1.本技术涉及医药领域，尤其涉及一种肿瘤原位瘤动物模型的造模方法及肿瘤原位瘤动物模型。
背景技术：2.肿瘤的有效治疗是重大医学难题。根据世界卫生组织最新发布的《世界癌症报告》显示，全球癌症负担不断增加。肿瘤的治疗因而成为医学领域探索和研究的重点。
3.肿瘤研究领域中公认的重要一环是能够提供研究癌变和治疗治疗的模型系统。为了评估在临床前和临床研究中癌症治疗的效果，通常使用人类肿瘤细胞系或患者源性肿瘤移植到免疫缺陷小鼠体内的肿瘤动物模型。肿瘤动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，是新药品、新装备、新材料与新技术等进行临床试验前的至关重要的一步。
4.建立肿瘤动物模型是研究肿瘤发病机制及开展肿瘤治疗相关研究的重要手段。动物模型应该尽可能的接近人类肿瘤的自然生物学过程，观察其原位成瘤的过程及状态，为进一步研究肿瘤发生发展机制、肿瘤耐药、肿瘤侵袭转移、肿瘤微环境、抗肿瘤免疫研究等提供实验动物模型。建立良好的动物模型对于模拟人体肿瘤具有很好的替代作用，有助于开展基础研究，最关键的是，基于基础科研研究来回答一系列临床问题。
5.目前实验室中常用的肿瘤造模方法有自发型肿瘤动物模型、诱发型肿瘤动物模型、移植型肿瘤动物模型和转基因(基因修饰)肿瘤动物模型。其中，移植型肿瘤动物模型是目前基础研究中应用最广泛的造模方法。移植型肿瘤动物模型是指把肿瘤组织、细胞株移植到实验动物体内的荷瘤动物模型。这种模型造模成功率高，常在裸鼠、小鼠、大鼠与兔子等动物中进行应用。移植型模型根据移植瘤所在部位可分为原位移植瘤和异位移植瘤。
6.通过向实验动物目标脏器注射肿瘤细胞建立原位移植瘤模型，由于原位移植瘤能较好的模拟人体肿瘤生长过程，可进行肿瘤原位和转移观察，可进行基因敲除/过表达后的成瘤研究，因此在基础研究中应用非常广泛。异位移植瘤多见于在实验动物背部皮下注射一定量的肿瘤细胞形成肿瘤，皮下移植瘤操作简单容易掌握，且肿瘤体积变化易于测量，容易给予局部干预。然而异位移植瘤难以展现肿瘤原位和转移情况，缺乏肿瘤异质性。
7.传统的原位移植瘤造模通常采用解剖方法，如肝癌、胰腺癌、肾癌模型进行剖腹，直肠癌和结肠癌进行剖盆，甲状腺癌进行剖颈，肺癌模型进行剖胸等。然而，通过解剖动物进行原位移植瘤建立肿瘤模型的方法存在并发症较多 (如出血和感染等)、手术创伤大、术后恢复慢、手术时间长、操作复杂等多种缺陷。
技术实现要素：8.为克服上述传统的原位移植瘤造模方法的不足，本发明提供了一种肿瘤原位瘤动物模型的造模方法及肿瘤原位瘤动物模型。本发明提供了一种创伤小、可重复、操作简单、并发症较少和稳定性高的新方法。一方面，本发明可以改善传统手术造模方法的不足，另一方面，本发明为临床前动物实验研究提供了一种稳定可重复、成瘤效率高的原位移植瘤造
模方法，促进肿瘤研究模式动物的发展。
9.根据本技术实施例的第一方面，提供一种肿瘤原位瘤动物模型的造模方法，包括以下步骤：
10.(1)将动物全身麻醉，使用动物固定器将所述动物固定；
11.(2)对所述动物上靶脏器区域进行剃毛和消毒，铺洞巾，充分暴露操作区域；
12.(3)将超声探头置于所述靶脏器区域，在超声实时引导下获取靶脏器和周边组织参数；
13.(4)基于所述参数，标记感兴趣的体表穿刺进针点和靶脏器穿刺点；
14.(5)连接所述体表穿刺进针点和所述靶脏器穿刺点，生成穿刺路径，所述穿刺路径与大血管不相交，安全路径与骨骼不相交；
15.(7)使用微量注射针按照所述穿刺路径进行穿刺，到达靶脏器位置；
16.(8)将注射器内的肿瘤细胞通过微量注射针注射入所述靶脏器位置；
17.(9)通过超声实时观察肿瘤细胞注射过程，全部肿瘤细胞注射完成后旋转出针，得到肿瘤原位瘤动物模型。
18.进一步地，所述全身麻醉采用1-1.5％戊巴比妥进行腹腔麻醉，优选剂量为 40-45g/kg。
19.进一步地，所述参数主要包括肿瘤的参数、血管的参数、骨骼的参数以及体表的参数。
