1.本发明涉及兽药残留分析和免疫学技术领域，特别是涉及一种氟苯尼考和替米考星双联检测试纸及制备方法和应用。
背景技术：2.氟苯尼考(ffrfenicol，ff)又称氟甲砜霉素，是新一代氯霉素类动物专用抗生素，具有抗菌谱广、毒副作用小等特点，是农业部批准使用的动物专用抗菌药，被广泛应用于动物养殖业。尽管氟苯尼考毒性低于氯霉素，但由于不正确或超量的使用，势必造成氟苯尼考在畜禽水产品中的残留，特别是现已出现了对氟苯尼考耐药的菌株，而且氟苯尼考的用量呈上升的趋势，这对人类的身体健康造成了潜在的威胁。因此，研究其残留监控技术对保障人民身体健康和水产品食用安全具有重要意义。
3.大环内脂类抗生素作为一种广谱抗生素，根据分子结构中的碳内酯环可以将其分为12至16元大环内脂类抗菌药物，替米考星(tilmicosin，til)属于16元大环内酯类抗生素，是近年来新出现的一种由泰乐菌素经过合成得到的畜禽专用抗生素，主要用于治疗巴氏杆菌和牛的溶血性曼氏杆菌引起的感染。替米考星使用不当时，会引起畜禽呼吸急促，呕吐等不良反应，过量的使用，会出现致死现象，而且药物使用不当，会造成畜产品中出现兽药残留，进而对人体造成危害。
4.目前，检测氟苯尼考、替米考星残留量的方法主要是色谱分析法，如高效液相色谱法(hplc)、气相色谱-质谱法(gc-ms)，色谱分析法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常高，而且在目前的国家检测机构中大部分只有省级才配备有精密的分析仪器，因此需要建立一个从筛选到确证的检测体系。有关氟苯尼考、替米考星的残留确证方法已经相对完善，但可用于大批量样品初筛的检测方法研究较少，免疫学检测法尤其是胶体金检测试纸具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强、高通量等优点，适合高通量样品筛选，因此对于快速检测氟苯尼考和替米考星在动物饲料、土壤或可食性动物组织中的残留，胶体金检测试纸更具优势。
技术实现要素：5.本发明的目的是提供一种氟苯尼考和替米考星双联检测试纸及制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该试纸为能同步检测氟苯尼考和替米考星的胶体金免疫层析双联试纸，具有简便、快速、灵敏、准确等优点，可实现现场实时检测。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种抗氟苯尼考的单克隆抗体的制备方法，采用戊二醛法将抗氟苯尼考半抗原与载体蛋白bsa进行偶联，合成ff-bsa；再用所述ff-bsa免疫小鼠，得到抗氟苯尼考的单克隆抗体。
8.本发明还提供一种所述的制备方法制备的抗氟苯尼考单克隆抗体，所述抗氟苯尼
考单克隆抗体的重链可变区基因序列如seq id no：1所示，氨基酸序列如seq id no：2所示；轻链可变区基因序列如seq id no：3所示，氨基酸序列如seq id no：4所示。
9.本发明还提供一种抗替米考星的单克隆抗体的制备方法，采用琥珀酸酐法将替米考星半抗原与载体蛋白bsa进行偶联，合成til-bsa；再用所述til-bsa免疫小鼠，得到所述抗替米考星的单克隆抗体。
10.本发明还提供一种所述的制备方法制备的抗替米考星单克隆抗体，所述抗替米考星单克隆抗体的重链可变区基因序列如seq id no：5所示，氨基酸序列如seq id no：6所示；轻链可变区基因序列如seq id no：7所示，氨基酸序列如seq id no：8所示。
11.本发明还提供一种氟苯尼考和替米考星双联检测试纸，包括所述的抗氟苯尼考单克隆抗体和所述的抗替米考星的单克隆抗体。
12.优选的是，还包括：检测膜、结合垫、样品垫、吸水垫和支撑板，所述检测膜粘贴于所述支撑板中央，所述结合垫和所述样品垫依次粘贴于所述检测膜的样品端，所述吸水垫粘贴于所述检测膜另一端。
13.优选的是，所述结合垫上负载有所述抗氟苯尼考单克隆抗体和抗替米考星单克隆抗体。
14.本发明还提供一种所述的氟苯尼考和替米考星双联检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
15.步骤1：将所述的ff-bsa、所述的til-bsa和兔抗小鼠igg分别喷点于硝酸纤维素检测膜中央，形成检测线t1、检测线t2和质控线c印迹，制得检测膜；
