1.本发明属于生物检测技术领域，涉及一种妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒。
背景技术：2.巨大儿是指出生体重达到或超过4000克的婴儿，是妊娠糖尿病(gdm，gestational diabetes mellitus)最常见的不良妊娠结局。最新统计显示，全球超过15％的活产儿在怀孕期间受到高血糖影响。近年来，随着我国生活水平的提高，体重超标或高龄的孕妇越来越多，gdm发病率逐年递增，使得gdm性巨大儿发病率也急剧升高，严重威胁母婴健康。gdm性巨大儿多属代谢不对称型，表现为全身脂肪量明显增多，而其他组织/脏器体积增大并不明显，不仅影响婴儿的生长发育，且大大增加儿童青少年期及成年后肥胖或糖尿病的发生风险。著名的dohad学说认为，生命最初1000天的营养和养育环境(如宫内高糖环境等)，对个体一生的健康影响至关重要。因此，早期诊断、早期干预、及时合理治疗，无论对临床控制gdm巨大儿发生，还是对减少母婴并发症、延缓gdm子代发展为肥胖或糖尿病，均具有十分重要的意义。
3.外泌体(exosomes)是细胞分泌成分中一类直径在30-150nm之间的囊性小泡，载有细胞内多种成分，是介导细胞间通讯的重要载体。分泌细胞在受到某种刺激后，分泌的外泌体可通过近分泌、膜融合、配体-受体结合、吞噬等各种方式进入受体细胞，释放所包裹的众多生物活性物质，如mrna、非编码rna(包括lncrna)、蛋白质等，影响受体细胞的生物学功能，进而参与各种生理病理过程。外泌体因受到双层膜结构的保护，其包裹的lncrna等内容物可免于核糖核酸酶的降解，从而能在外周血、脐血、羊水、乳汁、唾液等多种体液中广泛检测，可作为疾病发生发展良好的生物标志物。然而，目前尚未见外泌体lncrna作为巨大儿生物标志物的相关研究报道。
技术实现要素：4.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂在制备妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂中的应用。
5.本发明的另一目的是提供一种妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒。
6.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
7.检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂在制备妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂中的应用。lncrna ac015961.2序列如seq id no.1所示。
8.作为本发明的一种优选，所述的检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂为定量检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的实时荧光定量pcr检测试剂。
9.作为本发明的进一步优选，所述的检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂包含lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物。
10.作为本发明的更进一步优选，所述的lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物如seq id no.2和seq id no.3所示。
11.一种妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒，包含检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂。
12.作为本发明的一种优选，所述的试剂盒包含定量检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的实时荧光定量pcr检测试剂。
13.作为本发明的进一步优选，所述的试剂盒包含lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物。
14.作为本发明的更进一步优选，所述的试剂盒包含seq id no.2和seq id no.3所示的lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物。
15.作为本发明的进一步优选，所述的试剂盒包含：
16.(1)以从血清外泌体中分离纯化的总rna为模板，将lncrna ac015961.2逆转录为cdna的试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rna酶抑制剂、mmlv逆转录酶以及lncrna ac015961.2所用随机引物；
17.(2)将cdna实时定量pcr所用试剂，包括lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物、u6snrna内参特异性pcr引物、实时荧光定量sybr染料、无酶水。
18.有益效果：
19.申请人在gdm孕妇血清中分离外泌体提取总rna，通过荧光定量分析发现lncrna ac015961.2的表达在gdm巨大儿组和gdm非巨大儿组间存在明显的差异(p＝0.001)(图1)。此方法可以检测gdm孕妇中lncrna ac015961.2的表达水平，从而预测巨大儿的发生风险，筛查高危人群，并对gdm性巨大儿做出早期、快速的无创性诊断。本发明对gdm巨大儿早期诊断特异性好(图2)，特异性可达87.5％，灵敏度可达75.0％，只需在血清外泌体中提取rna即可检测lncrna ac015961.2的表达水平，操作简单，稳定性好。不仅可用于gdm巨大儿的早期诊断而且可以用于gdm孕妇的大规模筛查和巨大儿发生风险的预测，为gdm巨大儿的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，从而及时采取更具个性化的防治方案，最大限度的降低巨大儿的发生率，减少不良妊娠结局，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
20.图1为实时荧光定量pcr分析血清外泌体来源的lncrna ac015961.2在gdm巨大儿组和gdm非巨大儿组间的表达差异；
21.图2为roc分析血清外泌体来源的lncrna ac015961.2对gdm巨大儿辅助早期诊断的特异性和灵敏性。
具体实施方式
22.以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
23.实施例1样品的收集和样品资料的整理
24.申请人于2020年1月至12月从南京市妇幼保健院收集了大量的24-28孕周孕妇的外周血样品(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，申请人从中选择了80例符合下列标准的样本作为实验样品。
25.1.采血时为24-28孕周，经ogtt确诊为gdm的孕妇；
26.2.上述研究对象足月后所产新生儿体重超过4000g的孕妇定义为实验组(40例)；
27.3.上述研究对象足月后所产新生儿体重不超过4000g，与实验组年龄、bmi、孕周匹配的孕妇定义为对照(40例)，并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况；
28.4.采用血液促凝管，采集待测个体血液5ml。采血后1000rpm离心6min,吸取血清于ep管中-80℃保存。
29.实施例2血清中外泌体的分离、外泌体中rna的提取及纯化
