1.本发明涉及生物检测领域，更具体的涉及一种碱性磷酸酶标记抗体及其制备方法。
背景技术：2.金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素很稳定，不易被破坏。金葡菌可产生a、b、c、d、e、f等多种肠毒素。金葡菌性食物中毒以a型肠毒素引起者最多。肠毒素对热的抵抗力极强,加热至100℃、30分钟不能完全破坏，仍能使人致病，其中以b型最耐热，c型次之，a型最差。
3.目前，针对金黄色葡萄球菌的检测主要是以检测a型肠毒素为主。在检测中，通常有分子生物学的方法以及免疫学的方法，当然还有动物学试验方法，常选用幼猫和猴为受试对象，喂食或腹腔注射含有肠毒素的菌株培养液，动物会发生呕吐、腹泻等现象。由于各种动物对肠毒素反应的敏感性不一致，灵敏性差，容易产生假阴性结果；其他非肠毒素类物质可以对肠毒素的作用产生干扰，也容易产生假阳性的结果。另外实验用动物来源困难，成本较高，这种方法的应用受到很大的限制。分子生物学方法在肠毒素基因检测、研究肠毒素基因的表达情况和各型之间的关系，深入认识其毒素性质方面的重要作用日益凸显。此方法快速敏感、特异性强、操作简便、重复性好、检测周期短、使用标本量少，可用于高流通量检测，近年来发展迅速，在食物中毒检测、临床诊断、流行病学调查中具有重要的应用价值，但是分子生物学方法通常需要使用pcr仪，在应用时具有器材上的局限性，并不适宜于大面积使用或者在偏远地区快速检测使用。
4.适配体传感器方法虽然特异性和灵敏度较好，但存在操作复杂和技术不稳定等问题。已经建立的定量检测肠毒素蛋白的方法主要还是基于免疫学方法。其中，酶联免疫法（elisa）是利用抗体与对应抗原发生特异性结合这一性质，通过将特定抗体/抗原作为选择性试剂来对相应待测抗原/抗体进行分析测定的方法，具有分析时间短、灵敏度高、特异性好的优点。目前已经建立了双抗夹心(double-antibody sandwich，das)-elisa检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素的方法，比如in340119a1中就公开了一种特异性检测样品中金黄色葡萄球菌肠毒素b产生菌株的斑点elisa方法，包括：(a)在添加浓度为0.5mm-5mm的edta的选择性富集胰蛋白胨酵母提取物肉汤中从样品中培养培养10-12小时；(b)干燥斑点在硝酸纤维素膜上的培养物；(c)用5%的封闭剂在磷酸盐缓冲盐水中在环境温度下封闭硝化纤维素膜40-50分钟；(d)将阻断的硝酸纤维素膜与兔抗蛋白a以1:300-1:500的浓度孵育1小时，其中兔抗蛋白a与金黄色葡萄球菌产生的可溶性和表面蛋白a结合，减少葡萄球菌蛋白a对斑点elisa的干扰；(e)用产生的单克隆抗体se-241孵育前一步骤中与兔抗蛋白a孵育的阻断的硝酸纤维素膜持续45分钟，所述单克隆抗体的特征在于抗重组嵌合te蛋白；(f)用酶标记的二抗孵育用兔抗蛋白a和单克隆抗体se-241孵育的硝酸纤维素膜；和(g)基于与酶-底物反应相关的颜色变化，检测样品中是否存在产生肠毒素b的金黄色葡萄球菌菌株。但是目前，针对肠毒素a的检测
还不够多。
技术实现要素：5.本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种特异性针对金黄色葡萄球菌肠毒素a的单克隆抗体3a6，其轻链可变区的氨基酸序列为：dlvmtqtapsvpvtpgesvsiscrstfnyysfepgdglywflqrpgqspqlliyymdnlasgvpdrfsgsgsgtaftlrisrveaedvgvyycestlaewpafgsgtkleik重链可变区的氨基酸序列为：vkpggslklscaasdykgrdwlmswvrqtpdkrlewvaiaihksevlyypdsvkgrftisrdqdkqtlylqmsslksedtamyycgnhhswaianewgqgttvtvs。