16.步骤2：将抗氟苯尼考单克隆抗体和抗替米考星单克隆抗体两种金标抗体喷点于玻璃棉，制得结合垫；
17.步骤3：将检测膜粘贴于支撑板中央，然后将所述结合垫和样品垫依次粘贴于所述检测膜的样品端，各层间重叠1-2mm；再将吸水垫粘贴于所述检测膜的另一端，与所述检测膜重叠1-2mm，即得氟苯尼考和替米考星双联检测试纸。
18.优选的是，所述抗氟苯尼考单克隆抗体效价为1:2.048
×
106，ic
50
为1.08ng/ml；抗替米考星单克隆抗体效价为1：2.048
×
106，ic
50
为2.31ng/ml。
19.本发明还提供一种所述的氟苯尼考和替尼考星双联检测试纸在检测氟苯尼考和替米考星残留中的应用。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.(1)本发明在单克隆抗体制备时，采用氟苯尼考(ff)、替米考星(til)作为半抗原，分别通过戊二醛法和琥珀酸酐法，将ff和til分别与载体蛋白进行偶联，制备出ff-bsa人工完全抗原和til-bsa人工完全抗原。该免疫原ff-bsa、til-bsa免疫小鼠后得到的抗体具有较好的效价和半数抑制浓度，说明其具有更加良好的免疫原性。并且所得的两种单克隆抗体均具备高特异性、高亲和力和高敏感性的优点，为制备氟苯尼考、替米考星双联检测试纸奠定基础。
22.(2)本发明建立的胶体金免疫层析双联试纸，能同时检测氟苯尼考和替米考星，一次测定即可检出氟苯尼考和替米考星在动物饲料中含量或可食性动物组织中的残留，可以节省对样品的分析次数，具有更好的经济价值。
23.(3)与现有的高效液相色谱检测技术相比，本发明的胶体金免疫层析双联试纸具
有快速、特异、灵敏、准确、高通量，简便、成本低廉等优点。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为本发明氟苯尼考人工完全抗原(ff-bsa)合成原理示意图。
26.图2为本发明替米考星人工完全抗原(til-bsa)合成原理示意图。
27.图3为氟苯尼考人工完全抗原及替米考星人工完全抗原的sds-page鉴定结果；其中line m为标准蛋白marker；line 1为bsa；line2为ff-bsa；line 3为bsa；line4为til-bsa。
28.图4为本发明氟苯尼考和替米考星胶体金免疫层析双联检测试纸结构示意图；1-检测膜，2-结合垫，3-样品垫，4-吸水垫，5-支撑板。
29.图5为本发明的氟苯尼考和替米考星胶体金免疫层析双联检测试纸检测不同样品组合的判定结果示意图；
30.图6为本发明的氟苯尼考和替米考星胶体金免疫层析双联检测试纸检测结果；其中：1-t1、t2检测线和c质控线均显色为阴性结果；2-t1和c质控线显色，t2检测线不显色，为替米考星阳性，氟苯尼考阴性；3-t2和c质控线显色，t1检测线不显色，为氟苯尼考阳性，替米考星阴性；4-t1、t2检测线不显色，c质控线显色为氟苯尼考和替米考星双阳性结果；
31.图7为双联试纸与hplc法对比检测样品中的ff和til；a：ff的对比结果；b：til的比对结果。
具体实施方式
32.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
33.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
35.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
36.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
37.实施例1氟苯尼考和替米考星单克隆抗体的制备
38.1.1氟苯尼考和替米考星人工完全抗原的制备
39.(1)通过戊二醛法将氟苯尼考ff与载体蛋白bsa进行偶联，制备ff-bsa人工完全抗原，具体方法如下：
40.分别称取氟苯尼考72.5mg和无水碳酸钠31.2mg，溶于3ml双蒸水中，置于磁力搅拌器上，加热到50～60℃，搅拌至溶液澄清，得到完全水解的氟苯尼考，即氟苯尼考胺；在上述溶液中加入10mg bsa，搅拌均匀后，加入100μl戊二醛，室温搅拌过夜，最后将得到的混合物在4℃搅拌下用pbs透析3天，每天换液4次，即得到ff-bsa人工完全抗原，实验原理如图1所示。
