一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的poshak1:osfln2表达载体及其应用
技术领域
1.本发明属于作物转基因的技术领域，具体涉及一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的poshak1:osfln2表达载体及其应用。
背景技术：2.干旱造成的危害83％以上发生在农业领域，影响粮食供应和人民生活，已成为全球最严重的饥荒诱发因素。水稻是一种耗水量大的作物，对水分的需求使其极易遭受干旱胁迫，全球每年因干旱导致减产近1800万吨。我国水资源条件无法支撑传统水稻的进一步发展，因此，创制抗旱水稻品种，可以缓解水稻生产中水资源的过度消耗，对保障粮食安全具有重要意义。
3.植物的抗旱机制包括形态、生理适应和细胞调节等，在不同阶段受遗传因素控制。形态适应包括根系长度和生物量增加，蜡质或厚叶覆盖，叶重、叶形和表皮细胞减小，叶片衰老延缓以及绿叶面积增加。生理适应包括较高的气孔密度和导度，蒸腾速率降低，更优的生产、积累、同化以及营养器官的干物质分配。细胞调节需要提高叶绿素含量、收获指数和降低渗透势。非还原二糖和寡糖等渗透调节物质的积累、光合效率的降低以及碳水化合物代谢的改变，在缓解胁迫中发挥重要作用。光合产物主要以蔗糖的形式在体内长距离运输，既为组织代谢提供能量，又作为信号分子和渗透调节剂在有限的水分供应下防止器官损伤。维持不同组织间的糖分稳态对逆境胁迫下植株的生长发育至关重要。对c4-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶转基因株系的生理研究表明，蔗糖代谢影响水稻的抗旱性。在干旱等非生物胁迫条件下增强海藻糖的生物合成可以显著提高水稻产量。osgols2过表达水稻抗旱性的提高是体内棉子糖半乳糖苷系列寡糖的积累所致。
技术实现要素：4.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的poshak1:osfln2表达载体及其应用。
5.本发明的技术内容如下：
6.本发明提供了一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的poshak1:osfln2表达载体，该表达载体为通过采用含有渗透/干旱响应关键区段的oshak1启动子(可有效避免组成型过表达功能基因导致不利的生长发育表型这一问题)，在干旱胁迫下，诱导编码pfkb家族中的果糖激酶类似蛋白基因osfln2的表达；
7.所述osfln2的核酸序列如序列表seq id no.1所示；
8.所述oshak1启动子的核酸序列如序列表seq id no.2所示；
9.所述poshak1:osfln2表达的氨基酸序列如序列表seq id no.3所示，为翻译后osfln2的氨基酸序列。
10.本发明还提供了一种poshak1:osfln2表达载体应用于水稻转基因，用于提高水稻
的糖代谢水平和抗旱性。
11.本发明还提供了一种poshak1:osfln2转基因株系，具有较优异的耐旱性。
12.本发明的有益效果如下：
13.本发明的一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的poshak1:osfln2表达载体，为采用受干旱/渗透胁迫诱导上调表达的基因oshak1的启动子，驱动编码果糖激酶类似蛋白基因osfln2在水稻中表达，发现干旱胁迫下，poshak1:osfln2促进体内糖分的合成和运输，并显著提高植株的抗旱性。因此，将干旱诱导型基因启动子与糖代谢基因结合，是创造稳产、高抗种质有效的转基因策略；
14.本发明所述poshak1:osfln2转基因株系在对照条件下正常生长，没有出现不利的表型，而peg处理后，糖代谢指标pn、sps、ser均显著高于wt，这与osfln2在干旱胁迫下的诱导表达密切相关，并且在t1代和t2代稳定遗传；poshak1:osfln2的表达，促进水稻根系生长，在干旱胁迫下，poshak1:osfln2转基因植株根系的生物量、总根长和根表面积均显著高于wt，这可能与作为营养物质的蔗糖在库器官的含量有关；干旱胁迫下，poshak1:osfln2的表达导致较高的脯氨酸含量在一定程度上有助于降低电解质渗透率，表明干旱引起的转基因植株脂质过氧化程度低于wt。水稻自噬基因osatg8a在叶片衰老过程中表达量增加。sgr和osatg8a在转基因株系中受干旱诱导增强表达的趋势显著低于wt，表明poshak1:osfln2的表达减缓peg处理引发的叶片衰老。利用干旱诱导型基因oshak1的启动子驱动osfln2的表达，可以改善胁迫下的糖代谢水平，进而提高水稻的抗旱性。