20.进一步地，所述肿瘤细胞的细胞量为1*10
4-1*106。
21.进一步地，所述超声包含二维超声和彩色多普勒超声。
22.进一步地，所述肿瘤细胞选自脑部肿瘤、颈部肿瘤、胸部肿瘤、腹部肿瘤、盆部肿瘤、皮肤肿瘤、四肢和骨关节肿瘤。
23.进一步地，所述肿瘤细胞的制备，包括如下步骤：
24.1)在37℃培养箱中培养肿瘤细胞；
25.2)然后使用胰酶对所述肿瘤细胞进行消化，加入带血清的培养基停止消化；
26.3)使用移液枪吹打所述肿瘤细胞，将消化好的肿瘤细胞收集入离心管；
27.4)将所述离心管内的肿瘤细胞放入离心机进行离心；
28.5)离心结束后取出所述离心管，弃上清液，加入无血清培养基进行重悬；
29.6)将所述离心管置于冰上，向所述离心管内加入matrige胶，再次重悬混匀，获得最终的肿瘤细胞。
30.进一步地，连接所述体表穿刺进针点和所述靶脏器穿刺点，生成穿刺路径，包括：
31.连接体表穿刺进针点和靶脏器穿刺点，生成多条基准路径；
32.然后由至少一个基准路径平移出满足给定条件的n个安全路径，并删掉放弃路径，其中骨骼相交或与血管相交的安全路径为放弃路径；
33.将n个安全路径输出为m个穿刺路径，其中，n≥m。
34.进一步地，所述动物选自啮齿类动物、兔、犬、猫、非人灵长类动物、鸡、猪和鱼类中的一种。
35.根据本技术实施例的第二方面，提供上述的造模方法制备的肿瘤原位瘤动物模型。
36.本发明所述超声引导下原位移植瘤肿瘤造模方法具有创伤小，造模方法稳定，操作简单，可重复等的巨大优势，适合原位移植瘤模型的大范围推广应用。
37.本发明还提供所述造模方法对应的动物模型。优选的，其可以为啮齿类(包括小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠)、兔、犬、猫、非人灵长类(绒猴、松鼠猴、食蟹猴和狒狒)、鸡、小型猪以及鱼类等实验动物。
38.目前用于构建原位移植瘤模型的动物以鼠、兔和猴为主。实验动物要考虑的因素大概有：容易饲养，繁殖率高，价格低廉，易于获得，便于操作，遗传上有较高的纯和度，代谢类型、生理病理尽量与人类接近等。其中，小白鼠在这些方面的优势无一例外都很明显，是最常用于制作肿瘤造模的实验动物。本发明所述方法制备的动物原位移植瘤造模方法能更好的模拟人体肿瘤的状态，为服务临床打好基础，实现了微创、操作简单、模型稳定的优势。
39.本发明还提供所述造模方法对应的靶脏器优选为皮肤、口腔、甲状腺、乳腺、睾丸、浅表淋巴结、鼻、咽、肺、食道、胃肠、肾、膀胱、子宫、卵巢、骨、脑、肝、胰、脾和前列腺等。
40.本技术的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
41.由上述实施例可知，本技术通过超声引导的方法，可实时观察到靶脏器及周围组织的具体参数，从而提高原位移植瘤造模的稳定性。通过这种办法构建的原位移植瘤动物模型，不受动物种类的限制，可以在多种类型动物如小鼠、大鼠、兔、猴等实现原位移植瘤造模，同时不受脏器位置的影响，在超声可视化范围内，可以在多种类型脏器及多类型实验动物实现原位造模。更好的模拟原位肿瘤生长的状态，为研究原位肿瘤模型提供新思路。
42.本发明所述原位移植瘤模型造模方法可在超声引导的基础上，减少传统解剖手术造模方法带来的并发症，对动物没有大创伤的操作，且成瘤成功率高。该模型可用于观察肿瘤原位成瘤的过程及状态，可进一步对肿瘤发生发展机制、肿瘤耐药、肿瘤侵袭转移、肿瘤微环境、抗肿瘤免疫研究等方面进行研究，具有良好的应用前景。
43.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本技术。
附图说明
44.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本技术的实施例，并与说明书一起用于解释本技术的原理。
45.图1是根据一示例性实施例示出的一种肿瘤原位瘤动物模型的造模方法的流程图。
