her2/cep17基因检测探针及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及her2/cep17基因检测探针及其应用。
背景技术:2.乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤,是由乳房组织发展成的癌症。研究表明,一种受体型的酪氨酸激酶-人类表皮生长因子受体2(her2)在20%~30%的原发性乳腺浸润性导管癌中有基因的扩增和蛋白的过度表达。her2阳性的乳腺癌浸润性强,无病生存期短,预后差。《2005 st gallen国际治疗指南》指出,在乳腺癌风险级别评估因子当中,虽然淋巴结状态仍然是最重要的因素,但her2状态直接影响风险的级别。当淋巴结阴性或只有1~3个淋巴结有转移时,如her2过表达或基因扩增则风险级别分别由低上升为中,中上升为高。另外,把her2状态作为乳腺癌药物(环磷酞胺、阿霉素、5-氟尿嚓咙和曲妥珠单抗)治疗的主要参考指标。曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组dna衍生的人源化单克隆抗体,选择性地作用于her2的细胞外部位,适用于治疗her2过度表达的乳腺癌。由于只有her2过度表达和基因扩增的乳腺癌患者用曲妥珠单抗治疗才有效,因此正确检测和评定乳腺癌的her2状态至关重要。
3.her2基因位于17号染色体上,大约有47%的乳腺癌存在17号染色体非整体性(aneusomy),即17号染色体不是正常的二体(2条17号染色体),而是单体(1条17号染色体)或多体(3条或以上17号染色体)。在检测中应将17号染色体的非整体性和单纯的her2基因扩增,尤其是低水平的扩增区分开。当her2基因与17号染色体数目比值大于2时,即为her2基因扩增。因此,在检测her2的同时检测17号染色体着丝粒作为对照,就排除了单色探针(探针中仅有her2基因)可能造成的假阴性(17号染色体单体)或假阳性(17号染色体多体)。
4.当her2/cep17比值>2.0时,为her2阳性;her2/cep17比值《2.0,但平均her2拷贝数/细胞≥6.0时也为her2阳性。扩增细胞应均质、连续,且占浸润癌的10%以上。需要注意的是对于her2/cep17比值≥2.0,但平均her2拷贝数/细胞《4.0的病例是否应该视为ish阳性目前尚存一定争议。
5.目前一般采用免疫组织化学(ihc)检侧her2受体蛋白过度表达,应用荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization,fish)和显色原位杂交(chromogenic in situhybridization,cish)法检测her2基因扩增的水平。其中,fish是一种分子细胞遗传学技术,通过荧光标记的dna探针与细胞核内的dna靶序列杂交。在荧光显微镜下,于细胞和(或)组织原位观察并分析细胞核内杂交于dna靶序列的多种彩色探针信号,以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。临床使用美国fda已经批准的探针对her2进行检测,但其标记效果仍有待进一步提高。
技术实现要素:6.有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供标记效果更好的尤其涉及her2/cep17基因检测探针及其应用。
7.本发明提供了her2基因的检测探针,其为17号染色体上第39655584位~39817309位核酸。
8.本发明所述的her2基因的检测探针来自her2基因的bac克隆。本发明所述的her2基因的检测探针即为命名为rp11-94l15的bac克隆。经验证,该探针的标记效果优于her2基因的bac克隆:ctd-2019c10、rp11-1044p23或rp11-62n23。
9.本发明所述her2基因的检测探针上标记orange 552dutp。
10.所述orange 552dutp的标记方法采用缺口平移法。作为优选,标记温度为15℃,标记时间为1h,将标记产物放置冰上加入stop buffer 5μl,65℃5min终止反应。
11.标记后的探针用纯化柱进行纯化,每个探针过柱后的所有反应液合并。用乙醇沉淀,depc水溶解测定浓度。
12.本发明还提供了cep17位点的检测探针,其核酸序列如seq id no:1所示。