附图说明
15.图1为干旱胁迫对水稻糖分代谢的影响结果图；
16.图2为表达载体的构建及水稻遗传转化过程示意图；
17.图3为干旱胁迫下t1代poshak1:osfln2转基因株系与wt的fln2表达量和净光合速率差异分析结果图；
18.图4为干旱胁迫下poshak1:osfln2转基因株系与wt的苗期生长差异分析结果图；
19.图5为干旱胁迫下poshak1:osfln2转基因株系与wt的糖代谢差异分析结果图；
20.图6为干旱胁迫下poshak1:osfln2转基因株系与wt的根系构型差异分析结果图；
21.图7为干旱胁迫下poshak1:osfln2转基因株系与wt的保水能力和脂质过氧化程度差异分析结果图；
22.图8为干旱胁迫下poshak1:osfln2转基因株系与wt中衰老和胁迫响应相关基因的表达差异分析结果图。
具体实施方式
23.以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。
24.若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
25.实施例
26.构建poshak1:osfln2转基因水稻
fln2[j].biomolecules,2020,10(1):17.)的方法进行测定。
[0035]
5.实时荧光定量pcr(qrt-pcr)：参考论文(chen g,hu q,luo l,et al.rice potassium transporter oshak1 is essential for maintaining potassium-mediated growth and functions in salt tolerance over low and high potassium concentration ranges[j].plant,cell&environment,2015,38(12):2747-2765.)的步骤，分别提取正常和干旱处理下t1代转基因株系、不含目的片段的分离株系和野生型(wt)植株地上部以及t2代纯合株系和wt植株叶片的rna。水稻ubq5(loc_os01g22490)为内参基因，参考论文(chen g,wu c,he l,et al.knocking out the gene rls1 induces hypersensitivity to oxidative stress and premature leaf senescence in rice[j].international journal of molecular sciences,2018,19(10):2853.)的算法确定相对表达丰度，实验中使用的各种定量引物序列见表1，各基因的引物核酸序列分别如序列表中的seq id no.4～seq id no.15所示(从左至右，从上至下)。
[0036]
表1荧光定量pcr所用引物
[0037][0038]
6.根长和根表面积的测定：参考论文(chen g,liu c,gao z,et al.driving the expression of raa1 with a drought-responsive promoter enhances root growth in rice,its accumulation of potassium and its tolerance to moisture stress[j].environmental and experimental botany,2018,147:147-156.)的方法，利用根系分析仪(winrhizov4.0b，regent instrument公司，加拿大)扫描不同处理的根系，记录总根长和根表面积。每个处理每个株系测量5个单株。
[0039]
7.相对含水量和失水率的测定：相对含水量(rwc)的测定方法参考论文(chen g,liu c,gao z,et al.driving the expression of raa1 with a drought-responsive promoter enhances root growth in rice,its accumulation of potassium and its tolerance to moisture stress[j].environmental and experimental botany,2018,147:147-156.)：胁迫结束后将植株叶片离体称重，记录鲜重(fw)，将这些叶片用去离子水浸泡4h，测定其饱和重量(sw)，叶片80℃烘干48h，确定干重(dw)，rwc按公式计算：rwc＝(fw-dw)/(sw-dw)
