1.本发明属于材料科学技术领域，具体涉及一种检测脂滴和内质网的荧光探针。
背景技术：2.真核细胞内的细胞器通常被膜系统分离，完成特定的生物功能。这些细胞器并不是独立的，它们相互密切合作、联系，以实现快速的物质交换、信息传递等许多重要的生物过程。因此细胞器之间的交流和相互作用是研究的重要课题。脂滴（lds）是由内质网(er)衍生而来的一种特殊的被磷脂单层包裹的细胞器，负责储存中性脂类如甘油三酯和胆固醇酯。脂滴在维持细胞内脂质稳态中起着重要作用，脂滴的调节异常可导致多种疾病，如肥胖、脂肪肝等。
3.内质网是广泛存在于真核细胞中的重要细胞器，是合成酶、脂类和跨膜蛋白的场所，脂滴与内质网的相互作用可促进脂滴相关蛋白、中性脂质和磷脂质从内质网向脂滴的有效转运同时，脂滴通过收集内质网应激和自噬过程中产生的游离脂质来降低脂质毒性。脂滴和内质网相互作用的缺陷会导致包括脂质营养不良和神经系统疾病在内的严重疾病。因此，可视化脂滴和内质网之间的相互作用对于阐明和揭示生物学和病理学的潜在机制至关重要。
4.双细胞器之间的相互作用可以通过各种方法实现可视化，包括透射电子显微镜、扫描电子显微镜和免疫荧光显微镜等。这些方法为揭示细胞器之间的相互作用提供了重要的工具。然而，这些方法需要对生物样品进行固定，这不可避免地会对样品造成损伤。与这些方法相比，荧光成像技术因其操作简单、对活细胞损伤小、分辨率合适、观察实时等优点而被广泛应用。荧光探针能够同时显示两个细胞器，是研究细胞器相互作用的有前途的工具。
5.为了揭示脂滴和内质网之间的相互作用，可选用荧光探针以不同的发射颜色标记这两个细胞器。然而，这类荧光探针的开发很少，已报道的探针也存在一定的不足。例如，guo等人（journal of the american chemical society 2021, 143 (8), 3169-3179.）基于激发态分子内质子转移(esipt)机制，提供了第一个用于脂滴和内质网双色荧光成像的荧光探针，然而，探针在脂滴和内质网中的发射光谱表现出明显的干扰。虽然上述探针在脂滴和内质网相互作用的研究中发挥了至关重要的作用，但灵敏度仍需提高，以提高准确性。因此，开发出能够识别在不同荧光通道中无干扰的脂滴和内质网的荧光探针具有重要的意义。
技术实现要素：6.本发明针对现有技术的不足，提供了一种检测脂滴和内质网的荧光探针，所述荧光探针代号为cca，分子结构式如下：
。
7.其中所述荧光探针的制备方法为：s1: 4-二乙氨基酮酸与环己酮在浓硫酸中回流6小时，冷却到室温，倒入冰水中，加入高氯酸，产生固体，过滤得到化合物1；s2：化合物1与化合物2在乙酸酐中回流12小时，冷却到室温，过滤得到粗产品，经硅胶色谱柱提纯得到荧光探针cca。
8.本发明的另一个目的是提供一种检测脂滴和内质网的荧光探针在同时双色成像细胞或组织中的脂滴和内质网中的应用。
9.上述荧光探针的工作原理如下：利用罗丹明染料的可逆开环/闭合反应，cca在非质子溶剂中呈环闭型绿色发射，在一定含水量条件下呈开环型近红外发射。脂滴的核心是高度疏水的，水含量可以忽略不计，而内质网膜则含有一定量的水。因此，cca在绿色荧光和近红外荧光中标记了脂滴和内质网，光谱差异高达320 nm。
10.与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：（1）本发明所得荧光探针基于分子内可逆的开环闭合反应，能同时区分、双色成像脂滴和内质网，有利于直观的研究双重细胞器之间的相互作用。
11.（2）本发明荧光探针在脂滴中呈环闭形式发出绿色荧光，在内质网中呈环开形式发出近红外荧光。光谱差异高达320 nm，因此两个发射通道之间互不干扰。
12.（3）本发明所得荧光探针，检测敏感，响应迅速，光稳定性强并且定位准确。
附图说明
13.图1为化合物cca的1h nmr谱图；图2为化合物cca的
13
c nmr谱图；图3为10 μm探针cca着色孵育hela细胞30 min的亮视野和荧光图；图4为图3中平方区域放大图；图5为探针cca着色不同组织中的脂滴和内质网图。
ml新鲜培养基，10 μm探针cca孵育30 min，尼康a1r显微镜观察细胞。对于绿色通道，λ
ex = 405 nm， λ
em = 500-550 nm; 近红外通道: λ
ex = 647 nm; λ
em = 663-738 nm。
20.如附图3所示，在绿色通道和近红外通道均检测到明亮的荧光信号。同时绿色发射呈点状，近红外荧光形成网状形态，表明cca在绿色和近红外发射中标记了脂滴和内质网，绿色通道和近红外通道的荧光信号从不重叠，这表明两个通道之间的干扰可以忽略不计。
21.图4放大图像显示，绿色荧光信号主要分布在细胞质中，并与黑点重叠。这些黑点可以指定为脂滴，由于脂滴是由折射率比水高的中性脂质组成，因此在dic图像中表现为黑点或亮点。
22.如图5所示，由于内质网和脂滴在不同组织中的分布差异较大，故采用cca对小鼠心脏、肝脏、肺和脂肪组织进行染色，观察内质网和脂滴的分布情况，如图所示，心肌绿色发射极弱，近红外荧光强烈，表明心肌几乎不含脂滴。同时肝脏显示出几个小的绿色发射点和强烈的近红外荧光，表明健康小鼠肝脏中脂滴的数量非常有限。在肺组织中，绿色和近红外通道均能检测到强烈的荧光信号，提示肺组织中存在大量脂滴和内质网。观察白色脂肪组织中脂滴和内质网的分布。可见，白色脂肪细胞中脂滴和内质网的分布非常有规律。细胞中央有较大的脂滴，周围有内质网包围。
技术特征：1.一种检测细胞内脂滴和内质网的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针代号为cca，分子结构式如下：。2.一种制备利要求1所述荧光探针的方法，其特征在于，所述制备方法为：s1：4-二乙氨基酮酸与环己酮在浓硫酸中回流得到化合物1；s2：化合物1与化合物2在乙酸酐中回流得到荧光探针cca。3.权利要求1所述的检测细胞内脂滴和内质网的荧光探针在同时双色成像细胞或组织中的脂滴和内质网中的应用。
技术总结本发明提供了一种可检测细胞内脂滴和内质网的荧光探针，该荧光探针由罗丹明染料部分和香豆素染料部分共同组建构成，是基于分子内可逆的开环/闭合的反应机理，可以在双发射通道中区分脂滴(LDs)和内质网(ER)。本发明的荧光探针光谱差异高达320 nm，在两个发射通道之间区分细胞器可以互不干扰，为促进细胞器相互作用的研究提供了一种重要的分子工具。作用的研究提供了一种重要的分子工具。作用的研究提供了一种重要的分子工具。
技术研发人员：田明刚 薛海燕 张启龙 王志远
受保护的技术使用者：济南大学
技术研发日：2022.05.23
技术公布日：2022/7/5