13.本发明查找并筛选人17号染色体着丝粒的高特异性区域,最终获得序列如seqid no:1所示的片段标记效果最优。然后,通过人工合成含有此序列的质粒puc-cep17。
14.本发明提供的cep17位点检测探针上标记cf488adutp。
15.cep17位点检测探针的标记采用pcr法。以含有标记的专用pcr mix对核酸序列进行扩增和标记。
16.本发明所述检测探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
17.本发明所述诊断包括根据患者her2是否过表达选择治疗药物。
18.her2过表达或称为her2阳性,该类患者应给予药物赫赛汀或拉帕替尼。
19.本发明还提供了一种乳腺癌的诊断试剂,其包括本发明所述的检测探针。
20.本发明中所述的诊断试剂中,还包括human cot-1和fish试剂。
21.检测中添加human cot-1能够封闭样品中的dna重复序列,减少非特异性结合。
22.本发明所述诊断试剂中,her2基因检测探针、cep17基因检测探针和human cot-1的质量比为0.05:1:25。
23.本发明所述fish试剂包括3m醋酸钠、无水乙醇、70vol%乙醇和探针杂交液。
24.本发明中,所述探针杂交液包括硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺和2
×
ssc。
25.本发明通过对多个核酸片段进行筛选,获得最优标记效果的探针。本发明提供的探针基于fish技术对样品进行检测,将其作为乳腺癌诊断的试剂,能够获得更准确、更灵敏的检测效果。
附图说明
26.图1示enzo试剂盒标记(bac克隆标记效果)
27.图2示质粒dna荧光标记结果;
28.图3示4个不同病例的乳腺组织切片结果;
29.图4示基因组中her2的位置。
具体实施方式
30.本发明提供了尤其涉及her2/cep17基因检测探针及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领
域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
31.本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。下面结合实施例,进一步阐述本发明:
32.实施例1
33.her2检测探针的制备方法包括以下步骤:
34.挑选包含目的基因her2基因序列的克隆,如图1所示,具体如下表,其购买于invitrogen rp11bac及ctd bac克隆库。
35.bac插入片段起止位置大小(bp)ctd-2019c10chr17:39577926-39786803208878rp11-1044p23chr17:39715531-39910359194829rp11-94l15chr17:39655584-39817309161726rp11-62n23chr17:39569388-39726617157230
36.探针制备:使用omega的bac/pac dna大量提取试剂盒,按照说明书要求的操作方法对不同bac克隆进行超低拷贝质粒dna提取,通过测定a260和a280的吸光度对质粒dna定量,要求提取dna的浓度大于200ng/μl,得到her2基因的一种、两种或三种的混合质粒。
37.每种克隆均进行标记,用有中期分裂相的外周血进行验证,根据杂交信号的荧光亮度、杂交效率、杂交位置是否正确对上述克隆进行筛选。上述提取获得的质粒用enzo试剂盒标记,其中,rp11-94l15荧光信号最优,其余bac克隆杂交信号弱,杂交效率低。筛选出最优标记效果质粒rp11-94l15(图1)。
38.通过缺口平移的方法对质粒dna进行荧光标记,her2基因标记的荧光染料为orange 552-dutp,采用enzo的nick translation kit,按如下体系进行配制:
39.质粒dna1μg dna用无核酸酶的水定容至30μlreaction buffer5μldntp mix(datp,dgtp,dctp)5μldttp*3.3μlorange 552 dutp1.7μl(0.3mm)nt enzyme mix5μl
40.(2)配制完成后震荡混匀,15℃标记1h,反应结束后将标记产物放置在冰上,加入5μl的stop buffer,65℃反应5min。取标记后产物5μl在2%琼脂糖凝胶做电泳,要求在50bp-250bp之间有条带(图2)。
41.(3)标记产物纯化,纯化方法如下:
42.①
每50μl反应体系需要1个mini spin g-50柱。
