一种细胞外ezrin蛋白的应用
技术领域
1.本发明属于免疫抑制研究技术领域，具体涉及一种细胞外ezrin蛋白的应用。
背景技术：2.ezrin蛋白，被认为是一种膜与细胞骨架连接蛋白，其编码基因定位于染色体6q25.2-26，蛋白全长586个氨基酸，相对分子量81kd。由bretscher等人于1983年在鸡的小肠上皮细胞刷状缘内首次纯化出来。ezrin属于细胞内的erm家族。该家族成员的同源性高，是一个比较保守的家族。ezrin分子结构主要含3个部分：1、高度保守的氨基端ferm区，可与膜蛋白结合；2、α螺旋结构域连接区；3、羧基端为肌动蛋白结合区。ezrin在细胞内具有两种状态，作为单体存在时，其自身分子内的氨基端与羧基端结合在一起，使得其无法与肌动蛋白结合，此时为失活状态；当它被激活后(酪氨酸、丝/苏氨酸被磷酸化)，n端和c端结合位点被暴露出来，氨基端与膜蛋白结合，羧基端与肌动蛋白细胞骨架结合，发挥重要的桥梁作用，参与细胞骨架和细胞膜间的交互作用、信号传导、生长控制，对细胞形态、分化、运动和细胞与细胞、细胞与基质粘附都有重要调节作用。ezrin不仅能与膜蛋白、细胞黏附分子cd44、cd95、cd43、icam-1、icam-2和icam-3等结合，还能与胞浆内的蛋白actin、tublin、ebp50、e3karp、mbs、db1、pka和rhogdi等结合研究表明，ezrin在很多恶性肿瘤中(肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、鼻咽癌等)高表达。ezrin的高表达对于肿瘤的发生发展，尤其是肿瘤的转移中起到了关键性的作用。
3.迄今为止，大量对ezrin的研究都是集中在细胞内的功能研究，认为是连接细胞膜分子和细胞骨架之间的中介连接分子，从而调节参与各种生理功能。本发明在对支气管肺泡分泌蛋白样品(肺泡灌洗液)进行泛素化蛋白质组学鉴定研究时发现泛素化的ezrin存在于支气管肺泡分泌液中。由于支气管肺泡分泌液主要为分泌性蛋白，因此ezrin出现在支气管肺泡分泌液中，强烈提示ezrin可能是一种分泌蛋白。随后western blot也进一步证实了ezrin不仅大量存在于支气管肺泡分泌液中，而且在人母乳中也有丰富的表达。使用免疫组化对多种正常人体组织ezrin表达进行检测发现ezrin不仅在肺的支气管粘膜高表达而且在人体各种和外界相通的管腔粘膜高表达，如胃粘膜、肠道粘膜、胆囊粘膜、胎盘绒毛膜、子宫内膜等。有意思的是ezrin在粘膜细胞的表达分布具有极性，主要集中表达在各种管腔上皮细胞的顶端靠近管腔一侧。这一结果提示这些粘膜上皮细胞能够分泌ezrin，并且分泌的方向是向管腔外分泌。在体外细胞实验中，将重组的ezrin表达载体转染至293ft细胞中，48小时后可以在培养上清中检测到ezrin被释放到细胞外，随着时间的增加表达增强，96小时达到峰值。使用crispr/cas9技术敲除ezrin基因后，细胞内和培养上清中均无法检测出ezrin表达。同时，对细胞培养上清进行外泌体分离后，再对各组分进行检测，结果证实ezrin并不表达于外泌体中，而是集中表达于非外泌体组分中。以上结果充分说明了ezrin可以被细胞分泌到细胞外，形成分泌型ezrin。
4.对多种肺癌细胞株及正常细胞株的培养上清进行检测，结果显示分泌型ezrin在肺癌细胞株的上清中表达水平明显高于正常细胞株。对2例配对的非小细胞肺癌活检组织
及癌旁正常肺组织进行短期48小时原代培养，检测各样品培养上清中的ezrin分泌水平，可以发现癌组织培养上清中的分泌型ezrin明显高于癌旁正常组织的分泌水平。同样的免疫组化显示活检肺癌组织中癌细胞内的ezrin表达水平也明显提高。这些结果说明非小细胞肺癌在细胞内合成大量的ezrin并将ezrin分泌到肿瘤细胞外发挥生物学功能，肺癌细胞分泌ezrin的水平明显提高。
5.随后的研究发现细胞外分泌型ezrin具有很强的免疫抑制功能。因此，首先使用crispr/cas9技术敲除了肺癌细胞株hcc827中ezrin基因，使得细胞内和细胞外均无ezrin表达。体外增殖、侵袭实验及裸鼠成瘤实验均证实敲出ezrin后可以明显抑制肺癌细胞的增殖能力及侵袭能力。但是，使用纯化的重组分泌型ezrin蛋白处理ezrin缺失的肺癌细胞，恢复细胞外ezrin水平(不恢复细胞内ezrin)，并不能逆转恢复肺癌细胞的增殖能力。这说明细胞内ezrin可以抑制肿瘤细胞的增殖，而分泌型ezrin不影响细胞的增殖能力。将敲除ezrin的肺癌细胞和外周血白细胞共培养(transwell小室共培养，上室为白细胞，中间为基质胶，下室为肺癌细胞)，发现敲除ezrin后肺癌细胞可以明显提高对免疫细胞的招募能力，免疫细胞穿过基底膜向肿瘤细胞侵润的数量显著增加。进一步使用纯化的重组细胞外分泌型ezrin蛋白和细胞内ezrin分别处理外周血白细胞，发现细胞外分泌型ezrin可以明显抑制白细胞穿过基底膜的侵润能力，而细胞内表达的ezrin几乎不具有该项能力，对白细胞的侵润能力无影响。这一结果强烈提示：仅仅细胞外的分泌型ezrin具有很强的免疫抑制功能。使用可以特异性识别结合天然有活性分泌型ezrin蛋白的抗体，封闭肿瘤细胞分泌释放或人为加入的分泌型ezrin蛋白，可以明显促进白细胞的侵润。在小鼠体内实验中，对llc细胞成瘤小鼠进行抗体注射治疗(特异性识别结合天然有活性分泌型ezrin蛋白，clone a02)，可以明显抑制小鼠移植瘤的生长。以上充分说明可以有效识别天然有活性分泌型ezrin蛋白的抗体，可以解除分泌型ezrin蛋白对免疫细胞的抑制作用，从而发挥抗肿瘤的作用。
6.综上所述，细胞外分泌型ezrin蛋白是首次新发现的一种分泌蛋白，其本身具有免疫抑制功能，抑制或中和分泌型ezrin可以发挥免疫激活功能。因此，细胞外分泌型ezrin蛋白在免疫调节方面具有重要意义。
技术实现要素：7.本发明的首要目的是提供一种细胞外ezrin蛋白。
8.该蛋白是由细胞分泌到细胞外的蛋白，氨基酸序列包括:如seq id no.1所示，以及与seq id no.1所示序列相似度达到82％以上的序列中的至少一种。
9.进一步地包括：如seq id no.1所示，以及与seq id no.1所示序列相似度达到94％以上的序列中的至少一种。
10.进一步地包括如seq id no.1所示，以及与seq id no.1所示序列相似度达到96％以上的序列中的至少一种。
11.更进一步地包括：如seq id no.1所示，以及与seq id no.1所示序列相似度达到97％以上的序列中的至少一种。
12.最优选：如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示序列中的至少一种。
13.所述的细胞外ezrin蛋白，能够分泌到细胞外，具备免疫抑制的功能，进一步地，具有抑制白细胞的功能。
14.本发明在体液标本证实了分泌型ezrin大量存在于支气管肺泡分泌液和母乳中。构建的ezrin的真核表达载体转染至293ft细胞中，都能在培养上清中检测到ezrin被释放到细胞外。敲除293ft细胞ezrin基因后，细胞内和培养上清中均无法检测出ezrin表达。同时，ezrin可以被细胞分泌至细胞外，分泌方式并不依赖于外泌体途径。