6.所述抗体为能够结合金黄色葡萄球菌的肠毒素a的抗体变体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与seq id no：1至少85％相同，而所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与seq id no：2至少85％相同。
7.进一步的，本发明的单克隆抗体的可变区序列可以被保守取代。保守替代意指将属于特定物理-化学组的一个氨基酸用属于同一物理-化学组的氨基酸替换。物理-化学组如下定义：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸。具有不带电荷的极性侧链的氨基酸组包含天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、和胱氨酸。具有带正电荷的极性侧链的氨基酸的物理-化学组包含赖氨酸、精氨酸、和组氨酸。具有带负电荷的极性侧链的氨基酸的物理-化学组包含天冬氨酸和谷氨酸，其羧酸根阴离子又称为天冬氨酸根和谷氨酸根。
8.进一步的，本发明提供一种能够特异性检测金黄色葡萄球菌的肠毒素a的试剂盒，所述试剂盒含有金黄色葡萄球菌的肠毒素a的单克隆抗体。
9.进一步的，本发明提供金黄色葡萄球菌的肠毒素a的单克隆抗体在制备检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的试剂盒中的用途。
10.进一步的，本发明提供金黄色葡萄球菌的肠毒素a的单克隆抗体在制备检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的试纸条中的用途。
11.进一步的，本发明提供金黄色葡萄球菌的肠毒素a的单克隆抗体在制备检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的蛋白芯片中的用途。
12.蛋白芯片还包括阴性质控点、阳性质控点、样品质控点、酶标质控点、参考曲线点以及位置参考点中的一个或两个以上；更为具体地，至少有一个阴性质控点(nc)和一个阳性质控点(pc)；至少一个样品点质控点(sc)和一个酶标质控点(ec)；至少3个参考曲线点(s1-s3)以及一个芯片本身包被的位置参考点(loc)。
13.在具体实施方式中，本发明蛋白芯片上还包含一个阴性质控点(nc)和一个阳性质控点(pc)；一个样品点质控点(sc)和一个酶标质控点(ec)；3个参考曲线点(s1-s3)以及一个芯片本身包被的位置参考点(loc)。
14.其中，阳性质控点可以是人igg，则对应使用的酶标抗体就是抗人igg的酶标。阳性质控点也可以是包被bsa偶联的bnp，则对应使用的酶标抗体就是抗人igg的酶标以及抗bnp的酶标的混合液。
15.而阴性质控点可以是低于反应信号值的微量浓度的人igg，或采用其他的无关蛋
白来替代；样品质控点可以是羊抗人的igg或其他的抗人igg；酶标质控点可以是人igg，或其他的抗兔的抗体，例如羊抗兔igg抗体。所述参考曲线点在具体实施过程中是低、中、高三种浓度的人igg。
16.蛋白芯片本身的位置参考点是含有0.2％的2,9-二甲基喹吖啶酮的dmso溶液，或是含有任何除蓝色之外其他颜色的油溶性染剂，与有机溶剂配伍，按一定比例配比，形成有机着色剂，主要对蛋白芯片上阵列 的起定位作用。
17.进一步的，本发明提供金黄色葡萄球菌的肠毒素a的单克隆抗体在制备检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的elisa检测试剂盒中的用途。
18.所述elisa试剂盒中的单克隆抗体别标记。所述标记为碱性磷酸酶标记。具体的碱性磷酸酶标记抗体，具体流程如下：取碱性磷酸酶ap溶于nahco3缓冲液中；加过碘酸钠，室温下避光轻搅0.5h；加乙二醇，室温下轻搅，终止氧化；在cb缓冲液中4℃透析过夜；于醛化ap中加含抗体的cb缓冲液，室温避光轻搅；加入nahb4，放4℃过夜；在pbs中4℃透析24h；4℃，4000rpm离心30min，除去沉淀即得到标记的单克隆抗体。