46.图2是根据一示例性实施例示出的肿瘤细胞的制备的流程示意图。
47.图3是根据一示例性实施例示出的安全路径的选择的示意图。
48.图4是根据一示例性实施例示出的超声引导下小鼠肝癌原位瘤建模图。
49.图5是根据一示例性实施例示出的建模鉴定图。
具体实施方式
50.这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本技术相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附
权利要求书中所详述的、本技术的一些方面相一致的装置和方法的例子。
51.在本技术使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
52.本发明公开了一种超声引导下原位移植瘤造模方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
53.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
54.实施例1造模步骤(图1)：
55.一种肿瘤原位瘤动物模型的造模方法，包括以下步骤，如图1所示：
56.1.采用1-1.5％戊巴比妥对c57小鼠进行腹腔麻醉(45g/kg)，使用小鼠固定板将动物固定；
57.2.对腹部区域进行剃毛和消毒，铺洞巾，充分暴露操作区域；其中，所述腹部区域是指上至小鼠剑突，下至髂前上棘连线处，左至左腋中线，右至右腋中线；
58.3.将超声探头置于肝脏区域，在超声实时引导下获取肝脏组织和周边组织参数，所述参数包括血管的参数、骨骼的参数以及体表的参数。这里的超声包含二维超声和彩色多普勒超声。
59.4.基于所述参数，标记体表穿刺进针点和肝脏穿刺点；
60.5.连接体表穿刺进针点和肝脏穿刺点生成穿刺路径。这里的穿刺路径与大血管不相交，与骨骼不相交。
61.6.使用体积为1-2ml的注射器吸取事先准备好的肿瘤细胞；所述肿瘤细胞的细胞量优选为1.0*10
4-1.0*106，体积为5.0-20.0μl。
62.7.经安全穿刺路径进行穿刺，到达肝脏目标位置；这里肝脏目标位置为肝包膜下2.0mm-6.0mm处。
63.8.将注射器内的肿瘤细胞注射入肝脏目标位置；
64.9.超声实时观察细胞注射过程，全部细胞注射完成后旋转出针，完成肿瘤原位瘤动物模型的构造。
65.10.每隔3天使用超声观察目标肿瘤的生长并记录。
66.实施例2肿瘤细胞的制备(图2)：
67.肿瘤细胞的制备是超声引导下原位移植瘤进行造模的关键一步，具体步骤如下：
68.1.在37℃培养箱中培养肿瘤细胞，观察细胞生长速度和细胞密度；这里的肿瘤细胞包括脑部肿瘤、颈部肿瘤、胸部肿瘤、腹部肿瘤、盆部肿瘤、皮肤肿瘤、四肢和骨关节肿瘤等。
69.2.然后使用胰酶对肿瘤细胞进行消化，加入带血清的培养基停止消化；胰酶的量根据细胞培养皿的大小来定，如10.0cm直径的细胞培养皿需要加入 3.0-4.0ml胰酶进行消化。肿瘤细胞停止消化条件为加入2倍于胰酶体积带血清的细胞培养液。
70.3.使用移液枪吹打细胞，将消化好的肿瘤细胞收集入离心管；肿瘤细胞消化条件为2-4min消化时间。
71.4.将离心管内的细胞放入离心机进行离心；肿瘤细胞离心转速为1000-2000r，离心时间为4-6min。
72.5.离心结束后取出离心管，弃上清液，加入无血清培养基进行重悬；这里加入无血清培养基中的体积根据细胞的数量来定，如1.0*10
4-1.0*106数量的肿瘤细胞，可以加入50-250μl。
73.6.将离心管置于冰上，向离心管内加入matrige胶，再次重悬混匀；加入 matrige胶的量与无血清培养基的体积相等。
74.实施例3安全路径的选择(图3)：
75.(1)在超声引导下获取目标脏器周边参数。所述目标脏器周边参数包括血管的参数、骨骼的参数以及体表的参数。
76.(2)基于所述参数，标记感兴趣的体表穿刺进针点和靶脏器穿刺点。