15.本发明分析了ezrin在不同物种中的相似程度。ezrin的蛋白序列在很多物种中均存在，家兔(oryctolagus cuniculus)的ezrin蛋白序列和人类的ezrin蛋白序列同源性为94％(551/586)，即586个氨基酸分子中有551个完全一致；非洲爪蟾(xenopus tropicalis)的ezrin蛋白序列和人类的ezrin蛋白序列同源性为82％(482/586)，即有482个氨基酸分子一致；同样的和小鼠(mus musculus)相比ezrin蛋白序列同源性为97％(566/586)；和大鼠(rattus norvegicus)相比ezrin蛋白序列同源性为96％(565/586)；和牛(bos taurus)相比ezrin蛋白序列同源性为94％(553/586)。
16.进一步对人源分泌型ezrin蛋白ezrin(h)(seq id no.1)、兔源分泌型ezrin蛋白ezrin(o)(seq id no.2)、非洲爪蟾来源分泌型ezrin蛋白ezrin(x)(seq id no.3)、小鼠来源分泌型ezrin蛋白ezrin(m)(seq id no.4)、大鼠来源分泌型ezrin蛋白ezrin(r)(seq id no.5)、牛来源分泌型ezrin蛋白ezrin(b)(seq id no.6)进行白细胞侵润实验：使用5微米孔径的transwell小室，加入30微升bd matrigel基质胶(1:2稀释)，上室加入2
×
106人外周血白细胞，下室分别加入ezrin(h)、ezrin(o)、ezrin(x)、ezrin(m)、ezrin(r)、ezrin(b)，观察并测量侵润穿入下室中的白细胞的数量。发现家兔、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、牛来源的分泌型ezrin蛋白和人源的一样，同样可以明显抑制白细胞穿过基底膜的趋化运动能力。这说明不同来源序列相似的分泌型ezrin蛋白同样对人白细胞具有免疫抑制作用。
17.本发明的第二个目的是提供表达所述的细胞外ezrin蛋白的核酸序列。
18.本发明的第三个目的是提供所述的细胞外ezrin蛋白在制备免疫抑制剂中的用途，进一步地，是在制备抑制白细胞制剂中的用途，更进一步地，是在制备体外抑制白细胞制剂中的用途。
19.所述的免疫抑制涉及各种免疫过度激活相关的疾病，包括严重感染或炎性反应、休克、过敏性疾病、异体组织器官移植、风湿性疾病、各系统自身免疫疾病中的至少一种。
20.进一步地，各系统自身免疫疾病包括：甲状腺机能亢进、1型糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、多发性神经炎、溃疡性结肠炎、慢性肝病，肾小球肾炎、类风湿性关节炎，以及包括系统性红斑狼疮、硬皮病在内的多种皮肤病。
21.本发明的第四个目的是提供一种免疫抑制剂，包含所述的细胞外ezrin蛋白。
22.本发明的第五个目的是提供一种抑制白细胞制剂，包含所述的细胞外ezrin蛋白。
23.本发明将敲除ezrin的hcc827 f9细胞(不能分泌ezrin到细胞外)和未敲除的阴性对照hcc827细胞(可以分泌ezrin到细胞外)分别和外周血白细胞共培养(transwell小室共培养，上室为白细胞，中间铺基质胶，下室为肺癌细胞)，发现敲除ezrin后肺癌细胞可以明显提高对免疫细胞的招募趋化能力，免疫细胞穿过基底膜向肿瘤细胞聚集的数量显著增加。进一步在下室中加入纯化的重组分泌型ezrin蛋白，可以明显抑制白细胞穿过基底膜的趋化运动能力；而下室无分泌型ezrin组白细胞侵润穿过基质胶的细胞数目明显增多。这一
结果强烈提示：分泌型ezrin具有很强的免疫抑制功能。
24.进一步发现，使用重组分泌型ezrin蛋白(ezrin-extra)和重组细胞内ezrin蛋白(ezrin-intra)分别处理白细胞。分泌型ezrin蛋白(ezrin-extra)可以明显抑制白细胞穿过基底膜的趋化运动能力；而未使用分泌型ezrin组以及加入重组细胞内ezrin蛋白(ezrin-intra)组白细胞侵润穿过基质胶的细胞数目明显增多。两者相比具有统计学差异p《0.01。这说明，发挥免疫抑制功能的是分泌型ezrin而不是细胞内的ezrin蛋白，ezrin蛋白只有被分泌出细胞外才能发挥免疫抑制功能，而细胞破裂释放细胞内的ezrin蛋白并不具有免疫抑制活性。
25.免疫系统是维持机体平衡的重要环节。但是，在某些情况下过度激活的免疫反应会带来十分严重的后果，比如严重的炎症反应，休克，过敏反应，移植物的排斥反应和自身免疫反应。自身免疫反应最终损伤各种组织器官造成各系统自身免疫性疾病。而分泌型ezrin蛋白具有强有力的免疫抑制作用，因此可以发挥抗炎、抗过敏、抗休克、非特异性抑制免疫作用等多种作用，可以防止和阻止免疫性炎症反应和病理性免疫反应的发生，有效抑制过度激活的免疫反应。
26.本发明的第六个目的是提供所述的细胞外ezrin蛋白在制备免疫激活剂中的用途，进一步地，是在制备让胞外ezrin蛋白失去免疫抑制功能的试剂中的用途，更进一步地，是在制备与细胞外ezrin蛋白结合的抗体中的用途。
27.所述的免疫激活剂治疗的疾病包括肿瘤，肺癌、食管癌、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、鼻咽癌、脑胶质瘤、白血病、淋巴瘤、口腔癌、喉癌、舌癌、膀胱癌、肾癌、阴茎癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌中的至少一种。
28.本发明的第七个目的是提供一种免疫激活剂，包括让所述的细胞外ezrin蛋白失去免疫抑制功能的试剂，进一步包括与细胞外ezrin蛋白结合的抗体。
29.所述的免疫激活剂治疗的疾病包括肿瘤，肺癌、食管癌、骨肉瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、鼻咽癌、脑胶质瘤、白血病、淋巴瘤、口腔癌、喉癌、舌癌、膀胱癌、肾癌、阴茎癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌中的至少一种。
30.本发明的第八个目的是提供一种能让所述的细胞外ezrin蛋白失去免疫抑制功能的试剂。
31.本发明的第九个目的是提供一种能结合所述的细胞外ezrin蛋白的抗体。
32.本发明制备的clone a02单克隆抗体可以有效识别天然有活性分泌型ezrin蛋白，而对比使用商品化的识别细胞内胞浆ezrin单克隆抗体ep924y(abcam公司)，该抗体不能有效识别天然有活性分泌型ezrin蛋白，而只能识别变性后的ezrin蛋白。
33.本发明治疗免疫抑制疾病的制剂包括但不限于clone a02单克隆抗体，其他能特异性识别并结合胞外分泌的有活性的ezrin抗体均可，本发明仅仅是以clone a02单克隆抗体为例来证明抗体能够达到能结合ezrin的效果。
34.体外细胞实验，clone a02抗体可以有效封闭肿瘤细胞分泌释放的ezrin蛋白，明显促进白细胞的侵润。而ep924y抗体不能识别分泌型ezrin蛋白，不能促进白细胞的侵润。
35.最后在小鼠体内实验中也证实，对llc细胞成瘤小鼠进行clone a02抗体注射治疗，可以明显抑制小鼠移植瘤的生长。而ep924y抗体注射治疗小鼠和阴性对照组相比无差异。
36.以上充分说明，只有抑制细胞外分泌的分泌性ezrin蛋白的功能，才能真正起到治疗免疫抑制疾病的作用，而抑制的手段包括但不限于针对胞外分泌型ezrin蛋白设计的特异性抗体。上述识别细胞内胞浆ezrin单克隆抗体不能识别胞外分泌型ezrin蛋白的实验结果也进一步证实，胞外分泌型ezrin蛋白并不同于细胞内ezrin蛋白。
37.本发明第十个目的是提供大量表达所述的分泌型ezrin蛋白的悬浮细胞株。
38.进一步地，其构建方法包括以下方法的任一种：
39.方法一：