41.(2)通过琥珀酸酐法将替米考星til与载体蛋白bsa进行偶联，制备til-bsa人工完全抗原，具体方法如下：
42.将0.87g替米考星溶于5ml无水丙酮中，再加入26mg 4-二甲氨基吡啶(dmap)，置于磁力搅拌器上，加热到50～60℃，慢慢加入0.24g琥铂酸酐，反应4h，得到替米考星琥珀酸酯，再加入10mg edc，室温搅拌30min，最后加入10mg bsa，室温搅拌4h后，将得到的混合物在4℃搅拌下用pbs透析3天，每天换液4次，即得到til-bsa人工完全抗原，实验原理如图2所示。
43.1.2动物免疫
44.将制备的免疫原ff-bsa(图3)分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原(其中ff-bsa与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂体积比均为1:1)。通过背部皮下多点注射的方法，用ff-bsa弗氏完全佐剂免疫原免疫3只6～8周龄的雌性balb/c小鼠(购自郑州大学医学院动物实验中心)，10(购自只；在首次免疫21天和42天后分别用ff-bsa弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量对balb/c小鼠进行加强免疫；细胞融合前3～4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的ff-bsa对balb/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是20进行超只。最后一次加强免疫后一周，分别对3只小鼠进行剪尾采血，然后通过间接elisa法和间接竞争elisa法分别对3只小鼠多抗血清的效价和敏感性进行测定。其中1号鼠的免疫效果最好，其效价可达到1:51200，半数抑制浓度ic
50
为15.6ng/ml(表1，表2)，因此，下一步选择1号鼠进行融合。
45.同样的方法利用制备的免疫原til-bsa(图3)进行动物免疫，经过4次免疫后采用间接elisa法和间接竞争elisa法分别对3只小鼠多抗血清的效价和敏感性进行测定。其中3号鼠的免疫效果最好，其效价可达到1:51200，半数抑制浓度ic
50
为7.81ng/ml(表1，表2)，因此，下一步选择3号鼠进行融合。
46.表1小鼠多抗血清效价
[0047][0048]
表2小鼠多抗血清敏感性
[0049][0050]
1.3细胞融合和亚克隆
[0051]
抗ff杂交瘤细胞株的建立：对1号小鼠进行超强免疫后第3天，采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按细胞数量10:1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用hat选择培养基进行筛选，分装在铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃、5％co2培养箱内培养，10天后，以ff-ova(合成方法与ff-bsa相同)作为包被原，通过间接elisa法对长有杂交瘤细胞的孔进行阳性筛选，再通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，直到获得能稳定分泌抗ff单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为5f7)。抗til杂交瘤细胞株的建立：同样的方法，选择3号小鼠通过按照上述方法进行细胞融合、亚克隆，最终获得能稳定分泌抗til单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1d9)。
[0052]
1.4单抗腹水的制备及鉴定
[0053]
选择2只经产的雌性balb/c小鼠，腹腔内注射500腹腔灭菌石蜡。一周后，分别向2只小鼠腹腔内注射5f7和1d9杂交瘤细胞株，每只注射量为2
×
105个杂交瘤细胞。一周后，待小鼠腹部膨大后分别抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法分别对腹水中两种单抗进行纯化。
[0054]
分别通过间接elisa法和间接竞争elisa法对纯化后的两种单抗腹水的效价和敏感性进行测定，结果显示5f7单抗的效价可以达到1：2.048