77.(3)连接体表穿刺进针点和靶脏器穿刺点，生成多条基准路径。所述基准路径与大血管不相交，基准路径与骨骼不相交。
78.(4)然后由至少一个基准路径平移出满足给定条件的n个安全路径，并删掉放弃路径。与大血管不相交，同时与骨骼不相交的穿刺路径输出为安全路径。与骨骼相交或与血管相交的穿刺路径输出为放弃路径。所述给定条件包括穿刺范围在感兴趣穿刺区域及安全路径区域范围内。
79.(5)将n个安全路径输出为m个穿刺路径。所述n个安全路径输出为m个穿刺路径，其中，n≥m。
80.实施例4超声引导下小鼠肝癌原位瘤建模(图4)
81.1.将c57小鼠进行全身麻醉，使用小动物固定器将c57小鼠固定；全麻为采用1-1.5％戊巴比妥进行腹腔麻醉，优选剂量为40-45g/kg。
82.2.对腹部区域进行剃毛和消毒，铺洞巾，充分暴露操作区域；所述腹部区域上至剑突，下至髂棘连线，左至左侧腋中线，右至右侧腋中线。
83.3.将超声探头置于肝脏区域，在超声实时引导下获取参数；
84.4.基于超声引导下获取的参数，标记感兴趣的体表皮肤穿刺进针点和肝脏穿刺点；所述获取的参数主要包括血管的参数、胆管的参数、骨骼的参数以及体表的参数。
85.5.连接体表皮肤穿刺进针点和肝脏穿刺点，生成安全穿刺路径；所述安全路径与肝内大血管不相交，与胆管不相交，与胆囊不相交，与骨骼不相交。
86.6.使用注射器吸取准备好的hepa1-6肝癌细胞；所述hepa1-6肝癌细胞的准备包括肝癌细胞的培养、消化、离心、重悬和与matrige胶混匀步骤。
87.7.经安全穿刺路径进行穿刺，输出为实际穿刺路径，到达肝脏靶向注射位置；
88.8.将注射器内的肝癌细胞注射入；所述每只小鼠注射肝癌细胞的细胞量为 5*10
4-10*104。
89.9.超声实时观察细胞注射过程，全部细胞注射完成后旋转出针；所述旋转出针是180
°‑
360
°
的旋转。
90.实施例5建模鉴定(图5)
91.小鼠肝癌模型成功标志：
92.1、肉眼观鉴定：小鼠体表可以摸到肿瘤组织，解剖后可在肝脏组织内找到肝癌结节。
93.2、超声鉴定：
94.(1)二维超声：声像图特点：a膨胀性生长，产生声晕；b多形性：各种不同强度、不同形态共存；c多变性：形态、内部回声不断改变；d迅速生长； e晚期门静脉或肝静脉内出现癌组织浸润、癌栓。
95.(2)彩色多普勒：肝癌结节及其周围因血供丰富，而可获得各种有关的血流信息。彩色多普勒超声检测组织血流的敏感性高，能准确反映肝癌的血供情况。癌结节周围的血流可表现为整圈状或弧形围绕，可用频谱多普勒测出是连续性门脉血流或搏动性动脉血流。
96.(3)超声造影：a典型肝细胞肝癌的超声造影表现：动脉期高增强(小于3cm 的小结节通常均匀增强，大的结节因液化坏死可呈不均匀增强)，在门脉晚期或延迟期廓清，呈轻度低增强。不典型的高分化肝细胞肝癌超声造影表现：动脉期高增强，门脉期和延迟期呈等增强或稍高增强，如本例病例。
97.3、病理鉴定：肝癌组织进行he染色，找到肝癌组织与正常肝脏组织的分界。
98.本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后，将容易想到本技术的其它实施方案。本技术旨在涵盖本技术的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本技术的一般性原理并包括本技术未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本技术的真正范围和精神由权利要求指出。
99.应当理解的是，本技术并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本技术的范围仅由所附的权利要求来限制。
