一种葡萄果梗多酚氧化酶vvppo1亚细胞定位检测研究方法
技术领域
1.本发明涉及葡萄果梗多酚氧化酶技术领域，具体为一种葡萄果梗多酚氧化酶vvppo1亚细胞定位检测研究方法。
背景技术：2.多酚氧化酶(ppo：ec 1.10.3.1)是一种具有酪氨酸酶/单酚醇化酶和/ 或儿茶酚酶/二酚醇化酶活性的含两个铜原子的酶，广泛存在于植物、真菌和细菌中。ppos被称为双铜金属酶，具有两个保守的铜结合域cua和cub，负责铜与分子氧和酚基底物的配位和相互作用。以往研究发现植物中的ppo生成位置因品种不同存在显著差异，可不同程度的定位于叶绿体中、质体、类囊体腔和线粒体等细胞器，由细胞核基因编码，在细胞质中合成，然后转移到其他区域，而多酚在液泡中积累。多酚氧化酶(ppo)是一种具有核编码的质体酶，但在融入质体之前是没有活性的。所以ppos和多酚之间的酶褐变只有在亚细胞分隔因物理损伤或细胞衰老而丧失时才会发生。虽然ppo介导的反应对植物防御系统有重要作用，但由于ppo引起的褐变显著降低了植物产品的贮藏寿命和商业价值。因此，防止ppo介导的褐变反应在鲜果中具有重要意义。事实上，不同来源的多酚氧化酶存在于不同类型的载体中，而同一种载体的不同ppos由于基因的特异性表达，在不同组织中也起着不同的作用。例如，suehiro等人发现vvppo1和vvppo2与果皮褐变有关，尤其是浆果皮褐变。与vvppo1相比，在
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shine muscat’葡萄浆果中，vvppo2表达特异性上调，与皮肤褐变有关。同样，rosales等人发现未做任何处理的果梗褐变与 vvppo1(最初确定为gpo1)的增加有关。
3.多酚氧化酶ppo是一种公认的参与褐变过程的酶。大量研究证实，水果和蔬菜的褐变主要是由氧化还原酶介导的酶促反应将多酚氧化成深棕色的醌类。常用于延缓果蔬褐变的方法是通过降低酶含量或抑制酶活性来抑制褐变。多酚氧化酶(ppo)主要参与了葡萄浆果和果梗的褐变过程，有学者在基因克隆表达、功能预测方面开展了分子水平的深入分析，但对亚细胞定位的具体功能位置未做观察。因此，对ppo的进一步研究将有助于从根本上解决鲜食葡萄果穗褐变问题。
4.多酚氧化酶在植物中的作用和调控措施较为复杂，在葡萄果梗褐变中的研究尚处于空白。因此，作为基因功能研究的一部分，通过对编码葡萄果梗多酚氧化酶的基因开展亚细胞定位研究，旨在为进一步研究该基因的分子生物调控机制究奠定基础。
技术实现要素：5.为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种葡萄果梗多酚氧化酶基因vvppo1亚细胞定位检测研究方法，具备通过对编码葡萄果梗多酚氧化酶的基因开展亚细胞定位研究，旨在为进一步研究该基因的分子生物调控机制究奠定基础的优点，解决了现有对多酚氧化酶的亚细胞定位研究不足的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种葡萄果梗多酚氧化酶基因vvppo1亚细胞定位检测研究方法，包括以下检测步骤：步骤s1、克隆，步骤s2、载体构建，步
骤s3、烟草转基因，步骤s4、转基因烟草检测，步骤 s5、转基因烟草观察；
7.步骤s1：vvppo1 cdna全长克隆；
8.步骤s2：植物荧光表达载体的构建；
9.步骤s3：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验；
10.步骤s4：转基因烟草植株的获得及其pcr检测；
11.步骤s5：转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察。
12.作为本发明优选的，所述步骤s2在构建时，将目的片段连接到载体pbi121 (携带penter/d-topo)上，该载体不包含终止密码子tga的c末端融合物，得到vvppo1与gfp融合的瞬时表达载体，根据vvppo1全长cdna的orf设计一对引物：正向：5
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caccatggcttctcttt ctcctc-3’，反向：5
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agaggcaagctcaatttcaattccg-3’，然后使用gateway lr clonase ii plus enzyme mix将这些基因重组到pgwb5-gfp目的载体中，载体相关信息如下： pgwb5序列信息：ncbi中登录号为ab289768，序列为(aagctt)
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35s promoter
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(gagctc)，可形成载体(35s promoter，c-sgfp)(
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35s promoter-r1-ccdb-r2-sgfp
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)， pgwb5载体和lr反应产物融合后具有抗卡那霉素和潮霉素(50ug ml-1)特性， gfp序列信息：tggtgagcaagggcgaggagctgttcaccg gggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtgvaacggccacaagttcagcgtgtccggc gagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagkttcatctgcaccaccggcaagct gcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcacctacggcgtgvcagtgcttcagccgctacc ccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggcgtacgtccaggagcgc accatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcfgagggcgacac cctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctglgggcaca agctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcgatc aaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccag qcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtc cgccactgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccg ccgggatcactcacggcatggacgagctgtacaagtaa。