×
106，ic
50
为1.08ng/ml(表3，表4)，其重链核苷酸序列如seq id no：1所示，氨基酸序列如seq id no：2所示；轻链核苷酸序列如seq id no：3所示，氨基酸序列如seq id no：4所示；1d9单抗的效价可以达到1：2.048
×
106，ic
50
为2.31ng/ml(表3，表4)，其重链核苷酸序列如seq id no：5所示，氨基酸序列如seq id no：6所示；轻链核苷酸序列如seq id no：7所示，氨基酸序列如seq id no：8所示。
亚型鉴定结果显示5f7单抗属于igg1，κ型；1d9单抗属于igg2b，κ型。
[0055]
5f7重链可变区基因序列(seq id no：1)为：
[0056]
tctgggggaggcttagtgaagcctggcgggtccctgaaactctcctgtgcagcctctttcgccactttcagtaactatgccatgtcttggattcgccagactccagagaagagggcggagtgggtcggatcccatagtagtgctggtacaacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagataatgccaggaacatcctgtacctgcaaatgagcggtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgtcagagacaggtacgacgaagctttggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca。
[0057]
5f7重链可变区氨基酸序列(seq id no：2)为：
[0058]
sggglvkpggslklscaasfatfsnyamswirqtpekraewvgshssagttyypdsvkgrftisrdnarnilylqmsglrsedtamyycvrdrydealdywgqgttvtvss。
[0059]
5f7轻链可变区基因序列(seq id no：3)为：
[0060]
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccagggcagaaagtcaccataacctgcagtgccagctcaagtgtaaattacatggaatggtaccagcagaagctaggatcctcccccaaagtctggatttatgacacatccaaactggctcctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgcctcttatttctgccatcagtggagtagttacccactcacgttcggtgcagggaccaagctggagctgaaac。
[0061]
5f7轻链可变区氨基酸序列(seq id no：4)为：
[0062]
qivltqspaimsaspgqkvtitcsasssvnymewyqqklgsspkvwiydtsklapgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaasyfchqwssypltfgagtklelk。
[0063]
1d9重链可变区基因序列(seq id no：5)为：
[0064]
gagtctgggggaggcttagtgaagcctggcgggtccctgaaactctcctgtgcagcctctactttcactttcagtaactatccaatgtcttggattcgccagactccagagaagaggctggagtgggtcgcatccattcacagttgtggtacaacctactatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagataatgccaggaacatcctgtacctgcaaatgagcggtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgtaagaccgaggtacgacgatgagttggaggactactggggtcaaggaacctcagtcaccg。
[0065]