40.1)构建所述的ezrin蛋白基因的真核表达载体质粒；
41.2)将ezrin基因的真核表达载体质粒转染入贴壁细胞；
42.3)将贴壁细胞驯化成悬浮培养细胞；
43.方法二：
44.1)将贴壁细胞驯化成悬浮培养细胞；
45.2)构建所述的ezrin蛋白基因的真核表达载体质粒；
46.3)将ezrin基因的真核表达载体质粒转染入悬浮培养细胞。
47.之前的重组分泌型ezrin蛋白，都是基于贴壁细胞，取贴壁细胞的培养上清分离纯化，表达产量低。因此，本发明构建了稳定表达n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft细胞株；将贴壁细胞成功驯化成悬浮培养的细胞株；培养细胞密度可以达到6
×
106细胞/ml，活性可以达到90％以上。为方便下一步大规模纯化分泌型ezrin蛋白提供了保证。
48.贴壁细胞贴壁细胞是指贴壁生长的细胞，包括293细胞或cho细胞。肿瘤细胞的贴壁细胞也可以驯化。
49.目前，随着肿瘤的免疫抑制机制研究的深入，使得肿瘤的免疫治疗得到了极大的发展。由于肿瘤在发生发展的过程中进化出许多抑制免疫应答的机制，形成免疫抑制微环境，限制了肿瘤微环境中免疫细胞的活化和功能发挥，从而形成了免疫逃避。肿瘤免疫治疗主要是通过激活和增强人体的免疫系统达到消除肿瘤细胞的目的。近年来，免疫治疗在对黑色素瘤、肺癌等实体瘤的治疗中效果显著。因此，分泌型ezrin十分有希望成为一个新的肿瘤免疫治疗靶点，具有十分重要的科学理论意义和临床价值。
附图说明
50.图1：分泌型ezrin免疫抑制机制示意图。
51.图2：人母乳泛素化修饰蛋白质组学鉴定分析结果，a:ezrin 162位k泛素化修饰的肽段二级质谱图；b:质谱鉴定出丰度前5的泛素化位点肽段列表；c:鉴定得到的20个修饰蛋白亚细胞定位分类统计；d:泛素化肽段蛋白结构域(domain)功能富集分析；运用fisher's exact test得到的p值进行负对数(-log10)转换，转换后的值越大则此功能类型的富集越显著。
52.图3：泛素化蛋白质组学鉴定得到的137个泛素化修饰的蛋白进行go分析部分结果。
53.图4：泛素化蛋白质组学鉴定得到的137个泛素化修饰的蛋白进行kegg分析部分结果。
54.图5：ezrin新增5个泛素化位点(143k、209k、211k、344k、438k)肽指纹图。
55.图6：ezrin被泛素化修饰的结果。
56.图7：免疫组化检测ezrin在多种人体正常人体组织中的表达结果a:正常肺组织；b:支气管粘膜上皮的局部放大图；c:肺泡组织；d:食管粘膜上皮；e和f:胃粘膜上皮，f为e的局部放大图；g:肝；h:胰腺；i:胆囊上皮；j:小肠；k:胎盘绒毛；l:子宫内膜。
57.图8：ezrin不依赖于外泌体途径被分泌至细胞外的结果
58.a:收集人体支气管肺泡灌洗液，使用tca法沉淀分泌蛋白，western blot检测ezrin的表达；b:上图为使用pcdna-n-flag-ezrin(空白载体购自于invitrogen公司)表达载体瞬时转染至293ft细胞，收集24、48、72、96小时培养上清，使用anti-flag免疫磁珠(bimake b26101)进行免疫沉淀，western blot检测ezrin的表达；下图为使用piggybac转座系统构建c-flag-ezrin稳定表达细胞株(piggybac转座系统购自于sbi公司)，消化细胞种板后待细胞贴壁使用无血清opti-mem培养基培养，分别收集不同时间的上清，tca法沉淀分泌蛋白，western blot检测ezrin的表达；c:下图为使用crispr/cas9技术敲除293ft细胞ezrin基因后，挑选不同单克隆wb鉴定，ezr-2和3分别代表不同的两条sgrna序列；将阳性克隆f2、f3、d4的上清进行tca法沉淀，western blot检测ezrin的表达(上图)；nc为未敲除ezrin基因的细胞上清；d:收集293ft细胞上清，使用外泌体纯化试剂(invitrogen4478359)沉淀外泌体组分，沉淀后的上清使用tca法沉淀蛋白，两种组分电泳并western blot检测cd81和ezrin表达；cd81为外泌体标记蛋白，sp外泌体沉淀后的上清，sd外泌体沉淀。
59.图9：分泌型ezrin在非小细胞肺癌中高表达的结果
60.a:各种肺癌细胞株和正常支气管上皮细胞株beas-2b培养上清中ezrin的分泌情况，接种2
×
106个细胞至60mm培养皿，使用无血清opti-mem培养基培养48h，取2ml上清tca法沉淀蛋白western blot检测；b:对2例配对的非小细胞肺癌活检组织(c1、c2)及癌旁正常肺组织(n1、n2)进行短期48小时原代培养，wb检测各样品培养上清中的ezrin分泌水平；c:免疫组织化学检测ezrin在非小细胞肺癌活检组织中的表达。
61.图10：分泌型ezrin的真核表达纯化结果
62.a:对50毫升n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin稳定表达293ft细胞培养上清使用strep-tactin xt树脂进行亲和纯化，各组分电泳并使用western blot检测ezrin；1和2为1毫升和200微升培养上清使用tca沉淀后的input，3为10微升培养上清，4-7为10微升wash buffer，8-11为1-4次洗脱液，上样体积为2微升；b:取8微升洗脱液进行电泳后考马斯蓝染色。
63.图11：敲除ezrin明显抑制肺癌细胞的生长和侵袭的结果
64.a:crispr/cas9敲除肺癌细胞株hcc827中ezrin基因，使用western blot鉴定不同克隆的ezrin的蛋白表达；b:使用hcc827 nc对照细胞、ezr-1a11和ezr-3f9细胞，分别接种2000个细胞至96孔板进行共9天的细胞增殖cck8实验；c:平板克隆实验；d:裸鼠成瘤实验；e:基质胶侵袭实验。
65.图12：分泌型ezrin不能促进肺癌细胞的生长增殖的结果
66.a:cck8细胞增殖实验；b:平板克隆实验表明。
67.图13：分泌型ezrin显著抑制外周血白细胞尤其是t细胞的侵润迁移能力的结果
68.a:实验设计示意图；b:各个处理组培养48小时后，下室倒置显微镜图；c:各组下室细胞计数统计图。
69.图14：分泌型ezrin而不是细胞内ezrin显著抑制外周血白细胞侵润迁移能力的结
果
70.a：在293ft细胞中转染n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin构建稳定表达细胞株，真核表达n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin重组蛋白，使用strep-tactin xt树脂(iba)对细胞内的n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin进行亲和纯化，成功从细胞内纯化出细胞内ezrin蛋白(ezrin-intra)；b和c：将外周血白细胞加入transwell小室上室，中间铺基质胶，下室分别加入重组分泌型ezrin蛋白(ezrin-extra)和重组细胞内ezrin蛋白(ezrin-intra)，重组分泌型ezrin蛋白(ezrin-extra)可以明显抑制白细胞穿过基底膜的趋化运动能力；b为c的统计图。
71.图15：大量表达分泌型ezrin的悬浮细胞株的建立和鉴定