13.作为本发明优选的，所述步骤s4在检测时，根据genbank上发表的gfp基因序列设计一对引物，上游引物为5
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atggtgagcaagggcgaggagc-3’；下游引物为5
’‑
tcaaagatctaccatgtacagctcgt-3’，参照ctab法抽提转基因烟草dna，并以此为模板进行扩增，扩增体系同前，扩增程序为94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，pcr扩增结束后，扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳中分离，紫外灯下检测分析。
14.作为本发明优选的，所述步骤s5在观察时，可利用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片，检测gfp在叶肉细胞中的表达，观察参数为40倍油浸，激发波长为488nm，带通bp为505-530nm，长通lp为560nm，所有瞬时表达测定至少重复三次。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
16.1、本发明通过使用本方法对葡萄果梗多酚氧化酶基因vvppo1亚细胞定位检测，可以为今后进一步挖掘vvppo1基因功能提供实验材料，解决了现有对多酚氧化酶的亚细胞定位研究不足的问题。
附图说明
17.图1为本发明流程图。
18.图2为vvppo1全长pcr扩增和dh5α克隆菌液检测结果示意图。
19.图3为烟草转基因植株pcr鉴定结果示意图。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.如图1-图3所示所示，一种葡萄果梗多酚氧化酶基因vvppo1亚细胞定位检测研究方法，包括以下检测步骤：步骤s1、克隆，步骤s2、载体构建，步骤s3、烟草转基因，步骤s4、转基因烟草检测，步骤s5、转基因烟草观察；
22.步骤s1：vvppo1 cdna全长克隆；
23.根据rna-seq数据筛选出的cds区域，参考ncbi网中xu qian(xu etal.,2014)的ab871370.1信息，使用引物在线软件primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计一对引物，即正向：5
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atggcttctctttctcctccgg-3’，反向：5
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tcaagaggcaagctcaatttc-3’。根据cdna末端race-pcr快速扩增得到全长vvppo1，扩增片段及全长克隆见附图2，测序结果如下表。
24.从图2(左)可以看出，通过扩增获得葡萄果梗中的cdna片段在2010bp 左右处有一条明显的条带，并且条带清晰度较高，特异性较好，而且条带单一，故可以初步表明已经扩增到目的基因片段。因此，可将其回收，进行下一步的克隆实验。回收产物与克隆载体连接、转化后，在含有x-gal和iptg 的lba平板培养基上进行蓝白斑筛选，进行菌液检测，并分别挑选20个白斑到lb液体培养基中进行培养。菌液pcr后进行琼脂糖凝胶电泳检测(图 2右)，发现1、3、5、6和14号克隆子中含有目的基因，且扩增得到的片段大小基本一致，说明它们对应的质粒都是含有目的片段的重组质粒。将相应的阳性克隆菌液送上海生工测序。
25.测序结果通过open reading fame finder(orf)软件分析获得下表，序列包含起始密码子atg和终止密码子tga，为全长的开放阅读框，确定 vvppo1包含一个全长2007bp开放阅读框(orf)，编码一个含有668个氨基酸残基的多肽，具有跨膜特性，没有信号肽。用protparam tool软件预测 vvppo1基因所编码的蛋白质的相对分子质量74.71kda，理论等电点pi为 6.64。分子式为c
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，原子总数为10480。估计半衰期为30h。经blast分析表明，该片段含有酪氨酸高度保守的特异结构域。
[0026][0027]
步骤s2：植物荧光表达载体的构建；
[0028]
步骤s2在构建时，将目的片段连接到载体pbi121(携带penter/d-topo) 上，该载体不包含终止密码子tga的c末端融合物，得到vvppo1与gfp融合的瞬时表达载体，根据vvppo1全长cdna的orf设计一对引物：正向：5
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caccatggcttctcttt ctcctc-3’，反向：5
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agaggcaagctcaatttcaattccg-3’，然后使用gateway lr clonase ii plus enzyme mix将这些基因重组到 pgwb5-gfp目的载体中，载体相关信息如下：pgwb5序列信息：ncbi中登录号为ab289768，序列为(aagctt)
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)， pgwb5载体和lr反应产物融合后具有抗卡那霉素和潮霉素(50ug ml-1)特性， gfp序列信息：tggtgagcaagggcgaggagctgttcaccg gggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtgvaacggccacaagttcagcgtgtccggc gagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagkttcatctgcaccaccggcaagct gcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcacctacggcgtgvcagtgcttcagccgctacc ccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggcgtacgtccaggagcgc accatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcfgagggcgacac cctggtgaaccgca