1d9重链可变区氨基酸序列(seq id no：6)为：
[0066]
esggglvkpggslklscaastftfsnypmswirqtpekrlewvasihscgttyypdsvkgrftisrdnarnilylqmsglrsedtamyycvrpryddeledywgqgtsvt。
[0067]
1d9轻链可变区基因序列(seq id no：7)为：
[0068]
ctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccctgagctacagggccagcaaatctgtcagtacatccggctatacctatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcaccagattcgtgaatctacaaggtcggaggggggaccaagctggaaatcaaac。
[0069]
1d9轻链可变区氨基酸序列(seq id no：8)为：
[0070]
ltqspaslavslgqratlsyrasksvstsgytymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyychqirestrseggpswksn。
[0071]
表3mab的效价测定
[0072][0073][0074]
表4mab的抑制曲线测定
[0075][0076]
实施例2兔抗小鼠igg的制备
[0077]
以纯化小鼠igg免疫2.0kg左右健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射50健康新只，每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原肌肉注射，最后一次加强免疫2周后，以elisa测定免疫血清抗体
[0078]
效价高于1:40时，采集高免兔全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵法纯化兔抗小鼠igg。
[0079]
实施例3金标抗体的制备
[0080]
1.1胶体金的制备
[0081]
取100ml超纯水置于500ml洁净的锥形瓶，加入1ml 1％(w/v)氯金酸溶液煮沸；在搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1ml 1％(w/v)柠檬酸钠溶液，煮沸约3min至溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸2min；待溶液冷却至室温，补超纯水至100ml，以0.2mol/l k2co3调ph至9.0，4℃避光保存备用。
[0082]
1.2最适标记蛋白浓度测定
[0083]
分别取待标记抗ff、til单抗igg用20mmol/l硼酸钠溶液(ph8.0)4℃过夜透析。在微孔板中以25夜透超纯水1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等分别倍比稀释待标记ff、til单抗；各孔加入125各孔胶体金溶液，室温静置5min；加入1250μl 1mol/l nacl溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的单抗最高稀释度的蛋白浓度为胶体金最适标记浓度，胶体金标记时，蛋白浓度增加20％。
[0084]
1.3单克隆抗体的胶体金标记
[0085]
取2ml最适蛋白浓度的待标记单抗igg，加入10ml胶体金溶液(ph 9.0)，迅速混匀，室温作用10min～15min；加入混合液体积10％的含10％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)的20mmol/l硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10min～15min；4℃、15000g离心30min，小心移去上清；以含1％(w/v)bsa的20mmol/l硼酸钠溶液重悬沉淀，同上离心，弃上清；重复洗涤1次，
以1ml含1％(w/v)bsa的20mmol/l硼酸钠溶液重悬沉淀，4℃保存备用。
[0086]
实施例4试纸的研制
[0087]
1.1检测膜的制备
[0088]