19.本发明制备的elisa试剂盒最低检测下限可以达到0.1ug/l，具有较好的检测效果，而且特异性较好。
20.有益效果本发明本发明提供金黄色葡萄球菌的肠毒素a的单克隆抗体与现有技术的单克隆抗体相比，具有更高的灵敏度和特异性。将所述单克隆抗体制备成为elisa检测试剂盒可以具有最低检测下限可以达到0.1ug/l的灵敏度，并由此开发了快速简易的免疫检测产品，应用价值广泛。
附图说明
21.图1 肠毒素a的western-blot鉴定结果图图2 单克隆抗体 ig 亚类的鉴定结果图
具体实施方式
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.实施例1 金黄色葡萄球菌新型肠毒素a的制备根据金黄色葡萄球菌新型肠毒素a的基因序列，设计了扩增引物对：sea-p1：5
’‑
cgcggatccatgaaaaaaacagcatttat-3’；sea-p2：5
’‑
cgcctcgagttaacttgtatataaatatat-3’，引物序列分别加入bamhⅰ（ggatcc）、xholⅰ（ctcgag）酶切位点。挑取金黄色葡萄球菌单菌落，采用煮沸法简单裂解细胞获得含有dna的溶液，取上清作为pcr模板。pcr反应条件：94℃热变性5min后，94℃变性1min，53℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。pcr体系为25μl。pcr产物纯化（按上海生工公司的纯化试剂盒说明书进行）后经bamhⅰ、xholⅰ酶切，37℃水浴3h后电泳切胶纯化，将电泳纯化的sea酶切产物与经相同酶切的pet-28a（＋）质粒载体、t4dna连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α，铺lb平板
（含卡那霉素50μg/ml），35℃温箱过夜。挑取经卡那霉素筛选的阳性菌落于lb液中摇菌过夜。提取 pet-28a（＋）-sea/dh5α质粒，转化感受态大肠杆菌 bl21。
24.在上述转化bl21的平板中挑单菌落于lb液体培养基中（含卡那霉素50μg/ml），37℃培养至od600 0.5左右，加iptg至终浓度0.5mmol/l 30℃诱导表达5h，10000r/min 4℃离心10min，收集菌体，sds-page电泳鉴定。将400ml培养物的细菌沉淀悬于10ml的pbs。－20℃冷冻30min，37℃放置20min，反复冻融3次。加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上30min。按每克细菌加入20μl dnaseⅰ（1mg/ml），搅匀后室温放置至裂解液不再粘稠。将裂解液冰上超声破碎。10000r/min4℃离心10min，收集上清，采用ni柱纯化后，取10μl蛋白经sds-page电转移至pvdf膜，使用hrp标记的抗his标签鼠单克隆抗体（1∶1000）及dab显色试剂盒进行western-blot鉴定。结果如图1所示。
25.从图1的结果可以看出，泳道1为表达的目的蛋白western-blot鉴定结果，泳道2为空白质粒对照蛋白，泳道2没有目的条带，泳道1检测到相对分子质量约 30000 大小的目的蛋白，说明目的蛋白成功在pet-28a（＋）中融合表达。将纯化蛋白调整浓度为5mg/ml备用。
26.实施例2 金黄色葡萄球菌肠毒素a单克隆抗体的制备取纯化后的重组肠毒素a作为抗原免疫7周龄的雌性balb/c小鼠,首次免疫为取纯化的重组肠毒素a 100μg与等体积的弗式完全佐剂完全乳化后，每只balb/c小鼠腹腔注射200μl；二免于首免后两周进行，将纯化的肠毒素a 100μg与等体积的弗式不完全佐剂完全乳化后，每只balb/c小鼠腹腔注射200μl；此后每间隔2周免疫一次，免疫方法和免疫剂量与第二次免疫完全相同，三免后7d，对每只balb/c小鼠进行尾静脉采血，采用间接elisa方法测定血清抗体效价达到1:25600以上的balb/c小鼠，于三免后两周腹腔注射100μg不加佐剂纯化的重组肠毒素a进行加强免，于加强免疫三天后，挑选效价最高的3号小鼠进行细胞融合。