×
100％。参照该论文的方法测定离体叶片失水率。将苗期wt和转基因植株叶片剪碎称重，然后在室温下暴露于空气中，在指定时间点称重后计算。
[0040]
8.电解质渗透率的测定：电解质渗漏分析参考论文(chen g,liu c,gao z,et al.oshak1,a high-affinity potassium transporter,positively regulates responses to drought stress in rice[j].frontiers in plant science,2017,8:
1885.)的方法进行：新鲜的叶片收获后用去离子水清洗以去除表面附着的离子，之后立即放入装有30ml去离子水的烧杯中，将烧杯置于25℃，120rpm振荡3h，用电导率仪(ec215，hanna，意大利)测定浸泡液的电导率(ec1)。然后将浸入溶液的样品在100℃下煮沸20min，冷却至室温后测量溶液的电导率(ec2)。相对电解质渗透率(rel)按公式计算：rel＝ec1/ec2*100％。
[0041]
9.脯氨酸含量的测定：参考论文(chen g,liu c,gao z,et al.oshak1,a high-affinity potassium transporter,positively regulates responses to drought stress in rice[j].frontiers in plant science,2017,8:1885.)的方法测定叶片中的脯氨酸的含量：取叶片约0.5g，用5ml 3％磺基水杨酸匀浆，12000g离心10min，取1ml上清液与1ml酸性茚三酮和1ml冰乙酸混合，100℃孵育1h，在冰浴中终止反应，用2ml甲苯萃取显色，用酶标仪(spectramax m5，molecular devices公司，美国)在520nm处测定吸光度。
[0042]
以上指标检测结果如下：
[0043]
1.干旱胁迫影响水稻糖分代谢
[0044]
水稻在正常irri营养液中生长6周，再用15％peg处理后，水稻体内糖分代谢发生显著变化：叶片的净光合速率、sps活性和蔗糖外运速率分别降低31％、24％和39％(图1a-c)。干旱显著抑制蔗糖从源到库的转运，表现为胁迫下叶片中蔗糖含量增加40％，而根中却减少25％(图1d-e)。
[0045]
2.构建poshak1:osfln2转基因水稻
[0046]
基于干旱诱导水稻糖代谢发生变化的研究现象，通过poshak1:osfln2转基因株系与wt之间干旱胁迫响应的差异分析，验证促进糖分的合成和运输是否可以提高水稻的抗旱性。如图2所示，利用gus染色鉴定阳性植株，t0代共获得24个独立的转基因株系。
[0047]
水稻在正常irri营养液中生长2周，再用15％peg处理7天。选择5个t1代阳性株系及其相应的不含目的片段的分离株系(null segregant，ns)分析osfln2的表达量和净光合速率，发现在正常和干旱条件下，ns和wt均没有差异；在wt和ns的地上部，干旱抑制osfln2的表达，但在转基因植株中，osfln2的表达量增加1-2倍(图3a)；与此同时，净光合速率的下降幅度显著低于wt和ns(图3b)，因此，在t2代的水培试验中，选择gus染色全部阳性的两个纯合poshak1:osfln2株系并以wt作为唯一的阴性对照。
[0048]
3.poshak1:osfln2对水稻苗期生长的影响
[0049]
在正常和含15％peg的水稻营养液中培养wt和t2代poshak1:osfln2纯合转基因株系，评估poshak1:osfln2的表达如何影响水稻生长。如图4所示，在正常营养液中生长时，转基因植株与wt的生长没有差异，地上部和根系生物量相似。将幼苗置于干旱胁迫下，wt植株叶片严重萎蔫，而转基因植株的失水表型明显减轻，此外，干旱对转基因植株地上部和根系生长的抑制程度显著低于wt，导致胁迫下地上部干重高于wt 15-17％，根系干重高于wt 13％-20％(图4b，c)。
[0050]
4.poshak1:osfln2对水稻体内糖代谢的影响
[0051]