72.a：稳定表达c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft f2细胞株驯化成悬浮培养的细胞株，以大量表达纯化分泌型ezrin蛋白；b：取n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft细胞株和c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft f2细胞株悬浮培养上清1毫升，tca沉淀后，电泳，考马斯亮蓝染色；m：marker、1和2：n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft上清、3：c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft f2细胞上清；c：取n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft细胞株和c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft f2细胞株悬浮培养上清10微升，直接电泳，western-blot检测含有strep tag的重组分泌型ezrin蛋白；m：marker、1和2：n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft上清、3：c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft f2细胞上清。
73.图16：clone a02抗体有效识别天然有活性分泌型ezrin蛋白的结果。
74.图17：clone a02抗体有效促进免疫细胞侵润的结果。
75.图18：clone a02抗体在小鼠模型中显著抑制肿瘤生长的结果。
76.图19：不同种属分泌型ezrin对人白细胞免疫抑制效果。
具体实施方式：
77.以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
78.本发明实施例中使用的重组质粒如下：
79.1、pcdna-n-flag-ezrin：在pcdna3.1(+)质粒(购自invitrogen公司)中，ecorⅰ酶切位点和notⅰ酶切位点之间插入n-flag-ezrin基因序列。n-flag-ezrin为在ezrin序列的n末端加入了flag标签，以方便检测。此载体为真核表达载体。
80.2、pb510b-c-flag-ezrin：首先在pb510b质粒(购自于sbi公司)中，ecorⅰ酶切位点和notⅰ酶切位点之间插入flag标签序列，构建成pb510b-c-flag质粒；再在pb510b-c-flag质粒的xbaⅰ酶切位点和ecori酶切位点之间插入ezrin基因序列，构建成pb510b-c-flag-ezrin质粒。c-flag-ezrin为在ezrin序列的c末端加入了flag标签，以方便检测。pb510b质粒和转座酶质粒(pbt)构成piggybac转座系统(均购自于sbi公司)，可以高效将重组基因主动的整合至染色体中，构建成稳定表达细胞株。
81.3、pb510b-n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin：首先在pb510b质粒(购自于sbi公司)中，xbaⅰ酶切位点和ecorⅰ酶切位点之间插入twin-flag标签序列，构建成pb510b-n-twin-strepⅱ质粒；再在pb510b-n-twin-strepⅱ质粒的ecori酶切位点和notⅰ酶切位点之间插入ezrin基因序列，构建成pb510b-n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin质粒。n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin为在ezrin序列的n末端加入了twin-strepⅱ标签，twin-strepⅱ标签为两个strepⅱ标签串联，可以和strep-tactin xt蛋白(iba公司产品)发生高特异性的结合，用于目的蛋白的亲和纯化。
pb510b质粒和转座酶质粒(pbt)构成piggybac转座系统，可以高效将重组基因主动的整合至染色体中，构建成稳定表达细胞株。
82.4、pb510b-c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin：首先在pb510b质粒(购自于sbi公司)中，ecorⅰ酶切位点和notⅰ酶切位点之间插入twin-flag标签序列，构建成pb510b-c-twin-strepⅱ质粒；再在pb510b-c-twin-strepⅱ质粒的xbaⅰ酶切位点和ecorⅰ酶切位点之间插入ezrin基因序列，构建成pb510b-c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin质粒。c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin为在ezrin序列的c末端加入了twin-strepⅱ标签，twin-strepⅱ标签为两个strepⅱ标签串联，可以和strep-tactin xt蛋白(iba公司产品)发生高特异性的结合，用于目的蛋白的亲和纯化。pb510b质粒和转座酶质粒(pbt)构成piggybac转座系统，可以高效将重组基因主动的整合至染色体中，构建成稳定表达细胞株。
83.5、px459-ezrin-sgrna1：在pspcas9(bb)-2a-puro质粒中(又称为px459，购自addgene，48139)，bbsⅰ酶切位点中插入sgrna1序列：5
’‑
gcaatccagccaaatacaac-3’，seq id no.7。pspcas9(bb)-2a-puro为crispr/cas9系统质粒，在cas9蛋白和sgrna的作用下，可以对ezrin基因进行剪切敲除。ezrin-sgrna1为靶向ezrin基因的序列1。
84.6、px459-ezrin-sgrna2：在pspcas9(bb)-2a-puro质粒中(又称为px459，购自addgene，48139)，bbsⅰ酶切位点中插入sgrna2序列：5
’‑
ggtaaagactatcggcctcc-3’，seq id no.8。pspcas9(bb)-2a-puro为crispr/cas9系统质粒，在cas9蛋白和sgrna的作用下，可以对ezrin基因进行剪切敲除。ezrin-sgrna2为靶向ezrin基因的序列2。
85.7、px459-ezrin-sgrna3：在pspcas9(bb)-2a-puro质粒中(又称为px459，购自addgene，48139)，bbsⅰ酶切位点中插入sgrna3序列：5
’‑
gtactttggcctccactatg-3’，seq id no.9。pspcas9(bb)-2a-puro为crispr/cas9系统质粒，在cas9蛋白和sgrna的作用下，可以对ezrin基因进行剪切敲除。ezrin-sgrna3为靶向ezrin基因的序列3。
86.上述载体的构建方法如下：
87.构建pcdna-n-flag-ezrin载体
88.1、设计引物
89.上游引物：
[0090]5’‑
actgaattcgccaccatggactacaaggacgacgatgacaagatgccgaaaccaatcaa-3’seq id no.10
[0091]
下游引物：5