技术特征：1.一种肿瘤原位瘤动物模型的造模方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将动物全身麻醉，使用动物固定器将所述动物固定；(2)对所述动物上靶脏器区域进行剃毛和消毒，铺洞巾，充分暴露操作区域；(3)将超声探头置于所述靶脏器区域，在超声实时引导下获取靶脏器和周边组织参数；(4)基于所述参数，标记感兴趣的体表穿刺进针点和靶脏器穿刺点；(5)连接所述体表穿刺进针点和所述靶脏器穿刺点，生成穿刺路径，所述穿刺路径与大血管不相交，安全路径与骨骼不相交；(7)使用微量注射针按照所述穿刺路径进行穿刺，到达靶脏器位置；(8)将注射器内的肿瘤细胞通过微量注射针注射入所述靶脏器位置；(9)通过超声实时观察肿瘤细胞注射过程，全部肿瘤细胞注射完成后旋转出针，得到肿瘤原位瘤动物模型。2.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述全身麻醉采用1-1.5％戊巴比妥进行腹腔麻醉，优选剂量为40-45g/kg。3.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述参数主要包括肿瘤的参数、血管的参数、骨骼的参数以及体表的参数。4.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述肿瘤细胞的细胞量为1*10
4-1*106。5.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述超声包含二维超声和彩色多普勒超声。6.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自脑部肿瘤、颈部肿瘤、胸部肿瘤、腹部肿瘤、盆部肿瘤、皮肤肿瘤、四肢和骨关节肿瘤。7.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述肿瘤细胞的制备，包括如下步骤：1)在37℃培养箱中培养肿瘤细胞；2)然后使用胰酶对所述肿瘤细胞进行消化，加入带血清的培养基停止消化；3)使用移液枪吹打所述肿瘤细胞，将消化好的肿瘤细胞收集入离心管；4)将所述离心管内的肿瘤细胞放入离心机进行离心；5)离心结束后取出所述离心管，弃上清液，加入无血清培养基进行重悬；6)将所述离心管置于冰上，向所述离心管内加入matrige胶，再次重悬混匀，获得最终的肿瘤细胞。8.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，连接所述体表穿刺进针点和所述靶脏器穿刺点，生成穿刺路径，包括：连接体表穿刺进针点和靶脏器穿刺点，生成多条基准路径；然后由至少一个基准路径平移出满足给定条件的n个安全路径，并删掉放弃路径，其中骨骼相交或与血管相交的安全路径为放弃路径；将n个安全路径输出为m个穿刺路径，其中，n≥m。9.根据权利要求1所述的造模方法，其特征在于，所述动物选自啮齿类动物、兔、犬、猫、非人灵长类动物、鸡、猪和鱼类中的一种。10.根据权利要求1-9任一项所述的造模方法制备的肿瘤原位瘤动物模型。
技术总结本发明公开了一种肿瘤原位瘤动物模型的造模方法及肿瘤原位瘤动物模型，包括：将动物全身麻醉；对动物上靶脏器区域进行剃毛和消毒；将超声探头置于靶脏器区域，获取靶脏器和周边组织参数；基于参数，标记感兴趣的体表穿刺进针点和靶脏器穿刺点；连接体表穿刺进针点和所述靶脏器穿刺点，生成穿刺路径；使用微量注射针按照穿刺路径进行穿刺，到达靶脏器位置；将注射器内的肿瘤细胞通过微量注射针注射入靶脏器位置；通过超声实时观察肿瘤细胞注射过程，全部肿瘤细胞注射完成后旋转出针，得到肿瘤原位瘤动物模型。本发明具有创伤小、成瘤率高、恢复快、操作稳定的优势，避免了开腹、开盆、开胸等大创伤，且对周围脏器无影响，具有非常大的应用潜力。常大的应用潜力。
技术研发人员：谢丽婷 蒋天安 赵齐羽 许敏
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.02.15
技术公布日：2022/7/5
