1.本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种植物油中氯酞酸的检测方法。
背景技术：2.除草剂是农业生产中的重要物质，对于杀灭有害杂草以提高农产品产量具有重大意义，其中氯酞酸，化学名四氯对苯二甲酸，是氯代酸性除草剂中的重要一种。虽然氯酞酸具有良好的除草效果，但是由于其水溶性较强，且具有漂移性，容易在水质、环境、土壤、作物以及果实中造成残留污染。此外，研究表明，氯代酸性除草剂具有生殖毒性和引起人类软组织恶性肿瘤等风险。因此，其早在多年前就已经被我国在内的许多国家列入了环境优先监测的污染物黑名单。
3.2021年9月3日起正式实施的《食品安全国家标准食品中农药最大残留量》(gb 2763-2021)标准中新增了氯酞酸在植物油中的临时最大残留限量值为0.01mg/kg。但是截至目前，国内仍尚未有植物油中氯酞酸检测方法的相关标准或者文献报道。当前，针对氯酞酸检测方法的研究较少，仅有的标准和文献报道主要是针对水质中氯酞酸的测定。水质中氯酞酸的测定方法为采用二氯甲烷或固相萃取小柱萃取水质样品中的氯酞酸，经浓缩丙酮复溶后，再采用五氟苄基溴进行衍生化，之后再对衍生物进行过柱净化，再复溶样品，最后采用气相色谱法进行测定。由于氯酞酸具有较强的极性、沸点高且不易挥发，如果采用气相色谱气进行分析，就必须先进行衍生化，衍生化后再进行过柱净化，此处理方法使用了大量的有机溶剂，并且前处理过程复杂、耗时长、成本高，不符合当前倡导的绿色、低碳、环保的主流要求。
4.因此，亟需建立一种灵敏、准确、便捷的植物油中氯酞酸残留检测方法，填补植物油中氯酞酸残留检测的技术空白点，为我国植物油中氯酞酸残留检测提供有力的技术支撑手段。
技术实现要素：5.本发明的目的是为了填补目前植物油中氯酞酸残留检测的技术空白点，而提供了一种新的植物油中氯酞酸的检测方法，该方法步骤简单、有机物用量少、对环境友好且回收率、重复性、灵敏度和检测限均满足当前国家标准(gb2763-2021)规定的氯酞酸临时最大残留限量值的要求。
6.具体地，本发明提供了一种植物油中氯酞酸的检测方法，其中，该方法包括如下步骤：
7.s1：样品前处理
8.取适量植物油样品于离心管中，采用水、乙酸和乙腈的混合溶液进行涡旋混合提取，接着加入氯化钠进行涡旋混匀后再进行离心；取上层清液加入乙腈饱和的正己烷溶液进行涡旋混合净化，静置分层；收集下层清液并于35～45℃下氮吹至干，加入乙腈复溶，最后经0.1～0.3μm滤膜过滤得到待测样品溶液，留待lc-ms/ms检测；其中，所述植物油样品与
水、乙酸、乙腈以及氯化钠的比例为1g:(1～1.5)ml:(0.04～0.06)ml:(4～6)ml:(0.4～0.6)g；
9.s2：配制标准溶液
10.将氯酞酸标准品用溶剂溶解并配制成具有2～100ng/ml浓度梯度的氯酞酸系列标准溶液；
11.s3：样品检测
12.将步骤s2中的氯酞酸系列标准溶液进行lc-ms/ms测定，得到标准工作曲线；将步骤s1中的待测样品溶液进行lc-ms/ms测定，采用外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测植物油中氯酞酸的含量。
13.在一种优选的实施方式中，步骤s1中，所述涡旋混合提取的条件为涡旋10～15min；所述涡旋混匀的条件为涡旋30～60s；所述涡旋混合净化的条件为涡旋60～90s。
14.在一种优选的实施方式中，步骤s1中，所述离心的条件包括离心转速为10000～20000rpm，离心时间为5～10min。
15.在一种优选的实施方式中，步骤s1中，所述滤膜为有机滤膜，所述滤膜的孔径为0.22μm。
16.在一种优选的实施方式中，步骤s3中，所述lc-ms/ms测定过程中液相色谱条件包括：色谱柱为waters beh hilic；柱温为35℃；流速为0.30ml/min；进样量为2μl；流动相以含0.02％v/v甲酸的10mmol/l乙酸铵水溶液作为a相且以含乙腈作为b相，采用梯度洗脱且梯度洗脱程序如下：0～0.3min的流动相为3％a相和97％b相的混合溶液，0.3～3.5min的流动相为3％～40％a相和97～60％b相的混合溶液，3.5～4min的流动相为40％～3％a相和60％～97％b相的混合溶液，4～6.5min的流动相为3％a相和97％b相的混合溶液。
17.在一种优选的实施方式中，步骤s3中，所述lc-ms/ms测定过程中质谱条件包括：采用dionex ultimate 3000/tsq quantiva超高效液相色谱质谱联用仪；离子源为esi-；离子源电压为2800v；离子传输管温度为350℃；喷针温度为300℃；质谱扫描信息为：定量离子对为258.8/178.8，碰撞能为15v；定性离子对为258.8/176.8，碰撞能为15v。