’‑
actgcggccgcttacagggcctcgaactc-3’，seq id no.11；
[0092]
2、pcr扩增构建50ulpcr反应体系，设置pcr仪相关参数，具体体系和参数如下：
[0093][0094]
94℃，2mins预变性94℃，15s变性55℃退火68℃，30s，35cycles延伸
[0095]
3、将pcr产物进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收目的片段，将目的片段进行酶切3小时胶回收。
[0096]
4、线性化pb510b质粒的制备：在37℃，将pb510b质粒使用ecorⅰ和notⅰ双酶切3小时，并再次进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收以回收酶切后的线性化pb510b质粒。
[0097][0098]
[0099]
5、使用t4 dna连接酶及其buffer将酶切后的目的片段与酶切后的线性化pb510b质粒进行4℃连接2天然后做转化.
[0100]
试剂用量ezrin片段6μlpb510b载体2μlt4 10xbuffer1ult4 dna1ul总计10ul
[0101]
6、将重组载体转化至超级感受态细菌大肠杆菌中。
[0102]
7、摇菌：无菌操作挑取单克隆细菌菌落，接种于lb液体培养基中，37℃，250rpm，摇菌过夜，挑取菌落送测序正确。
[0103]
8、按照omega质粒抽提试剂盒说明书进行细菌中重组质粒的提取pcdna-n-flag-ezrin。
[0104]
构建pb510b-c-flag-ezrin
[0105]
1、首先设计引物
[0106]
c-flag上游引物：5
’‑
aattcgactacaaggacgacgatgacaagtaagc-3’seq id no.12
[0107]
c-flag下游引物：5
’‑
ggccgcttacttgtcatcgtcgtccttgtagtcg-3’seq id no.13
[0108]
ezrin上游引物(xbaⅰ)：5
’‑
tgctctagaatgccgaaaccaatcaatgt-3’seq id no.14
[0109]
ezrin下游引物(ecorⅰ)：5
’‑
actgaattccagggcctcgaactcgtcga-3’seq id no.15
[0110]
2、先构建c-flag-pb510b载体再把ezrin片段插入c-flag-pb510b载体上构建c-flag退火片段10ul体系，具体如下
[0111][0112]
3、设置pcr仪37℃，反应30分钟，然后95℃，反应5分钟，随后室温冷却。
[0113]
4、上述产物作为母液，取1ul加入199ulddh2o配制成1:200稀释液，形成双链目的dna片段.
[0114]
5、目的片段与载体的连接
[0115]
6、按照t4 dna连接酶试剂盒说明书将上述准备好的线性化载体pb510b、目的片段、t4 dna连接酶及其缓冲液加到0.6ml的ep管中.。具体反应体系如下：
[0116]
试剂试剂c-flag退火片段2μlpb510b载体2μlt4 10xbuffer1ult4 dna1ulddh2o4ul总计10ul
[0117]
放置于4℃，充分反应2天将重组载体转化至超级感受态细菌大肠杆菌中，
[0118]
7、摇菌：无菌操作挑取单克隆细菌菌落，接种于lb液体培养基中，37℃，250rpm，摇菌过夜，挑取菌落送测序正确。
[0119]
8、按照omega质粒抽提试剂盒说明书进行细菌中重组质粒的提取c-flag-pb510b。
[0120]
9、pcr扩增ezrin片段构建50ulpcr反应体系，设置pcr仪相关参数，具体体系和参数如下：
[0121][0122]
94℃，2mins预变性94℃，15s变性55℃退火68℃，30s，35cycles延伸；
[0123]
10、.将pcr产物进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收。再将目的片段进行酶切3小时胶回收。
[0124]
11、线性c-flag-pb510b质粒的制备：在37℃，将c-flag-pb510b质粒使用xbaⅰ和
ecorⅰ双酶切3小时，并再次进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收酶切后的线性化c-flag-pb510b质粒。酶切体系如下
[0125][0126][0127]
12、使用t4 dna连接酶及其buffer将酶切后的目的片段与酶切后的线性化c-flag-pb510b质粒进行4℃连接2天然后做转化.
[0128][0129]
13、将重组载体转化至超级感受态细菌大肠杆菌中。
[0130]
14、摇菌：无菌操作挑取单克隆细菌菌落，接种于lb液体培养基中，37℃，250rpm，摇菌过夜，挑取菌落送测序正确。
[0131]
15、按照omega质粒抽提试剂盒说明书进行细菌中重组质粒的提取。
[0132]
构建pb510b-n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin
[0133]
1、首先设计引物
[0134]
twin-strepii tag序列：
[0135]5’‑
gccgaattcatggctagcgcatggagtcatcctcaattcgaaaaaggtggaggttctggcggtggatcgggaggttcagcgtggagccacccccagttcgagaag-3’seq id no.16
[0136]
n-twin-strepii-上游引物：5
’‑
acttctagaatggctagcgcatggagt-3’seq id no.17
[0137]
n-twin-strepii-下游引物：5
’‑
actgaattccttctcgaactgggggtg-3’seq id no.18
[0138]
ezrin上游引物(ecorⅰ)：5
’‑
actgaattcatgccgaaaccaatcaatgt-3’seq id no.19
[0139]
ezrin下游引物(notⅰ)：5
’‑
actgcggccgcttacagggcctcgaactc-3’seq id no.20
[0140]
2、先构建pb510b-n-twin-strepⅱ载体，再把ezrin片段插入
[0141]
3、pcr扩增n-twin-strepii，构建50ulpcr反应体系，设置pcr仪相关参数，具体体系和参数如下：
[0142][0143][0144]
94℃，2mins预变性94℃，15s变性55℃退火68℃，30s，35cycles延伸1.将pcr产物进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收，再将目的片段进行酶切3小时胶回收。
[0145]
4、线性化pb510b质粒的制备：在37℃，将pb510b质粒使用xbaⅰ和ecorⅰ双酶切3小时，并再次进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收以回收酶切后的线性化pb510b质粒。酶切体系如下
[0146]
试剂用量10xm5μlxbaⅰ2μlecorⅰ2ulddh2o33ulpb510b8(3ugdna)
总计50ul
[0147]
5、使用t4 dna连接酶及其buffer将酶切后的目的片段与酶切后的线性化pb510b质粒进行4℃连接2天然后做转化.