将硝酸纤维素检测膜置于xyz 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用pbs缓冲液分别将til-bsa、ff-bsa人工抗原和兔抗鼠igg抗体稀释至1mg/ml，经0.22ml滤膜过滤后，以1膜过滤后，分别将til-bsa、ff-bsa人工抗原溶液(图3)和兔抗小鼠igg抗体溶液喷点于硝酸纤维素检测膜中央，形成检测线(t1线、t2线)和质控线(c线)印迹；检测线与检测线、检测线与质控线相距0.5cm；将检测膜置于42℃干燥箱30min或室温自然干燥后，于4℃干燥密闭保存。
[0089]
1.2结合垫的制备
[0090]
将玻璃棉置于xyz 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取ml金标抗体加入2ml含2％(w/v)bsa、3％(w/v)蔗糖、0.6mol/l nacl、0.2％tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的20mmol/l硼酸钠溶液(ph 8.0)；以15l/cm将金标抗体溶液喷点于玻璃棉；置于50℃干燥箱30min干燥；将结合垫置于塑料袋中，加干燥剂4℃密闭保存备用。
[0091]
1.3样品垫的制备
[0092]
以含0.1mol/l nacl、0.2％tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的pbs(ph 7.2)溶液浸泡玻璃棉条；置于50℃干燥箱30min干燥；将样品垫置于塑料袋中，加干燥剂室温密闭保存备用。
[0093]
1.4吸水垫的制备
[0094]
将吸水垫置于塑料袋中，加干燥剂室温密闭保存备用。
[0095]
1.5支撑板的制备
[0096]
将双面胶贴于pvc支撑板，制备支撑板。
[0097]
1.6试纸的组装
[0098]
利用lm5000试纸装配仪或手工将上述材料装配成试纸板。先将检测膜1粘贴于支撑板5中央，然后将两种含有金标抗体(抗ff金标抗体和抗til金标抗体)的结合垫2和样品垫3依次粘贴于检测膜1的样品端，各层间重叠1mm～2mm，再将吸水垫4粘贴于检测膜的另一端，与检测膜1重叠1mm～2mm(如图4)。
[0099]
氟苯尼考和替米考星双联检测试纸检测原理：
[0100]
氟苯尼考和替米考星双联检测试纸应用氟苯尼考和替米考星两种单克隆抗体，根据现代免疫学技术和层析技术设计组装，待测样品在层析过程中，样品中的氟苯尼考和替米考星分别与硝酸纤维素检测膜上的2条检测线(t1线和t2线)上的氟苯尼考-蛋白偶联物和替米考星-蛋白偶联物竞争各自的金标特异性单克隆抗体。以试纸上t1线和t2线的颜色变化与质控线(c线)比较判定样品中的氟苯尼考和替米考星含量(如图5)。
[0101]
实施例5检测方法
[0102]
1.1样品的预处理
[0103]
(1)禽蛋的预处理
[0104]
取待测禽蛋清5g加入10ml的乙酸乙酯，涡旋仪上涡旋振荡10min，3500rpm离心10min，取上清，用氮气吹干。最后用5ml pbs缓冲液(0.01m ph7.4)溶解残留物。
[0105]
(2)鸡肉、猪肉样品的预处理
[0106]
将待检组织样品匀浆后，取5g匀浆组织加入10ml的乙酸乙酯，涡旋仪上涡旋振荡10min，3500rpm离心10min，取上清，用氮气吹干。最后用5ml pbs缓冲液(0.01m ph7.4)溶解残留物。
[0107]
(3)鸡、猪饲料样品的预处理
[0108]
将待检饲料样品研磨成粉末后，取5g饲料粉末加入10ml的乙酸乙酯，涡旋仪上涡旋振荡10min，3500rpm离心10min，取上清，用氮气吹干。最后用5ml pbs缓冲液(0.01m ph7.4)溶解残留物。
[0109]
(4)土壤样品的预处理
[0110]
采集养殖场土壤样品，自然风干后压碎，捡出石子及动植物残渣，研碎后100目滤网将其筛滤，称取筛滤后的土壤5g加入10ml的乙酸乙酯，涡旋仪上涡旋振荡10min，3500rpm离心10min，取上清，用氮气吹干。最后用5ml pbs缓冲液(0.01m ph7.4)溶解残留物。
[0111]
1.2检测
[0112]
取待检样品100μl加入微孔板中，将胶体金免疫层析双联试纸样品端浸入待检样品溶液中10s～20s；取出试纸水平放置5min～10min观察结果。