43.②
将mini spin g-50柱1000g离心2min。
44.③
弃掉管底溶液,将柱子重新放置于原离心管上。
45.④
再于1000g离心2min,将g-50柱子放置于新的离心管上。
46.⑤
将每50μl的反应液加入一个g-50柱子中。
47.⑥
1000g离心5min。
48.⑦
丢弃柱子。
49.⑧
将每个探针过柱后的所有反应液合并。
50.⑨
对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩,加入(v/10)醋酸钠及2.5v预冷无水乙醇。混匀后在-20℃冰箱中过夜。4℃14000rpm离心15min,去除上清,加入1/2倍体积的70%乙醇,4℃14000rpm离心15min,小心去除上清,避光干燥。加入10μl左右的depc水溶解沉淀,微量紫外分光光度测定浓度。
51.实施例2
52.cep17检测探针的制备方法包括以下步骤:
53.(1)查找cep17特异性序列,并根据筛选获得的高特异性片段设计引物,构建含有此片段质粒puc-cep17。
54.设计引物序列:探针引物1,tggatggagcaggtttgagaca
55.探针引物2,tcgttttccaccacaggcct
56.(2)puc-cep17质粒提取,用omega试剂盒进行提取。
57.(3)探针标记方法为pcr标记
58.非标记pcr体系如下
59.成份用量2
×
标记专用pcr mix25μldntp,2mm each5μl探针引物1(10pmol/μl)1μl(10μm)探针引物2(10pmol/μl)1μl(10μm)模板dna1ng质粒dna超纯水补到50μl
60.反应条件:
[0061][0062]
琼脂糖电泳:在500-700bp之间有较亮条带
[0063]
(5)胶回收
[0064]
用胶回收试剂盒对目的产物进行切胶回收,回收后进行浓度测定。
[0065]
(6)标记pcr反应体系
[0066]
dntpmix配制:10mm datp 5μl,10mm dgtp 5μl,10mm dctp 5μl,10mm dttp 1.5μl,1mm dutp 4.5μl,超纯水4μl
[0067]
成份用量2
×
标记专用pcr mix25μldntp mix5μl
探针引物1和探针引物2每种50pmol胶回收所得pcr产物10ng超纯水补到50μl
[0068]
反应条件:
[0069][0070]
琼脂糖电泳:在500bp上方有较亮的条带。
[0071]
(7)探针的纯化沉淀步骤同实施例1。
[0072]
实施例3
[0073]
her2/cep17探针混合液制备方法包括以下步骤:
[0074][0075][0076]
混合后加入(v/10)3m醋酸钠(ph5.2)和(2.5v)无水乙醇(-20℃预冷)混合,-20℃沉淀过夜,4℃14000g离心15min,70%乙醇洗涤,50μl探针杂交液(包括硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、2
×
ssc)进行溶解。
[0077]
实施例4:her2/cep17基因探针检测方法
[0078]
1、玻片脱蜡
[0079]
1.1将ffpe玻片56℃烤片机烘烤2-4h,或过夜。1.2用钻石笔在玻片背面标记出固定标本的位置。1.3将玻片浸入装有新鲜to型生物片透明剂的考普林瓶,常温放置10min,重复一次。1.4将玻片浸入100%酒精脱水,常温放置5min,重复1次(第二次需换瓶)。1.5自然燥玻片。
[0080]
2、玻片预处理
[0081]
2.1将50ml1x预处理溶液在考普林瓶,90
±
1℃循环水浴锅预热。
[0082]
2.2将玻片浸入90
±
1℃预热的1
×
预处理溶液,90
±
1℃孵育45分钟至1小时。
[0083]
2.3将玻片浸入2
×
ssc,室温放置1min,重复1次。
[0084]
2.4将玻片浸入纯化水1min,然后自然干燥。
[0085]
3、蛋白酶处理
[0086]
3.1将玻片置于原位杂交仪37℃预热10min。3.2取胃蛋白酶至溶解完全。(胃蛋白酶不要预热)3.3滴加胃蛋白酶溶液(每张玻片400-500ul)至预热的玻片上,覆盖样本区域,避免枪头接触样品。3.4 37℃原位杂交仪上10-20min。3.5去掉蛋白酶溶液ⅰ,将玻片浸入2
×
ssc,室温放置2min,重复1次。3.6将玻片依次置于70%、90%和100%乙醇中各1min。3.7自然干燥玻片
[0087]
4、探针与样本杂交