[0148][0149]
6、摇菌：无菌操作挑取单克隆细菌菌落，接种于lb液体培养基中，37℃，250rpm，摇菌过夜，挑取菌落送测序正确。
[0150]
7、按照omega质粒抽提试剂盒说明书进行细菌中重组质粒的提取pb510b-n-twinii。
[0151]
8、将pb510b-n-twin-strepii质粒使用ecorⅰ和notⅰ双酶切3小时，并再次进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收酶切后的线性化质粒。
[0152][0153]
9、使用t4 dna连接酶及其buffer将酶切后的目的片段与酶切后的线性化pb510b-n-twin-strepii粒进行4℃连接2天然后做转化。
[0154][0155]
10、摇菌：无菌操作挑取单克隆细菌菌落，接种于lb液体培养基中，37℃，250rpm，摇菌过夜，挑取菌落送测序正确。
[0156]
11、按照omega质粒抽提试剂盒说明书进行细菌中重组质粒的提取pb510b-n-twin-strepii-ezrin。
[0157]
构建pb510b-c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin
[0158]
1、首先设计引物
[0159]
c-twin-strepii-ecori-上游引物：
[0160]5’‑
actgaattcatggctagcgcatggagt-3’seq id no.21
[0161]
c-twin-strepii-noti
–
下游引物：
[0162]5’‑
actgcggccgctcacttctcgaactgggggtg-3’seq id no.22
[0163]
ezrin上游引物(xbaⅰ)：5
’‑
tgctctagaatgccgaaaccaatcaatgt-3’seq id no.23
[0164]
ezrin下游引物(ecorⅰ)：5
’‑
actgaattccagggcctcgaactcgtcga-3’seq id no.24
[0165]
2、先构建pb510b-c-twin-strepⅱ载体再把ezrin片段插入
[0166]
3、pcr扩增c-twin-strepii，构建50ulpcr反应体系，设置pcr仪相关参数，具体体系和参数如下：
[0167][0168][0169]
94℃，2mins预变性94℃，15s变性55℃退火68℃，30s，35cycles延伸
[0170]
4、将pcr产物进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收，再将目的片段进行酶切3小时胶回收。
[0171]
5、线性化pb510b质粒的制备：在37℃，将pb510b质粒使用ecorⅰ和notⅰ双酶切3小时，并再次进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收以回收酶切后的线性化pb510b质粒。
[0172]
试剂用量10xbsa buffer5μl10xh buffer5μlecorⅰ2ulnotⅰ2ulddh2o28ulpb510b8(3ugdna)总计50ul
[0173]
6、使用t4 dna连接酶及其buffer将酶切后的目的片段与酶切后的线性化pb510b质粒进行4℃连接2天然后做转化.
[0174][0175][0176]
7、将重组载体转化至超级感受态细菌大肠杆菌中。
[0177]
8、摇菌：无菌操作挑取单克隆细菌菌落，接种于lb液体培养基中，37℃，250rpm，摇菌过夜，挑取菌落送测序正确。
[0178]
9、按照omega质粒抽提试剂盒说明书进行细菌中重组质粒的提取c-twin-strep
ⅱ‑
pb510b。
[0179]
10、线性c-twin-strep
ⅱ‑
pb510b质粒的制备：在37℃，将c-twin-strep
ⅱ‑
pb510b质粒使用xbaⅰ和ecorⅰ双酶切3小时，并再次进行80v恒压电泳，电泳结束后进行胶回收酶切后的线性化c-flag-pb510b质粒。酶切体系如下
[0180][0181]
11、使用t4 dna连接酶及其buffer将酶切后的目的片段与酶切后的线性化c-twin-strep
ⅱ‑
pb510b质粒进行4℃连接2天然后做转化.
[0182][0183]
12、摇菌：无菌操作挑取单克隆细菌菌落，接种于lb液体培养基中，37℃，250rpm，摇菌过夜，挑取菌落送测序正确。
[0184]
13、按照omega质粒抽提试剂盒说明书进行细菌中重组质粒的提取pb510b-c-twinii-strep
ⅱ‑
ezrin。
[0185]
构建px459-ezrin-sgrna1 px459-ezrin-sgrna2 px459-ezrin-sgrna3
[0186]
1、设计sgrna
[0187]
sgrna oligos1：sense链：5
’‑
caccggcaatccagccaaatacaac-3'seq id no.25
[0188]
antisense链：5
’‑
aaacgttgtatttggctggattgcc-3’seq id no.26
[0189]
sgrna oligos2：
[0190]
sense链：5
’‑
caccgggtaaagactatcggcctcc-3'seq id no.27
[0191]
antisense链：5
’‑
aaacggaggccgatagtctttaccc-3’seq id no.28
[0192]
sgrna oligos3：
[0193]
sense链：5
’‑
caccggtactttggcctccactatg-3'seq id no.29
[0194]
antisense链：5
’‑
aaaccatagtggaggccaaagtacc-3’seq id no.30
[0195]
2、线性化质粒px459的制备
[0196]
(1)构建bbs1酶切px459质粒50ul
[0197][0198]
将上述体系分别加入到1.5ml的微型离心管中，放入37℃水浴箱，2小时水浴充分反应消化进行胶回收.