[0113]
1.3结果判定
[0114]
如图2所示，试纸显现三条红棕色条带(t1、t2检测线和c质控线)为阴性，表示待检测组织中ff阴性，til阴性(ff-/til-)；
[0115]
仅显现一条红棕色条带(c质控线)为阳性，表示待检样品中同时含有ff和til残留(ff
+
/til
+
)；
[0116]
试纸显现两条红棕色条带(t2检测线和c质控线)，表示待检样品中ff阳性，til阴性(ff
+
/til-)；
[0117]
试纸显现两条红棕色条带(t1检测线和c质控线)，表示待检样品中ff阴性，til阳性(ff-/til
+
)；
[0118]
试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。
[0119]
从上述实验和结果可看出：该试纸适用的检测样品包括动物饲料、动物肌肉组织、土壤样品等，本发明涉及的样品处理方法简单，易操作，样品处理所用的主要有机试剂为乙酸乙酯，对操作者身体健康危害相对较小。并且利用该试纸进行检测，仅肉眼观察即可实现ff及til的半定量检测，借助biodot-tsr3000读条仪扫描试纸t线的灰度既可以实现定量检测。
[0120]
实施例6胶体金免疫层析双联试纸性能的测试
[0121]
1.1双联试纸特异性的鉴定
[0122]
选择有机胂类添加剂氟苯尼考、替米考星、氯霉素、强力霉素、泰妙菌素、甲氧苄啶、泰乐菌素标准品，用pbs将这7种标品分别稀释成10ng/ml的溶液，按照上述检测方法进行特异性鉴定。鉴定结果显示双联试纸只对氟苯尼考和替米考星特异性反应。
[0123]
1.2双联试纸灵敏度的鉴定
[0124]
用pbs将ff、til标准品分别稀释到浓度为0、1、2、3、4、5ng/ml，制备同时含ff/til 0/0、0/1、1/2、2/3、3/4、4/5ng/ml的溶液，然后用双联试纸检测，每个样品重复测定3次，10min内读取结果，观察能使t1线消失的ff的最小浓度，及使t2线消失的til的最小浓度为试纸的检测限，即灵敏度。
[0125]
结果显示双联试纸对ff的检测限为2ng/ml，对til的检测限为3ng/ml。
[0126]
1.3双联试纸稳定性检测
[0127]
由于试纸稳定性较好，常规情况下可储存1年以上，为了缩短试纸保质期的测定时间，本试验采用加速稳定试验来评价二联试纸的稳定性，选择45℃条件下保存试纸，试验基于阿伦尼乌斯公式推算出不同温度与加速试验天数的关系，45℃下保存37.5d相当于室温25℃下保存1年。所以本试验取同一批试纸于45℃条件下避光保存，分别在第0、10、20、30、40、50d取出试纸，用试纸分别检测50份阴性样品及50份含ff 2ng/ml及til 3ng/ml的阳性样品，观察试纸阴性样品t线显色情况及试纸出现的假阴率及假阳性率，从而判定试纸的保质期。
[0128]
如图6所示，从结果可以看出，试纸在45℃条件下40d内没有观察到假阳性及假阴性，t线显色正常，而45℃条件下保存到第50d后试纸显色变弱，说明试纸的稳定性变差，所以试纸对应的常温(25℃左右)下保质期应该定为1年，但应注意保存条件需要干燥避光。
[0129]
1.4双联试纸检测天然样品
[0130]
取经hplc检测过的10份禽蛋清样品、10份鸡肉组织样品、10份猪肉组织样品、10份鸡饲料样品、10份猪饲料样品、10份土壤样品(检测靶标为ff和til，且附有hplc检测结果)，同时用ff和til胶体金免疫层析双联试纸检测样品，且用试纸扫描仪扫描灰度，计算样品中ff和til的含量，每个样品重复测定3次求平均值。用每份样品中hplc法检测的浓度为横坐标，以试纸检测的浓度为纵坐标绘制散点图，生成回归曲线，以回归曲线的r2来评价两种检测方法得到的检测结果的相关性，从而评价试纸是否可以用于检测样品中ff和til的残留检测。
[0131]
结果显示：试纸检测的60份样品中20份样品呈现ff阳性(表5)，29份样品呈现til阳性(表6)。根据hplc结果绘制散点图(图7)。在检测样品中ff和til含量的hplc法与试纸法检测结果的r2分别为0.9742和0.9554，均大于0.9000，说明两种方法检测的结果的相关性较好，其对应的回归线斜率分别为0.9303及0.9312，结果均小于1，说明试纸检测方法所测得的结果要比hplc稍微偏低。综上所述，该双联试纸可以用于动物饲料、可食性动物组织或土壤样品中ff和til残留的快速检测，且结果准确可靠。