[0088]
4.1在玻片杂交仪上设置杂交程序:80℃变性5分钟,然后45℃过夜杂交。4.2将10ul探针混合溶液直接滴加到上述步骤处理好的各张玻片,用枪头去除气泡。4.3小心地盖上22
×
22mm盖玻片,让样品备被探针混合液缓慢扩展全面覆盖。4.4用橡胶水泥封边。4.5进行“玻片洗涤”[0089]
5、玻片洗涤(避光操作)
[0090]
5.1将50ml洗涤溶液ⅰ置于考普林瓶,73
±
1℃水浴锅预热。5.2用镊子小心移去胶水封边。5.3将玻片浸于装有2
×
ssc的玻片缸,轻轻摇动让盖玻片自行脱落。5.4将玻片置于上述预热的洗涤溶液中洗涤5min,每隔1min轻轻摇动或上下抽动玻片2-3次。5.5将玻片转移到常温下的洗涤溶液ⅱ中,室温放置1min。5.6使用纯化水漂洗一下甩掉水迹,自然干燥。
[0091]
6、镜检
[0092]
6.1滴加10uldapi于杂交区域,去除气泡,小心地盖上22
×
22mm盖玻片,让dapi溶液在盖玻片下缓慢扩散全面覆盖。6.2室温避光放置10-20min。6.3在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。
[0093]
7、结果分析
[0094]
以临床乳腺组织切片观察结果为例,相关dapi和荧光需用合适的滤块观察,其中cep17探针显示绿色信号,her-2探针显示橙色信号(图3)。使用合适的滤镜,在40
×
镜下寻找,在100
×
镜下计数。扫描几个肿瘤细胞区域,选择细胞轮廓清晰,dapi染色均匀,细胞核无重叠,探针信号清晰的部位进行计数。选取相间的20个肿瘤细胞,每个细胞核内的橙色和绿色荧光信号进行计数统计,计算her-2与cep17的比值以及her-2拷贝数与细胞数的比值。
[0095]
结果分析注意事项:
[0096]
1、只计数病发的肿瘤组织。2、避免选取背景较高、信号弱或没有信号的区域。3、计数的细胞各通道信号清晰可辨。4、避免选取细胞轮廓不清晰的区域。
[0097]
计数结果的判读:
[0098]
当her-2/cep17比值≥2.0时,为her-2扩增阳性;
[0099]
当her-2/cep17<2.0,但平均her-2拷贝数/细胞≥6.0,her-2扩增阳性。扩增细胞应均质、连续,且占浸润癌的10%以上;
[0100]
当her-2/cep17<2.0,且平均her-2拷贝数/细胞<4.0时为阴性结果;
[0101]
当her-2/cep17<2.0且平均her-2拷贝数/细胞<6.0,但≥4.0为fish her-2扩增不确定。
[0102]
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征:1.her2基因的检测探针,其为17号染色体上第39655584位~39817309位核酸。2.根据权利要求1所述的检测探针,其特征在于,所述探针上标记orange 552 dutp。3.cep17位点的检测探针,其特征在于,其核酸序列如seq id no:1所示。4.根据权利要求3所述的检测探针,其特征在于,所述探针上标记cf488a dutp。5.权利要求1~4所述检测探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述诊断包括根据患者her2是否过表达选择治疗药物。7.一种乳腺癌的诊断试剂,其特征在于,包括权利要求1~4所述的检测探针。8.根据权利要求7所述的诊断试剂,其特征在于,还包括human cot-1和fish试剂。9.根据权利要求8所述的诊断试剂,其特征在于,her2基因检测探针、cep17基因检测探针和human cot-1的质量比为0.05:1:25。10.根据权利要求8所述的诊断试剂,其特征在于,所述fish试剂包括3m醋酸钠、无水乙醇、70vol%乙醇和探针杂交液;所述探针杂交液包括硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺和2
×
ssc。
技术总结本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用。本发明通过对多个核酸片段进行筛选,获得最优标记效果的探针。本发明提供的探针基于FISH技术对样品进行检测,将其作为乳腺癌诊断的试剂,能够获得更准确、更灵敏的检测效果。更灵敏的检测效果。
技术研发人员:刘一丁 李先坤 王艺杰
受保护的技术使用者:郑州科蒂亚生物技术有限公司
技术研发日:2022.05.20
技术公布日:2022/7/5