[0199]
3、分别构建3组sgrna-oligos退火片段10ul体系，具体如下：
[0200][0201]
设置pcr仪37℃，反应30分钟，然后95℃，反应5分钟，随后室温冷却。
[0202]
4、上述产物作为母液，取1ul加入199ulddh2o配制成1:200稀释液，形成双链目的dna片段，sgrna目的片段与载体的连接；
[0203]
(1)按照t4 dna连接酶试剂盒说明书将上述准备好的线性化载体px459、sgrna目的片段、t4 dna连接酶及其缓冲液加到0.6ml的ep管中.。
[0204]
sgrna片段2μlpx459载体2μlt4 10xbuffer1ult4 dna1ulddh2o4ul总计10ul
[0205]
将上述3管ep管放置于4℃，充分反应2天，得到具有sgrna和cas9功能的完整环状重组质粒。
[0206]
5、重组质粒的测序鉴定。
[0207]
实施例1：分泌型ezrin的发现及鉴定
[0208]
前期收集人母乳标本，通过高效率泛素化修饰抗体对标本中的泛素化修饰蛋白进行富集，随后使用高分辨率液相色谱-质谱联用的定性蛋白质组学研究策略，对人母乳进行了泛素化蛋白质组学定性研究。一共鉴定到位于20个蛋白上的35个泛素化位点。其中一些蛋白鉴定到有多个泛素化位点。ezrin的162位k被质谱鉴定出泛素化修饰(图2a)，质谱鉴定出丰度前5的泛素化位点肽段列表(图2b)；同时ezrin所属的erm家族另一成员radixin的162为k也被鉴定出泛素化修饰。erm家族主要包括ezrin、radixin、moesion三个成员；家族成员的同源性高(70％)，是一个比较保守的家族。由于人母乳主要为分泌性蛋白，而ezrin蛋白出现在人母乳中，强烈提示ezrin蛋白可能是一种分泌蛋白。
[0209]
对于鉴定到的20个修饰蛋白进行了亚细胞结构定位分类统计，其中只有2个蛋白
(10％)被认为是位于细胞外的分泌蛋白，其余90％都不是经典的分泌蛋白(图2c)。这提示泛素化修饰可能是一种新的特殊的蛋白分泌途径。
[0210]
对于鉴定到所有含有修饰位点蛋白的注释，进行了蛋白结构域(domain)功能富集分析，检测修饰蛋白是否在某些功能类型有显著性的富集趋势。发现ezrin家族的ferm结构域具有十分明显的富集。这说明ferm结构域可能在泛素化修饰分泌蛋白中具有重要作用(图2d)。
[0211]
实施例2：支气管肺泡分泌液泛素化蛋白质组学筛选和鉴定
[0212]
收集临床人体支气管肺泡分泌液标本(肺泡灌洗液)，通过高效率泛素化修饰抗体对标本中的泛素化修饰蛋白进行富集，随后使用高分辨率液相色谱-质谱联用的定性蛋白质组学研究策略，对支气管肺泡分泌液进行了泛素化蛋白质组学定性研究。收集了7位病人的支气管肺泡分泌液标本混合成一个样品，进行了泛素化蛋白质组学定性研究。从支气管肺泡分泌液标本中共鉴定出137个泛素化修饰的蛋白，共234个泛素化位点。对本次泛素化蛋白质组学鉴定得到的137个泛素化修饰的蛋白进行go分析，结果表明这些蛋白和免疫密切相关，多条和免疫相关的通路被富集到：1、immune response-activating cell surface receptor signaling pathway，2、innate immune response-activating signal transduction，3、activation of innate immune response(图3)。kegg分析也表明这些蛋白和免疫密切相关，参与白细胞的迁移和微生物的感染，共富集到25条功能通路，其中8条和免疫及感染相关：1、kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection，2、leukocyte transendothelial migration，3、pathogenic escherichia coli infection，4、epstein-barr virus infection，5、human immunodeficiency virus 1infection，6、epithelial cell signaling in helicobacter pylori infection，7、bacterial invasion of epithelial cells，8、b cell receptor signaling pathway(图4)。其中ezrin依然被鉴定出来，并且鉴定出新增5个泛素化位点：143k、209k、211k、344k、438k(图5)。
[0213]
实施例3证实分泌型ezrin被泛素化修饰
[0214]
为了证实分泌型ezrin是否发生了泛素化修饰。将2μgpb510b-n-twin-strepii-ezrin质粒瞬时转染到1.5
×
106个293ft(293ft细胞为人胚肾上皮细胞的一种)，使ezrin短时间内迅速表达分泌，分别培养24、48、72h后tca法提取全部细胞上清中的总蛋白，使用ezrin抗体(millipore公司兔多克隆抗体，07-130)检测其中的ezrin蛋白；再使用anti-flag免疫磁珠(bimake b26101)对ezrin重组蛋白进行免疫沉淀，泛素抗体检测泛素修饰蛋白，结果发现，上清中富含分泌型ezrin蛋白，这些ezrin被泛素化修饰，并且随着ezrin表达量的增加，泛素修饰程度随之增加(见图6)。
[0215]
实施例4分泌型ezrin在生理状态下的表达分布
[0216]
使用免疫组化对多种人体正常人体组织ezrin表达进行检测发现ezrin不仅在肺的支气管粘膜高表达而且在人体各种和外界相通的管腔粘膜高表达，如胃粘膜、肠道粘膜、胆囊粘膜、胎盘绒毛膜、子宫内膜等(图7)。并且ezrin在粘膜细胞的表达分布具有极性，主要集中表达在各种管腔上皮细胞的顶端靠近管腔一侧。这一结果提示这些粘膜上皮细胞能够分泌ezrin，并且分泌的方向是向管腔外分泌。
[0217]
图7a:正常肺组织，可见ezrin表达于支气管粘膜；b:支气管粘膜上皮的局部放大
图，ezrin在粘膜细胞的分泌具有极性，聚集在管腔侧的顶端；c:肺泡组织ezrin表达为阴性；d:食管粘膜上皮，弱表达；e和f:胃粘膜上皮，f为e的局部放大图，ezrin表达于壁细胞，并向管腔内分泌，箭头所示；g:肝，阴性；h:胰腺，弱表达；i:胆囊上皮，ezrin聚集在粘膜细胞的管腔侧的顶端，提示向管腔侧分泌；j:小肠，ezrin聚集在粘膜细胞的管腔侧的顶端，提示向管腔侧分泌；k:胎盘绒毛，ezrin聚集在粘膜细胞的管腔侧的顶端，提示向管腔侧分泌；l:子宫内膜，ezrin聚集在粘膜细胞的管腔侧的顶端，提示向管腔侧分泌，箭头所示。
[0218]
进一步收集人体支气管粘液、母乳体液标本，使用特异的抗体(millipore公司兔多克隆抗体，07-130)western blot检测证实了ezrin蛋白大量存在于支气管肺泡分泌液和母乳中(图8a)，验证了上述质谱筛选结果。
[0219]
实施例5体外细胞实验证实ezrin可以被细胞分泌
[0220]