18.在一种优选的实施方式中，所述植物油为花生油、红花籽油、芥菜籽油、玉米油、亚麻籽油、麻油、坚果油、棉籽油、大豆油和葵花子油中的至少一种。
19.本发明的有益效果是：
20.(1)本发明提供了一种植物油中氯酞酸的检测方法，先采用水、乙酸和乙腈的混合溶液对植物油样品进行涡旋混合提取，再加入氯化钠进行涡旋混匀后进行高速离心，最后在所得上层清液中加入乙腈饱和的正己烷溶液进行涡旋混合净化，并且在样品前处理过程中将植物油样品与水、乙酸、乙腈以及氯化钠的比例控制在1g:(1～1.5)ml:(0.04～0.06)ml:(4～6)ml:(0.4～0.6)g；通过上述特定的样品前处理方式，能够将样品中影响测试结果的杂质有效去除，同时仅保留目标产物。通过本发明所提供的检测方法，测得氯酞酸的仪器检测限为0.3ng/ml，氯酞酸的方法检测限为0.15μg/kg；并且氯酞酸标准品在2～100ng/ml工作曲线范围内的相关系数r2＞0.99，具有良好的线性关系，有利于定性定量测定，易于推广使用。
21.(2)氯酞酸为二羧酸化合物，其在esi负模式下产生质荷比为302.8的分子离子峰信号很弱，由于氯酞酸还会形成失去羧酸根的258.8的准分子离子，其分子离子峰信号比
302.8的分子离子峰要强。因此，本发明优选采用258.8作为氯酞酸的母离子，能够显著提高氯酞酸的灵敏度。
22.(3)本发明采用液相色谱串联质谱法对氯酞酸进行测定，植物油样品则无需进行衍生化处理，简化了样品前处理实验步骤，同时在样品前处理过程中避免使用二氯甲烷等大量有机溶剂，提高了实验人员的人身安全性和实现了环境保护。
23.(4)本发明优选采用hilic亲水色谱柱对氯酞酸进行分析，能够大大提高其保留时间，克服了常规c
18
色谱柱对氯酞酸不保留、与基质共流出以及干扰氯酞酸测定的缺点。
24.(5)本发明在进行液相色谱分离过程中，在10mmol/l乙酸铵水溶液中添加了体积比0.02％v/v的甲酸作为a相，测试所得的峰形对称且峰窄，不仅能够改善目标物的峰形，同时还能提高目标物在色谱柱中的保留，能够更好的与其他杂质峰进行区分开，提高了定量和定性的准确性和灵敏性。
25.(6)由于氯酞酸的极性较强，几乎不溶于正己烷，因此在样品前处理的净化过程中，采用乙腈饱和的正己烷对样液进行有效的除脂除杂净化，同时不会造成目标物的损失，提高了实验过程的回收率。
附图说明
26.图1为氯酞酸标准样品的标准曲线图；
27.图2(a)为2ng/ml氯酞酸的提取离子流图；(b)为2ng/ml氯酞酸的质谱图；
28.图3(a)为色谱柱为c
18
色谱柱的氯酞酸保留效果图；(b)为色谱柱为hilic色谱柱的氯酞酸保留效果图；
29.图4(a)为流动相a相为10mmol/l乙酸铵水溶液的总离子流图(tic)；(b)为在流动相a相为10mmol/l乙酸铵水溶液中添加0.02％甲酸的总离子流图(tic)。
具体实施方式
30.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
31.(1)本发明实施例和对比例中所涉及到的试剂药品如下：
32.氯酞酸标准品(纯度99.5％，bepure)；乙腈、正己烷(色谱纯，瑞典欧普森)；甲酸(质谱级，美国acs化学试剂)；乙酸铵(色谱纯，德国sigma公司)；乙酸(≥99.8％，国药集团化学试剂有限公司)；氯化钠(优级纯，西陇科学)；水(符合gb/t6682-2008规定的一级水)。
33.(2)本发明实施例和对比例中所涉及到的实验仪器如下：
34.dionex ultimate 3000/tsq quantiva超高效液相色谱质谱联用仪(美国thermo公司)；mtv-100多管旋涡混匀仪(北京金洋万达科技有限公司)；ika ms3 digital数显型旋涡混匀器(厦门锐思捷科学仪器有限公司)；柯瑞峰超纯水系统(四川德立世科技有限公司)；gl-20c-ii高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；kq-600de型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；0.22μm聚四氟乙烯针头式过滤器(天津津腾)。
35.实施例1
36.s1：样品前处理
37.称取5g植物油样品(精确至0.01g)于50ml离心管中，分别加入5ml水、0.2ml乙酸和20ml乙腈溶液后进行涡旋混合提取10min，接着加入2g氯化钠进行涡旋混匀30s后，在转速
