点；
12.2)将商品化的载体pef1α-ires-tagrfp和rarα合成片段分别经过nhei和ecori双酶切消化，获得具有粘性末端的新载体骨架片段和rarα片段；
13.3)用t4 dna连接酶将两个片段重组形成rarα表达载体pef1α-rarα-rfp，并转化至e.coli dh5α菌株进行质粒扩增；
14.4)对rarα表达载体pef1α-rarα-rfp进行去内毒素的大量提取，使质粒的终浓度》500ng/μl；
15.step2，细胞转染
16.1)将mcf-7细胞复苏并置于37℃、5％co2细胞培养箱传代培养，所用培养基为完全培养基；
17.2)种板；当细胞传代稳定后，将mcf-7细胞接种于带孔白板中，细胞密度为4
×
104细胞/孔，并置于37℃、5％co2细胞培养箱中过夜使其贴壁生长；
18.3)转染；当细胞汇合度为80％时，开始执行细胞转染，所用转染方法为阳离子脂质交换法；
19.step3，化合物暴露及报告基因检测
20.1)化合物暴露；待转染过程结束后，将细胞用无明显细胞毒性的不同浓度的待测化合物进行暴露，暴露时间为24h，暴露培养基为无酚红dmem增补1％cs-fbs和1％的双抗；
21.2)萤火虫荧光素酶(luc)活性检测；用检测试剂盒测定化合物暴露24h后的luc活性，检测方法为单荧光素酶试验(mono-luc assay)。
22.进一步地，在step2中，所述完全培养基是指：在dmem高糖基础培养基中加入10％胎牛血清(fbs)和1％的双抗。
23.进一步地，在step2中，所述种板是将mcf-7细胞接种于底部透明的96孔白板中，细胞密度为4
×
104细胞/孔，将细胞放在转染培养基中培养，培养环境为无酚红dmem增补10％charcoal-stripped fbs(cs-fbs)和1％的双抗。
24.进一步地，在step3的步骤1)中，为了检测化合物的激动活性，将转染后的细胞直接暴露于不同浓度的待测化合物中，其中，待测化合物中的dmso含量≤0.1％，以0.1％的dmso作为对照组。
25.进一步地，在step3的步骤1)中，为了检测化合物的拮抗活性，在不同浓度的化合物中加入25nm的am580，其中，待测化合物和am580中所含dmso的总量≤0.1％，以只含有25nm的am580组作为对照组。
26.进一步地，所述双抗是指：浓度为100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。
27.进一步地，若待测化合物表现出rarα激动活性或是拮抗活性，则判断待测化合物是一种潜在的内分泌干扰物。
28.进一步地，若萤火虫荧光素酶(luc)相对活性(fold change)出现显著升高，则判断待测化合物具有rarα激动活性。
29.进一步地，若萤火虫荧光素酶(luc)相对活性(％)低于50％，则判断待测化合物具有rarα拮抗活性。
30.进一步地，激动剂am580的ec
50
值为0.87nm，最小可观察效应浓度(loec)为0.1nm；拮抗剂ro41-5253的ic
50
值为2.67μm，最小可观察效应浓度(loec)值为0.625μm。
31.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
32.1.利用离体的人源细胞作为宿主细胞，可以最大程度的反映外源化学品对人类健康的潜在内分泌干扰效应。
33.2.阳性激动剂am580和拮抗剂ro41-5253均产生了良好的剂量-效应关系，呈现典型的“s”形曲线或倒“s”形曲线。
34.3.方法的灵敏度较高，激动剂am580的ec
50
值为0.87nm，最小可观察效应浓度(loec)为0.1nm；拮抗剂ro41-5253的ic
50
值为2.67μm，loec值为0.625μm。
35.4.方法的响应区间较宽，激动剂am580的线性范围为0.02-50nm，拮抗剂ro41-5253的线性范围为0.125-10μm。
36.5.方法的重现性较好，am580和ro41-5253诱导的各浓度相对标准偏差(rsd)均《25％。
37.6.经双荧光素酶试验的鉴定，明确了方法的结果精确性和可靠性良好。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1为本技术的基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法的流程示意图；
40.图2为本技术的基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法中所用载体结构图；