[0132]
表5试纸和hplc检测ff的符合率
[0133][0134][0135]
表6试纸和hplc检测til的符合率
[0136][0137]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术特征：1.一种抗氟苯尼考的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用戊二醛法将氟苯尼考半抗原与载体蛋白bsa进行偶联，合成ff-bsa；再用所述ff-bsa免疫小鼠，得到所述抗氟苯尼考的单克隆抗体。2.一种根据权利要求1所述的制备方法制备的抗氟苯尼考单克隆抗体，其特征在于，所述抗氟苯尼考单克隆抗体的重链可变区基因序列如seq id no：1所示，氨基酸序列如seq id no：2所示；轻链可变区基因序列如seq id no：3所示，氨基酸序列如seq id no：4所示。3.一种抗替米考星的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用琥珀酸酐法将替米考星半抗原与载体蛋白bsa进行偶联，合成til-bsa；再用所述til-bsa免疫小鼠，得到所述抗替米考星的单克隆抗体。4.一种根据权利要求3所述的制备方法制备的抗替米考星单克隆抗体，其特征在于，所述抗替米考星单克隆抗体的重链可变区基因序列如seq id no：5所示，氨基酸序列如seq id no：6所示；轻链可变区基因序列如seq id no：7所示，氨基酸序列如seq id no：8所示。5.一种氟苯尼考和替米考星双联检测试纸，其特征在于，包括权利要求2所述的抗氟苯尼考单克隆抗体和权利要求4所述的抗替米考星的单克隆抗体。6.根据权利要求5所述的氟苯尼考和替米考星双联检测试纸，其特征在于，还包括：检测膜、结合垫、样品垫、吸水垫和支撑板，所述检测膜粘贴于所述支撑板中央，所述结合垫和所述样品垫依次粘贴于所述检测膜的样品端，所述吸水垫粘贴于所述检测膜的另一端。7.根据权利要求6所述的氟苯尼考和替米考星双联检测试纸，其特征在于，所述结合垫上负载有所述抗氟苯尼考单克隆抗体和抗替米考星单克隆抗体。8.一种根据权利要求5-7任一项所述的氟苯尼考和替米考星双联检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将权利要求1中所述的ff-bsa、权利要求3中所述的til-bsa和兔抗小鼠igg分别喷点于硝酸纤维素检测膜中央，形成检测线t1、检测线t2和质控线c印迹，制得检测膜；步骤2：将抗氟苯尼考单克隆抗体和抗替米考星单克隆抗体两种金标抗体喷点于玻璃棉，制得结合垫；步骤3：将检测膜粘贴于支撑板中央，然后将所述结合垫和样品垫依次粘贴于所述检测膜的样品端，各层间重叠1-2mm；再将吸水垫粘贴于所述检测膜的另一端，与所述检测膜重叠1-2mm，即得所述氟苯尼考和替米考星双联检测试纸。9.根据权利要求8所述的氟苯尼考和替米考星双联检测试纸的制备方法，其特征在于，所述抗氟苯尼考单克隆抗体效价为1:2.048
×
106，ic
50
为1.08ng/ml；抗替米考星单克隆抗体效价为1：2.048
×
106，ic
50
为2.31ng/ml。10.一种如权利要求5-7任一项所述的氟苯尼考和替尼考星双联检测试纸在检测氟苯尼考和替米考星残留中的应用。
技术总结本发明公开了一种氟苯尼考和替米考星双联检测试纸及制备方法和应用，属于兽药残留分析和免疫学技术领域。该试纸包括抗氟苯尼考的单克隆抗体以及抗替米考星的单克隆抗体，能够同时检测氟苯尼考和替米考星。在单克隆抗体制备时，分别采用氟苯尼考、替米考星作为半抗原，与载体蛋白BSA的氨基进行偶联，制备氟苯尼考、替米考星人工完全抗原。所制备的人工完全抗原FF-BSA、TIL-BSA具有良好的免疫原性，免疫小鼠得到的两种单克隆单体均具备高特异性，高亲和力和高敏感性的优点，为制备氟苯尼考、替米考星双联检测试纸奠定基础。利用该试纸检测具有简便、快速、灵敏、准确、高通量等优点，可实现现场实时检测。场实时检测。场实时检测。
技术研发人员：王爱萍 张改平 王彦伟 牛艳 周景明 陈玉梅 王方雨 孙亚宁 梁超 朱习芳
受保护的技术使用者：河南百奥生物工程有限公司
技术研发日：2022.04.21
技术公布日：2022/7/5