30.1.血清中外泌体的分离：每个血清样本500ul中加入100ul的total exosome isolation reagent，涡旋混匀，4℃反应30min。室温下10000g离心10min。ep管底部存有外泌体，用200ui pbs重悬外泌体(选择己商品化的外泌体分离试剂盒)；
31.2.外泌体中rna的提取及纯化(选择己商品化的外泌体分离纯化rna试剂盒)：
32.2.1外泌体中rna的提取：加入200ul的2x denaturing solution混匀，冰上孵化5min，再加入400ul的acid-phenol:chloroform，涡旋60s。室温下12000g离心10min，上清中含有rna；
33.2.2rna的纯化：将300ul上清液吸取到无酶的ep管中，加入375ul的无水乙醇，两者混匀。将混合液加入过滤柱中，10000g离心15s，将收集管中的混合液倒掉。加入700ul的wash solution 1，室温下10000g离心15s，倒掉收集管中的混合液。加入500ul的wash solution 2/3，室温下10000g离心15s，重复此步骤。将过滤柱放进收集管中10000g离心1min。将过滤柱放入新的收集管中加入35ul的elution solution，室温下10000g离心30s，即可得到纯化的rna。
34.实施例3采用逆转录及实时定量的方法检测lncrna ac015961.2
35.1.制备lncrna ac015961.2用于gdm巨大儿高危孕妇的筛查或早期诊断的试剂盒(50次反应)，试剂盒包括：
36.1.1无酶水10ml
37.1.2随机逆转录引物(1um)50ul
38.1.3 5x逆转录缓冲液200ul
39.1.4三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mm)100ul
40.1.5rna酶抑制剂(40m/ul)50ul
41.1.6mmlv逆转录酶(200m/ul)50ul
42.1.7sybr premix ex taq 500ul
43.1.8lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物(10um)30ul
44.正向引物为5
’‑
ctgcaagcaccaagaacgaaa-3’(seq id no.2)
45.负向引物为5
’‑
ggagaaaagtcccccatccg-3’(seq id no.3)
46.1.9u6snrna内参特异性pcr引物(10um)30ul
47.正向引物为5
’‑
attggaacgatacagagaagatt-3’(seq id no.4)
48.负向引物为5
’‑
ggaacgcttcacgaatttg-3’(seq id no.5)。
49.2.lncrna ac015961.2逆转录：
50.2.1逆转录反应第一步的体系包括随机逆转录引物(1um)1ul，rna样本2ug，无酶水加至12ul。逆转录第一步条件为60℃5min；
51.2.2逆转录反应第二步的体系包括5x逆转录缓冲液4ul，三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mm)2ul，rna酶抑制剂(40m/ul)1ul，mmlv逆转录酶(200m/ul)1ul，第一步pcr产物12ul。逆转录第二步条件为25℃5min，42℃60min，70℃5min。
52.3.实时定量pcr：先将逆转录产物稀释5倍，混匀。20ul反应体系如下：sybr premix ex taq 10ul，ac015961.2特异性引物(10um)0.5ul，cdna产物1ul，无酶水加至20ul。实时荧光定量pcr反应程序：95℃3min，40个循环(95℃10s，60℃30s)。
53.4.2
‑△△
ct
指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，u6作为内参基因，数据利用软件graphpad prism进行分析。分析发现：与对照组相比，40例gdm巨大儿孕妇血清外泌体中lncrna ac015961.2的表达明显上调(p《0.001)。同时，通过roc分析发现，血清外泌体中lncrna ac015961.2用于gdm巨大儿早期诊断的roc曲线下面积(area under roc curve，auc)可达0.816，特异性可达87.5％，灵敏度达到75.0％。因此血清外泌体来源的lncrna ac015961.2能较好地用于gdm巨大儿的早期诊断。
54.本发明检测方法只需500ul血清便可分离出足够外泌体用于lncrna ac015961.2的表达水平检测，说明该方法具有较好地操作性。
技术特征：1.检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂在制备妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂为定量检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的实时荧光定量pcr检测试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂包含lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物如seq id no.2和seq id no.3所示。5.一种妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒，其特征在于包含检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的试剂。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的试剂盒包含定量检测血清外泌体来源的lncrna ac015961.2的实时荧光定量pcr检测试剂。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的试剂盒包含lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的试剂盒包含seq id no.2和seq id no.3所示的lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的试剂盒包含：(1)以从血清外泌体中分离纯化的总rna为模板，将lncrna ac015961.2逆转录为cdna的试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rna酶抑制剂、mmlv逆转录酶以及lncrna ac015961.2所用随机引物；(2)将cdna实时定量pcr所用试剂，包括lncrna ac015961.2实时荧光定量pcr特异性引物、u6snrna内参特异性pcr引物、实时荧光定量sybr染料、无酶水。
技术总结本发明公开了一种妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒。一种妊娠糖尿病性巨大儿高危孕妇筛查或早期诊断试剂盒，其特征在于包含检测血清外泌体来源的LncRNA AC015961.2的试剂。本发明利用血清外泌体来源的LncRNA AC015961.2对妊娠糖尿病性巨大儿早期诊断的特异性可达87.5％，灵敏度达到75.0％。检测妊娠糖尿病孕妇血清外泌体中LncRNA AC015961.2的表达水平，能用于妊娠糖尿病性巨大儿辅助早期诊断，为临床医生准确预测巨大儿发生风险，及时采取更具个体化的防治方案提供支持，从而最大限度的减少不良妊娠结局。局。局。
技术研发人员：文娟 石中华 李景云 马洁桦 李欣 邰雯
受保护的技术使用者：南京市妇幼保健院
技术研发日：2022.02.11
技术公布日：2022/7/5