41.图3为本技术的基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法的筛选体系经阳性激动剂和拮抗剂的认定结果；
42.图4为本技术的基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法的筛选体系应用于外源化合物的实际筛查。
具体实施方式
43.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.如图1-4所示，按照图1的流程，利用图2所示载体转染mcf-7细胞，图3结果为以阳性激动剂am580和阳性拮抗剂ro41-5253作为外源化合物检测筛选体系的灵敏度和稳定性，图4为该筛选体系应用于7种新型酚类化合物的效应鉴定。具体如下所述。
45.第一步，构建如图2-b所示rarα表达载体。
46.1.通过基因合成人源rarα受体的转录本序列nm_000964.4，其两端含有nhei和ecori的酶切位点。其中，
47.nhei酶切位点：gctagc
48.ecori酶切位点：gaattc
49.2.将商品化的载体pef1α-ires-tagrfp和rarα合成片段分别经过nhei和ecori双酶切消化，获得具有粘性末端的新载体骨架片段和rarα片段。
50.3.用t4 dna连接酶将两个片段重组形成rarα表达载体pef1α-rarα-rfp，并转化至大肠杆菌(e.coli)dh5α菌株进行质粒扩增。
51.4.对rarα表达载体进行去内毒素的大量提取，使质粒的终浓度》500ng/μl，以满足转染需求。
52.第二步，细胞转染。
53.1.mcf-7细胞复苏并传代培养。所用培养基为完全培养基，即dmem高糖基础培养基中加入10％胎牛血清(fbs)和1％的双抗(终浓度为100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)。将细胞置于37℃、5％co2细胞培养箱进行培养。
54.2.种板。当细胞传代稳定后(一般为2-5代)，将mcf-7细胞接种于底部透明的96孔白板中，细胞密度为4
×
104细胞/孔，此时细胞在转染培养基中培养，即无酚红dmem增补10％charcoal-stripped fbs(cs-fbs)和1％的双抗。将细胞置于37℃、5％co2细胞培养箱中过夜使其贴壁生长。
55.3.转染。当细胞汇合度为80％时，开始执行细胞转染，所用转染方法为阳离子脂质交换法，所用转染试剂为lipofectamine 3000。a.准备2支1.5ml离心管，在管1中加入5μl/孔的减血清培养基opti-mem i和0.2μl/孔lipofectamine 3000转染试剂；在管2中依次加入5μl/孔的opti-mem i培养基、50ng/孔的报告载体prare-ta-luc(图2-a)、50ng/孔的rarα表达载体pef1α-rarα-rfp(图2-b)和0.2μl/孔的p3000试剂。其中，lipofectamine 3000和p3000同为转染试剂盒中的试剂；报告载体prare-ta-luc为商品化载体(图2-a)，使用前需进行去内毒素的质粒大提，终浓度》500ng/μl。b.将管2中的溶液加入到管1中，充分混匀，室
温孵育15min。c.将孵育后的转染复合物按照10μl/孔的用量加入到位于96孔白板的细胞培养基中。d.在37℃、5％co2细胞培养箱中持续培养4h，完成质粒转染过程。以上转染过程可参考lipofectamine 3000转染试剂盒(thermo fisher scientific，美国)说明书。
56.第三步，化合物暴露及报告基因检测。
57.1.化合物暴露。待转染过程结束后，将细胞用无明显细胞毒性(细胞活力》80％)的各浓度待测化合物进行暴露。用暴露培养基将二甲基亚砜(dmso)配制的化合物储备液稀释成一系列浓度。a.如果是为了检测化合物的激动活性，则将转染后的细胞直接暴露于稀释后的各浓度化合物中(dmso含量≤0.1％)，以0.1％的dmso作为对照组；b.如果是为了检测化合物的拮抗活性，则应在各浓度化合物中包含25nm的am580，待测化合物和am580中所含溶剂dmso的总量≤0.1％，并以只含有25nm的am580组作为对照组。化合物暴露时间为24h，每个待测化合物浓度至少设置3个孔重复。其中，暴露培养基为无酚红dmem增补1％cs-fbs和1％的双抗；阳性化合物分别为选择性rarα激动剂am580、rarα天然内源性激动剂全反式维甲酸(atra)和选择性rarα拮抗剂ro41-5253；7种待鉴定的新型酚类化合物包括四溴双酚a(tbbpa)、三氯生(tcs)、二溴苯酚(2,4-dbp)、三溴苯酚(2,4,6-tbp)、3-叔丁基-4-对羟基苯甲醚(3-bha)、双酚a(bpa)和4-己基苯酚(4-hp)。