27.按照小鼠的sp2/0细胞和脾细胞的数量1:6的比例对这两种细胞进行稀释，稀释后将其于一个无菌的50ml离心管中进行充分混合，1000r/min离心10min。离心后弃去上清，在离心管底部预留少量液体，用手掌心摩擦离心管的底部，直至沉淀松散。预先将50%peg（w/v）3000融合剂置于37℃水浴锅中预热10min，把混合有两种细胞的离心管置于40℃水浴的小烧杯中，在60s内用1ml移液器向细胞悬液中缓慢加入0.8ml50%peg（w/v）3000到离心管中，边滴加边摇晃离心管，静止90s保证其充分融合。在2min内迅速完成先慢后快地将30ml 37℃预温的无血清dmem培养液加入到离心管中终止融合反应，然后将其1000r/min离心10min。离心后，弃掉上清，向离心管中加入7ml含20%fbs预热的hat培养基重悬细胞沉淀，补充hat培养液至50ml。待细胞混匀后，将细胞悬液加入到含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μl/孔。将其置于37℃，5% co2温箱中进行培养。细胞融合后第 4d，用新鲜的含有 20%fbs 的hat 培养基进行半量换液，待细胞融合 9d 后，再次用新鲜的 20%fbs 的 hat 培养基对细胞进行半量换液，细胞融合 12d 后，采用间接 elisa 方法筛选阳性杂交瘤细胞,选择 od450 值较高且细胞生长状态较好的阳性孔进行克隆,经过有限稀释法进行了两次亚克隆,得到了 2 株能够稳定分泌抗肠毒素a单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别将其命名为 3a6和4h5。将二株杂交瘤细胞株制备腹水并纯化，置于-80℃冰箱里保存备用。
28.实施例3 金黄色葡萄球菌肠毒素a单克隆抗体的效价及特异性鉴定用肠毒素a蛋白包被酶标板，采用间接 elisa 方法检测制备的两株单克隆抗体的
ciation):吸去pbs,加入45μl pbs和5μl单抗,待单抗结合至饱和时吸去单抗液。解离(dissociation):换50μlpbs,待单抗结合与解离达到平衡。再生(regeneration):换20mmol/lhcl 50μl作用2min以完全洗脱结合的单抗。回复基线:换pbs,再次回到基线,即可开始下1个循环。将每种单抗用pbs稀释为5个不同浓度,依次分别测定各浓度单抗与包被抗原结合、解离速率,并通过随机附送之专用软件fastfit计算各株单抗的亲和常数。结果如表3所示。
36.表3 抗体的亲和常数抗体名称亲和常数（nm）
ꢀꢀꢀꢀ
3a6单克隆抗体0.23
±
0.02从表2的结果可以看出，3a6单克隆抗体具有较好的亲和能力，结合能力较好。
37.采用试剂盒提取3a6杂交瘤细胞的总rna，逆转录合成cdna。设计引物，扩增重链和轻链，测序，测序结果用软件进行分析，经过序列鉴定，获得了单克隆的轻重链序列，其轻链可变区的氨基酸序列为：dlvmtqtapsvpvtpgesvsiscrstfnyysfepgdglywflqrpgqspqlliyymdnlasgvpdrfsgsgsgtaftlrisrveaedvgvyycestlaewpafgsgtkleik重链可变区的氨基酸序列为：vkpggslklscaasdykgrdwlmswvrqtpdkrlewvaiaihksevlyypdsvkgrftisrdqdkqtlylqmsslksedtamyycgnhhswaianewgqgttvtvs。