为10000rpm下离心5min，静置分层；取上清液8ml，加入5ml乙腈饱和的正己烷涡旋混合净化1min，静置分层后，弃去上层正己烷层，并收集下层清液并于45℃下进行水浴氮吹至干，加入1ml乙腈进行复溶混匀，最后经0.22μm有机微孔滤膜过滤获得待测样品溶液。
38.s2：配制标准溶液
39.(1)配制标准品：将氯酞酸标准品用甲醇溶解配制成1.0mg/ml的标准储备溶液，将所得标准储备溶液用乙腈稀释成浓度为1.0μg/ml标准工作溶液；
40.(2)配制标准溶液：分别取步骤(1)中的标准工作溶液20、50、100、200、500和1000μl于10ml容量瓶中，采用乙腈进行定容，得到浓度梯度为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、和100ng/ml的氯酞酸系列标准溶液。
41.s3：样品检测
42.将步骤s2中的氯酞酸系列标准溶液进行lc-ms/ms测定，得到标准工作曲线；将步骤s1中的待测样品溶液进行lc-ms/ms测定，采用外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测植物油中氯酞酸的含量。
43.lc-ms/ms检测过程中，液相色谱条件包括：色谱柱为waters beh hilic；柱温为35℃；流速为0.30ml/min；进样量为2μl；流动相以含0.02％v/v甲酸的10mmol/l乙酸铵水溶液作为a相且以含乙腈作为b相，采用梯度洗脱且梯度洗脱程序如下：0～0.3min的流动相为3％a相和97％b相的混合溶液，0.3～3.5min的流动相为3％～40％a相和97～60％b相的混合溶液，3.5～4min的流动相为40％～3％a相和60％～97％b相的混合溶液，4～6.5min的流动相为3％a相和97％b相的混合溶液。
44.lc-ms/ms检测过程中，质谱条件包括：采用dionex ultimate 3000/tsq quantiva超高效液相色谱质谱联用仪；离子源为esi-；离子源电压为2800v；离子传输管温度为350℃；喷针温度为300℃；质谱扫描信息为：定量离子对为258.8/178.8，碰撞能为15v；定性离子对为258.8/176.8，碰撞能为15v。
45.选择10倍信噪比时对应的浓度作为该目标物的检测限，氯酞酸标准曲线相关系数所得结果见表1和图1，以及2ng/ml氯酞酸在上述检测条件下的提取离子流图和质谱图的测试结果见图2。本发明所提供的检测方法对氯酞酸的仪器检测限为0.3ng/ml，对氯酞酸的方法检测限为0.15μg/kg，由此可以说明本检测方法灵敏度高，检测限均满足当前国家标准(gb 2763-2021)规定的氯酞酸临时最大残留限量值的要求(0.01mg/kg)，能够满足植物油中氯酞酸残留的检测需求。
46.表1
[0047][0048]
对比例1～2
[0049]
对比例1：与实施例1不同的是，在样品检测时，液相色谱柱选择c
18
色谱柱，其余条件均与实施例1相同，所得测试结果对比图如图3所示。从图3对比图可知，本发明采用hilic亲水色谱柱对氯酞酸进行分析，能够大大提高其的保留时间(保留时间为3.90min)，克服了常规c
18
色谱柱对氯酞酸不保留(保留时间仅为0.89min)、与基质共流出以及干扰氯酞酸测
定的缺点。
[0050]
对比例2：与实施例1不同的是，在样品检测时，选择不添加0.02％v/v的甲酸的10mmol/l乙酸铵水溶液作为a相(也即直接以10mmol/l乙酸铵水溶液作为a相)，其余条件均与实施例1相同，所得测试结果对比图如图4所示。从图4对比图可知，本发明在进行样品检测时，在10mmol/l乙酸铵水溶液中添加了体积比0.02％v/v的甲酸，测试所得的峰形对称且峰窄，不仅能够改善目标物的峰形，同时还能提高目标物在色谱柱中的保留，能够更好的与其他杂质峰进行区分开，提高了定量和定性的准确性和灵敏性。
[0051]
测试例
[0052]
以市售的花生油和大豆油作为测试对象，采用阴性样品分别加标2.5μg/kg、5μg/kg和10μg/kg的氯酞酸标准溶液，同时做平行试验(n＝6)，测定回收率及rsd见表2。从表2实验数据结果显示，在三个加标浓度条件下氯酞酸的回收率在74.0％～91.7％，相对标准偏差rsd(n＝6)在3.8％～6.7％。上述测定结果符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求。
[0053]
表2
[0054][0055]