对wt和poshak1:osfln2转基因植株体内的糖代谢水平进行分析比较，以验证转基因株系是否通过维持糖分稳态来提高水稻的抗旱性。糖分合成关键酶sps的活性在对照条件下，wt和转基因植株没有显著差异(图5a)，在peg处理下，wt的sps活性只有转基因株系的87％(图5a)。poshak1:osfln2的表达在干旱胁迫下显著提高糖分从源到库的转运，具体表
现为转基因株系叶片的蔗糖外运速率高于wt 25％-37％，叶片中的蔗糖含量比wt低6％-13％，而根中的蔗糖含量比wt高7％-10％(图5b-d)。
[0052]
5.poshak1:osfln2对水稻根系构型的影响
[0053]
根系构型影响干旱条件下水分的高效获取，因此，进一步明确poshak1:osfln2转基因植株与wt根系对干旱的响应是否存在差异。如图6所示，peg处理显著降低植株的总根长和根表面积，但对wt根的影响相对较强，导致受胁迫转基因株系的总根长高于wt 16％-21％，根表面积高于wt 9％-13％。
[0054]
6.poshak1:osfln2对水稻持水能力和脂质过氧化程度的影响
[0055]
干旱胁迫下，与对照相比，wt和转基因株系的相对含水量均降低，但转基因植株的相对含水量显著高于wt(图7a)，可能归因于植株的失水率不同：wt离体叶片失水的速度快于转基因株系(图7b)，这些结果表明poshak1:osfln2的表达提高水稻的保水能力。
[0056]
在正常生长条件下，wt和转基因水稻植株具有相似的电解质渗透率和脯氨酸含量，但在干旱处理后，转基因株系的电解质渗透率只有wt的74％-81％(图7c)，而脯氨酸含量高于wt 29％-33％(图7d)。综上，poshak1:osfln2转基因株系抗旱性的提高可能是由于植株较强的保水能力、较少的电解质外渗以及较多的脯氨酸积累。
[0057]
7.poshak1:osfln2对衰老、胁迫响应基因表达的影响
[0058]
为进一步明确poshak1:osfln2的表达提高水稻抗旱性的机制，对正常和干旱条件下生长的wt和转基因株系进行基因表达差异分析。所选基因分为两类：sgr和atg8a属于衰老指示基因，snac1和myb2是胁迫响应基因。正常条件下，检测到所选基因相对较弱的表达，并且在wt和转基因植株中的差异不明显(图8)。胁迫处理后，基因的表达量相较于对照植株均显著提高，衰老指示基因在poshak1:osfln2植株中的上调幅度低于wt，导致sgr表达量只有wt的56％-63％，atg8a表达量只有wt的66％-74％(图8a，b)；而胁迫响应基因在转基因株系中的上调幅度高于wt，导致snac1表达量是wt的1.35-1.61倍，myb2表达量是wt的1.31-1.47倍(图8c，d)。这些结果表明，抑制干旱诱导的衰老指示基因和促进胁迫响应基因的上调表达，是poshak1:osfln2转基因株系抗旱性提高的重要原因之一。
[0059]
综上得出，干旱抑制水稻体内糖分的合成和运输，利用干旱诱导型基因oshak1的启动子驱动osfln2的表达，可以改善胁迫下的糖代谢水平，进而提高水稻的抗旱性。
技术特征：1.一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的poshak1:osfln2表达载体。2.根据权利要求1所述的poshak1:osfln2表达载体，其特征在于，所述poshak1:osfln2表达载体为利用渗透/干旱胁迫诱导表达启动子oshak1，驱动糖代谢相关基因osfln2得到。3.一种poshak1:osfln2表达载体应用于水稻转基因，用于提高水稻的糖代谢水平和抗旱性。4.一种采用权利要求1所述poshak1:osfln2表达载体的转基因株系。
技术总结本发明属于作物转基因的技术领域，具体涉及一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的pOsHAK1:OsFLN2表达载体及其应用。采用受干旱/渗透胁迫诱导上调表达的基因OsHAK1的启动子，驱动编码果糖激酶类似蛋白基因OsFLN2在水稻中表达，发现干旱胁迫下，pOsHAK1:OsFLN2促进体内糖分的合成和运输，并显著提高植株的抗旱性。本发明所述pOsHAK1:OsFLN2转基因株系在对照条件下正常生长，没有出现不利的表型，而PEG处理后，糖代谢指标Pn、SPS、SER均显著高于WT，这与OsFLN2在干旱胁迫下的诱导表达密切相关，并且在T1代和T2代稳定遗传。代稳定遗传。代稳定遗传。
技术研发人员：陈光 王旭 杜瑞英 杨秀丽
受保护的技术使用者：广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所
技术研发日：2022.02.11
技术公布日：2022/7/5