58.2.萤火虫荧光素酶(luc)活性检测。使用luciferase assay system检测试剂盒测定化合物暴露24h后的luc活性，为单荧光素酶试验(mono-luc assay)。a.用无菌水将5
×
lysis buffer稀释成1
×
裂解液，并平衡至室温；b.用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞2次；c.向细胞中加入20μl/孔的稀释裂解液，室温孵育20min，并将96孔白板的透明底用白色封底膜密封；d.在避光条件下，向细胞裂解物中加入80μl/孔的luciferase assay reagent底物试剂；e.在酶标仪中读取各孔产生的化学发光强度，设置读取时长为1s/孔。该检测过程参考luciferase assay system检测试剂盒(promega，美国)说明书。
59.3.结果分析。利用阳性的选择性激动剂am580和选择性拮抗剂ro41-5253分别对rarα激动或拮抗活性效应物的体外筛选方法进行了评估。如图3-a和b所示，在mono-luc assay检测下，阳性激动剂am580和拮抗剂ro41-5253均产生了良好的剂量-效应关系，呈现典型的“s”形曲线或倒“s”形曲线；该方法具有较高的灵敏度，am580的ec
50
值和ro41-5253的ic
50
值分别为0.87nm和2.67μm，am580和ro41-5253的最小可观察效应浓度(loec)分别为0.1nm和0.625μm；该方法具有较宽的响应区间，am580和ro41-5253的线性范围分别为0.02-50nm和0.125-10μm；该方法具有较好的重现性，am580和ro41-5253诱导的各浓度相对标准偏差(rsd)均《25％。
60.对于7种待鉴定的新型酚类化合物，以luc相对活性(fold change)出现显著升高作为化合物具有rarα激动活性的判断，以luc相对活性(％)低于50％作为化合物具有rarα拮抗活性的判断。如图4-a所示，7种化合物均没有呈现出激动活性，而同期的rarα天然内源底物atra展现出良好的激动活性。如图4-b所示，7种化合物均表现出一定的拮抗效应，但只有tbbpa和tcs两种化合物的luc相对活性(％)低于50％，因此这两种化合物具有rarα拮抗活性。无论化合物表现出rarα激动活性还是拮抗活性，都预示着该化合物是一种潜在的内分泌干扰物。
61.第四步，双荧光素酶报告试验。
62.在方法开发时，为了检验阳性化合物对rarα产生的激动/拮抗效应的精确性和可
靠性，我们使用双荧光素酶报告试验(dual-luc assay)进行检测，并与单荧光素酶试验结果进行比较。我们引入了海肾荧光素酶(rluc)表达载体pgl4.74(图2-c)作为内参，用于对luc活性进行校正。按照第二步描述的细胞转染过程，在配制转染复合物时，管2中除了加入luc报告载体和rarα受体载体，再加入10ng/孔的rluc报告载体pgl4.74(图2-c)，其余过程不变。在报告基因的检测时，使用dual-glo luciferase assay system双荧光素酶检测试剂盒(promega，美国)，按照说明书要求对体系中的luc和rluc分别进行活性检测，以每孔中luc与rluc的化学发光强度的比值作为该孔样品校正后的luc活性。如图3所示，从结果来看，单、双荧光素酶试验的检测结果都是高度相似，证实了mono-luc assay检测系统响应激动剂和拮抗剂诱导的可靠性，从转染体系的简化角度和检测试剂的成本角度考虑，选择luc单报告基因用于筛选具有rarα激动/拮抗效应的外源化合物。本步内容用于验证本技术方法的正确性。
63.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：1.一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：step1，构建rarα表达载体1)通过基因合成人源rarα受体的转录本序列nm_000964.4，其两端含有nhei和ecori的酶切位点；2)将商品化的载体pef1α-ires-tagrfp和rarα合成片段分别经过nhei和ecori双酶切消化，获得具有粘性末端的新载体骨架片段和rarα片段；3)用t4 dna连接酶将两个片段重组形成rarα表达载体pef1α-rarα-rfp，并转化至e.coli dh5α菌株进行质粒扩增；4)对rarα表达载体pef1α-rarα-rfp进行去内毒素的大量提取，使质粒的终浓度>500ng/μl；step2，细胞转染1)将mcf-7细胞复苏并置于37℃、5％co2细胞培养箱传代培养，所用培养基为完全培养基；2)种板；当细胞传代稳定后，将mcf-7细胞接种于带孔白板中，细胞密度为4