38.实施例6 3a6单克隆抗体制备检测试剂盒碱性磷酸酶标记抗体，具体流程如下：取1mg碱性磷酸酶ap溶于200μl 0.3mol/l ph8．0的nahco3缓冲液中；加1ml 0.06mol/l的过碘酸钠，室温下避光轻搅0.5h；加1ml 0.16mol/l的乙二醇，室温下轻搅lh，终止氧化；在0.01mol/l ph9.5的cb缓冲液中4℃透析过夜；于1mg醛化ap中加含0.5mg抗体的cb缓冲液1ml，室温避光轻搅3h；加入5mgnahb4，放4℃过夜；在0.01mol/l，ph7.2 pbs中4℃透析24h；4℃，4000rpm离心30min，除去沉淀即得到标记的3a6单抗。
39.elisa板的包被和封闭：用0.05m ph9.6cb包被液分别稀释sea多克隆抗体（abnova，货号：pab13828），每孔加入50μl浓度为1μg/ml的sea多克隆抗体，4℃静置过夜，弃去包被液，用洗板液含0.05% tween-20的0.01m ph7.4pbs洗涤3次，排干后加入封闭液5%bsa的0.05m ph9.6cb，37℃静置2h，弃去封闭液，晾干代用。
40.elisa检测：每个孔分别加入sea标准品不同的梯度浓度，室温静置1h，用洗板液洗涤4次。再加入优化后的最优浓度的100μl的酶标3a6单克隆抗体（od405为0.83），室温静置1h，用洗板液洗涤4次。每孔加入反应底物对硝基苯磷酸盐pnpp 150μl（将pnpp以10 mmol/l的浓度溶于含1 mmol/lmgcl2的0.1 mol/l二乙醇胺缓冲液（ph 9.8）），室温避光反应15min，每孔加入50μl终止液（0.5 mol/l碳酸钠）终止反应，在5min内用酶标仪测定405nm的吸光值。以 p/n≥2.1 判定为阳性, 确定可检测的最低抗原浓度。
41.表 4 3a6单克隆抗体单克隆抗体的敏感性sea浓度（μg/l）p/n结果100058.7+10040.3+
1029.4+111.2+0.12.54+0.010.95-空白对照od405为0.055-从表3的结果可以看出，本发明的间接elisa方法检测sea的最低浓度为0.1 μg/l，具有较好的检测效果。
42.应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
技术特征：1.一种特异性针对金黄色葡萄球菌肠毒素a的单克隆抗体3a6，其轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。2.一种特异性检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的试剂盒，其特征在于含有碱性磷酸酶标记的金黄色葡萄球菌肠毒素a的单克隆抗体3a6，其中，该抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。3.金黄色葡萄球菌的肠毒素a的单克隆抗体在制备检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的elisa检测试剂盒中的用途；其中，该试剂盒含有碱性磷酸酶标记的金黄色葡萄球菌肠毒素a的单克隆抗体3a6，其中，该抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。4.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于非疾病诊断目的的金黄色葡萄球菌的肠毒素a的检测中的用途。
技术总结本发明涉及一种碱性磷酸酶标记抗体及其制备方法。本发明提供金黄色葡萄球菌的肠毒素A的单克隆抗体与现有技术的单克隆抗体相比，具有更高的灵敏度和特异性。将所述单克隆抗体制备成为ELISA检测试剂盒可以具有最低检测下限可以达到0.1ug/L的灵敏度，并由此开发了快速简易的免疫检测产品，应用价值广泛。应用价值广泛。
技术研发人员：詹先发 柳静
受保护的技术使用者：北京科跃中楷生物技术有限公司
技术研发日：2022.05.24
技术公布日：2022/7/5