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[0029]
步骤s3：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验；
[0030]
步骤s4：转基因烟草植株的获得及其pcr检测；
[0031]
步骤s4步骤s4将构建好的pbi121-vvppo1-gfp质粒以及仅含有gfp基因的pbi121质粒(pbi121-gfp)分别借助电击法转化农杆菌gv3101细胞，参照注射法分别对烟草叶片进行接种转化，烟草叶片转染后做好标记，见附图3。接种后36h～72h采集10个转化叶片提取dna检测转化效果，见附图 3。电泳结果显示，在转vvppo1-gfp基因的烟草植株中pcr检测结果全部呈阳性，大小与目的片段一致，而在转gfp基因的烟草植株中有2株扩增呈假阳性。
[0032]
在检测时，根据genbank上发表的gfp基因序列设计一对引物，上游引物为5
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atggtgagcaagggcgaggagc-3’；下游引物为5
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tcaaagatctaccatgtacagctcgt-3’，参照ctab法抽提转基因烟草dna，并以此为模板进行扩增，扩增体系同前，扩增程序为94℃变性30s，59℃退火30s， 72℃延伸90s，共35个循环，pcr扩增结束后，扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳中分离，紫外灯下检测结果见附图2；
[0033]
步骤s5：转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察；
[0034]
步骤s5在观察时，对pcr检测阳性的植株，利用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片，检测gfp在叶肉细胞中的表达，观察参数为40倍油浸，激发波长为488nm，带通bp为505-530nm，长通lp为560nm，所有瞬时表达测定至少重复三次；野生型烟草出现叶绿素自荧光信号，但在发光波段没有信号。在pbi121-gfp转基因植株中，叶绿素自身荧光信号出现，但gfp荧光在细胞质中呈弥散状分布。在pbi121-vvppo1-gfp转基因植物中，gfp荧光信号和叶绿素自荧光信号被共定位到叶绿体中。结果表明，本研究获得的葡萄果梗多酚氧化酶基因编码的成熟肽位于叶绿体中。
[0035]
综上，本发明的检测研究方法实现了以下突破：
[0036]
(1)本发明检测研究方法成功克隆了葡萄果梗中vvppo1的全长为 2010bp，包含2007bp的开放阅读框，编码668个氨基酸残基，分子式为 c
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。
[0037]
(2)本发明检测研究方法成功构建了烟草转化表达载体pbi121
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vvppo1-gfp，为今后进一步挖掘vvppo1基因功能提供了实验材料。
[0038]
(3)本发明检测研究方法在pbi121-vvppo1-gfp转基因烟草植株中， gfp荧光信号和叶绿素自荧光信号被共定位到叶绿体中。表明本研究获得的葡萄果梗vvppo1基因编码的成熟肽位于叶绿体中，结果为今后研究vvppo1基因在细胞水平上的作用提供了实验依据。
[0039]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：1.一种葡萄果梗多酚氧化酶基因vvppo1亚细胞定位检测研究方法，其特征在于，包括以下检测步骤：步骤s1、克隆，步骤s2、载体构建，步骤s3、烟草转基因，步骤s4、转基因烟草检测，步骤s5、转基因烟草观察；步骤s1：vvppo1 cdna全长克隆；步骤s2：植物荧光表达载体的构建；步骤s3：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验；步骤s4：转基因烟草植株的获得及其pcr检测；步骤s5：转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察。2.根据权利要求1所述的一种葡萄果梗多酚氧化酶基因vvppo1亚细胞定位检测研究方法，其特征在于：所述步骤s2在构建时，将目的片段连接到载体pbi121(携带penter/d-topo)上，该载体不包含终止密码子tga的c末端融合物，得到vvppo1与gfp融合的瞬时表达载体，根据vvppo1全长cdna的orf设计一对引物：正向：5
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技术总结本发明公开了一种葡萄果梗多酚氧化酶基因VvPPO1亚细胞定位检测研究方法，包括以下检测步骤：步骤S1、克隆，步骤S2、载体构建，步骤S3、烟草转基因，步骤S4、转基因烟草检测，步骤S5、转基因烟草观察，步骤S1：VvPPO1cDNA全长克隆，步骤S2：植物荧光表达载体的构建，步骤S3：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验，步骤S4：转基因烟草植株的获得及其PCR检测，步骤S5：转基因烟草的激光扫描共聚焦显微镜观察，所述步骤S2在构建时，将目的片段连接到载体pBI121(携带pENTER/D-TOPO)上，该载体不包含终止密码子TGA的C末端融合物。本发明通过使用本方法对葡萄果梗多酚氧化酶基因VvPPO1亚细胞定位检测，可以为今后进一步挖掘VvPPO1基因功能提供实验材料，解决了现有对多酚氧化酶的亚细胞定位研究不足的问题。研究不足的问题。
技术研发人员：吴忠红 吴斌 魏佳 杜鹃 郑素慧 阿塔吾拉
受保护的技术使用者：新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所
技术研发日：2022.02.11
技术公布日：2022/7/5