×
104细胞/孔，并置于37℃、5％co2细胞培养箱中过夜使其贴壁生长；3)转染；当细胞汇合度为80％时，开始执行细胞转染，所用转染方法为阳离子脂质交换法；step3，化合物暴露及报告基因检测1)化合物暴露；待转染过程结束后，将细胞用无明显细胞毒性的不同浓度的待测化合物进行暴露，暴露时间为24h，暴露培养基为无酚红dmem增补1％cs-fbs和1％的双抗；2)萤火虫荧光素酶(luc)活性检测；用检测试剂盒测定化合物暴露24h后的luc活性，检测方法为单荧光素酶试验(mono-luc assay)。2.如权利要求1所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，在step2中，所述完全培养基是指：在dmem高糖基础培养基中加入10％胎牛血清(fbs)和1％的双抗。3.如权利要求1所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，在step2中，所述种板是将mcf-7细胞接种于底部透明的96孔白板中，细胞密度为4
×
104细胞/孔，将细胞放在转染培养基中培养，培养环境为无酚红dmem增补10％charcoal-stripped fbs(cs-fbs)和1％的双抗。4.如权利要求1所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，在step3的步骤1)中，为了检测化合物的激动活性，将转染后的细胞直接暴露于不同浓度的待测化合物中，其中，待测化合物中的dmso含量≤0.1％，以0.1％的dmso作为对照组。5.如权利要求1所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，在step3的步骤1)中，为了检测化合物的拮抗活性，在不同浓度的化合物中加入25nm的am580，其中，待测化合物和am580中所含dmso的总量≤0.1％，以只含有25nm的am580组作为对照组。6.如权利要求2或3所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其
特征在于，所述双抗是指：浓度为100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。7.如权利要求1所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，若待测化合物表现出rarα激动活性或是拮抗活性，则判断待测化合物是一种潜在的内分泌干扰物。8.如权利要求7所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，若萤火虫荧光素酶(luc)相对活性(fold change)出现显著升高，则判断待测化合物具有rarα激动活性。9.如权利要求7所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，若萤火虫荧光素酶(luc)相对活性(％)低于50％，则判断待测化合物具有rarα拮抗活性。10.如权利要求1-9之一所述的一种基于mcf-7细胞系构建的rarα效应物体外筛选方法，其特征在于，激动剂am580的ec
50
值为0.87nm，最小可观察效应浓度(loec)为0.1nm；拮抗剂ro41-5253的ic
50
值为2.67μm，最小可观察效应浓度(loec)值为0.625μm。
技术总结本申请涉及一种基于MCF-7细胞系构建的RARα效应物体外筛选方法，包括以下步骤：Step1，构建RARα表达载体；Step2，细胞转染；Step3，化合物暴露及报告基因检测。本申请利用离体的人源细胞作为宿主细胞，可以最大程度的反映外源化学品对人类健康的潜在内分泌干扰效应。并且，本申请的方法的灵敏度较高，激动剂AM580的EC
技术研发人员：周群芳 徐汉卿 杨晓溪 刘倩 苏佳惠 江桂斌
受保护的技术使用者：中国科学院生态环境研究中心
技术研发日：2022.01.27
技术公布日：2022/7/5