应用本发明所提供的植物油中氯酞酸的检测方法，对50个批次的市售植物油进行检测，结果显示有1个批次的花生油样品中检出氯酞酸，含量为0.4μg/kg，远低于gb 2763-2021中规定的临时最大残留限量值0.01mg/kg。
[0056]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
技术特征：1.一种植物油中氯酞酸的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：s1：样品前处理取适量植物油样品于离心管中，采用水、乙酸和乙腈的混合溶液进行涡旋混合提取，接着加入氯化钠进行涡旋混匀后再进行离心；取上层清液加入乙腈饱和的正己烷溶液进行涡旋混合净化，静置分层；收集下层清液并于35～45℃下氮吹至干，加入乙腈复溶，最后经0.1～0.3μm滤膜过滤得到待测样品溶液，留待lc-ms/ms检测；其中，所述植物油样品与水、乙酸、乙腈以及氯化钠的比例为1g:(1～1.5)ml:(0.04～0.06)ml:(4～6)ml:(0.4～0.6)g；s2：配制标准溶液将氯酞酸标准品用溶剂溶解并配制成具有2～100ng/ml浓度梯度的氯酞酸系列标准溶液；s3：样品检测将步骤s2中的氯酞酸系列标准溶液进行lc-ms/ms测定，得到标准工作曲线；将步骤s1中的待测样品溶液进行lc-ms/ms测定，采用外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测植物油中氯酞酸的含量。2.根据权利要求1所述的植物油中氯酞酸的检测方法，其特征在于，步骤s1中，所述涡旋混合提取的条件为涡旋10～15min；所述涡旋混匀的条件为涡旋30～60s；所述涡旋混合净化的条件为涡旋60～90s。3.根据权利要求1所述的植物油中氯酞酸的检测方法，其特征在于，步骤s1中，所述离心的条件包括离心转速为10000～20000rpm，离心时间为5～10min。4.根据权利要求1所述的植物油中氯酞酸的检测方法，其特征在于，步骤s1中，所述滤膜为有机滤膜，所述滤膜的孔径为0.22μm。5.根据权利要求1所述的植物油中氯酞酸的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述lc-ms/ms测定过程中液相色谱条件包括：色谱柱为waters beh hilic；柱温为35℃；流速为0.30ml/min；进样量为2μl；流动相以含0.02％v/v甲酸的10mmol/l乙酸铵水溶液作为a相且以含乙腈作为b相，采用梯度洗脱且梯度洗脱程序如下：0～0.3min的流动相为3％a相和97％b相的混合溶液，0.3～3.5min的流动相为3％～40％a相和97～60％b相的混合溶液，3.5～4min的流动相为40％～3％a相和60％～97％b相的混合溶液，4～6.5min的流动相为3％a相和97％b相的混合溶液。6.根据权利要求1所述的植物油中氯酞酸的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述lc-ms/ms测定过程中质谱条件包括：采用dionex ultimate 3000/tsq quantiva超高效液相色谱质谱联用仪；离子源为esi-；离子源电压为2800v；离子传输管温度为350℃；喷针温度为300℃；质谱扫描信息为：定量离子对为258.8/178.8，碰撞能为15v；定性离子对为258.8/176.8，碰撞能为15v。7.根据权利要求1所述的植物油中氯酞酸的检测方法，其特征在于，所述植物油为花生油、红花籽油、芥菜籽油、玉米油、亚麻籽油、麻油、坚果油、棉籽油、大豆油和葵花子油中的至少一种。
技术总结本发明属于农药残留检测技术领域，公开了一种植物油中氯酞酸的检测方法。采用水、乙酸和乙腈溶液对样品进行涡旋混合提取，加入氯化钠进行涡旋混匀后离心，最后在所得上层清液中加入乙腈饱和正己烷溶液进行涡旋混合净化，将植物油样品与水、乙酸、乙腈和氯化钠的比例控制在1g:(1～1.5)mL:(0.04～0.06)mL:(4～6)mL:(0.4～0.6)g；上述特定处理方法能够将杂质有效去除且仅保留目标产物。测得氯酞酸的仪器检测限为0.3ng/mL、方法检测限为0.15μg/kg且相关系数R2＞0.99，该方法具有快速简便、准确灵敏、环保廉价等特点，对植物油中氯酞酸残留检测具有实际应用及指导意义。检测具有实际应用及指导意义。检测具有实际应用及指导意义。
技术研发人员：杨旺火 叶筱菡 胡文莉 陈铭洋
受保护的技术使用者：中验检测股份有限公司 中验科学仪器（福建）有限公司
技术研发日：2022.04.21
技术公布日：2022/7/5