在体液标本证实了分泌型ezrin大量存在于支气管肺泡分泌液和母乳中。为了进一步证实分泌型ezrin的存在，构建了ezrin的真核表达载体，将带有flag标签的ezrin表达载体(pcdna-n-flag-ezrin质粒用于瞬时转染、pb510b-c-flag-ezrin用于稳定转染建立细胞株)转染至293ft细胞中，无论是瞬时转染还是稳定转染，都能在培养上清中检测到ezrin被释放到细胞外，随着时间的增加表达增强，96小时达到峰值。使用crispr/cas9技术敲除293ft细胞ezrin基因后，细胞内和培养上清中均无法检测出ezrin表达。同时，对293ft细胞培养上清进行外泌体分离后，再对各组分进行检测，结果证实ezrin并不表达于外泌体中，而是集中表达于非外泌体组分中。这些结果说明，ezrin可以被细胞分泌至细胞外，分泌方式并不依赖于外泌体途径。具体如下：
[0221]
图8a:收集人体支气管肺泡灌洗液，使用tca法沉淀分泌蛋白，western blot检测ezrin的表达；p1、p2、p3代表三个不同的病人；收集母乳标本，使用孔径1μm的硅胶膜离心柱2000g离心去除脂肪颗粒，分别取2μl、5μl样品电泳，western blot检测ezrin的表达；m为marker；8b:上图为使用pcdna-n-flag-ezrin(空白载体购自于invitrogen公司)表达载体瞬时转染至293ft细胞，收集24、48、72、96小时培养上清，使用anti-flag免疫磁珠(bimake b26101)进行免疫沉淀，western blot检测ezrin的表达；下图为使用piggybac转座系统构建c-flag-ezrin稳定表达细胞株(piggybac转座系统购自于sbi公司)，消化细胞种板后待细胞贴壁使用无血清opti-mem培养基培养，分别收集不同时间的上清，tca法沉淀分泌蛋白，western blot检测ezrin的表达；8c:下图为使用crispr/cas9技术(px459-ezrin-sgrna2+px459-ezrin-sgrna3)敲除293ft细胞ezrin基因后，挑选不同单克隆wb鉴定，ezr-2和3分别代表不同的两条sgrna序列(前述的sgrna2和sgrna3)。
[0222]
将阳性克隆f2、f3、d4的上清进行tca法沉淀，western blot检测ezrin的表达(上图)；nc为未敲除ezrin基因的细胞上清；8d:收集293ft细胞上清，使用外泌体纯化试剂(invitrogen，4478359)沉淀外泌体组分，沉淀后的上清使用tca法沉淀蛋白，两种组分电泳并western blot检测cd81和ezrin表达；cd81为外泌体标记蛋白，sp外泌体沉淀后的上清，sd外泌体沉淀；ezrin在外泌体中表达极少，而在非外泌体组分中大量聚集。
[0223]
使用crispr/cas9技术敲除细胞ezrin基因步骤方法如下：
[0224]
1)将px459-ezrin-sgrna1、px459-ezrin-sgrna2、px459-ezrin-sgrna3质粒分别转染至目的细胞。
[0225]
2)转染后48小时，使用嘌呤霉素筛选24小时。
[0226]
3)将筛选后的细胞，挑单克隆在96孔板中培养。
[0227]
4)克隆细胞生长到足够数量后，进行敲除效果鉴定，挑选敲除效果好的克隆细胞株。
[0228]
实施例6分泌型ezrin在非小细胞肺癌中高表达
[0229]
对多种肺癌细胞株及正常细胞株的培养上清进行检测，接种2
×
106个细胞至60mm培养皿，使用无血清opti-mem培养基培养48h，取2ml上清tca法沉淀蛋白western blot检测；结果显示分泌型ezrin在h1299、h441、hcc827和h125中表达很高，在h520、h460、beas-2b(h1299、h441、hcc827、h125、h520、h460为人肺癌细胞，beas-2b人正常支气管上皮细胞。)中表达低，分泌型ezrin在大多数肺癌细胞株的上清中表达水平明显高于正常细胞株beas-2b(图9a)。对2例配对的非小细胞肺癌活检组织(c1、c2)及癌旁正常肺组织(n1、n2)进行短期48小时原代培养，检测各样品培养上清中的ezrin分泌水平，可以发现癌组织培养上清中的分泌型ezrin明显高于癌旁正常组织的分泌水平(图9b)。对34例肺癌活检标本使用ihc检测癌细胞内的ezrin表达水平，结果显示中/高表达的为28例占82.4％，低/无表达的为6例占17.4％，具有统计学差异p《0.01，ezrin在肺癌活检标本中高表达(图9c)。这些结果说明非小细胞肺癌在细胞内合成大量的ezrin并将ezrin分泌到肿瘤细胞外发挥生物学功能，肺癌细胞分泌ezrin的水平明显提高。
[0230]
实施例7分泌型ezrin的真核表达纯化
[0231]
为了研究分泌型ezrin的生物学功能，有活性的分泌型ezrin的纯化制备是必不可少的关键环节。使用piggybac转座系统构建n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin稳定表达293ft细胞株。在ezrin的n端加入了twin-strepⅱ标签用于下游亲和纯化实验。取稳定表达细胞的培养上清，使用strep-tactin xt树脂(iba)对n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin进行亲和纯化，成功得到纯化的分泌型ezrin重组蛋白(图10)。
[0232]
具体步骤如下：
[0233]
strep-tactin xt琼脂糖凝胶法纯化ezrin蛋白：strep-tactin xt琼脂糖凝胶ff主要用于纯化具有strep ii标签蛋白的蛋白，具有分子量较小(由八个氨基酸wshpqfek组成，分子量为1kda)的特点，一般不影响表达的融合蛋白结构与功能，另外strep-tactin xt琼脂糖对strep ii标签的亲和能力极强，能够在温和的条件下与strep ii融合蛋白结合和解离，因此用于融合蛋白的检测和纯化。twin-strepⅱ标签为两个strepⅱ标签串联，和strep-tactin xt蛋白结合的亲和力更强。
[0234]
1)培养表达pb510b-n-twin-strep ii-ezrin融合蛋白的293ft细胞。
[0235]
2)接种细胞，待细胞铺满100mm培养皿后，更换10％fbs 1640培养基补充至10ml，继续培养96小时，收集培养液。
[0236]
3)将培养液两次梯度离心以去除细胞碎片和杂质。
[0237]
4)将培养液加入150μg亲和素(invitrogen)/10ml，4℃孵育去除内源性生物素15分钟。
[0238]
5)将strep-tactin xt琼脂糖重力纯化柱使用2个柱体积(cv)的洗涤缓冲液(100mm tris/hcl,ph8.0,50mm nacl,1mm edta)平衡。
[0239]
6)将步骤4)中的培养液加入平衡好的strep-tactin xt琼脂糖重力纯化柱中，使培养液缓慢通过strep-tactin xt纯化柱。
[0240]
7)使用洗涤缓冲液对strep-tactin xt纯化柱进行清洗，共洗涤6次，每次一个柱体积(cv)。
[0241]
8)洗涤完成后，分别使用0.6cvs洗脱缓冲液(100mm tris-hcl,ph 8.0,150mm nacl,1mm edta,50mm biotin)进行洗脱得到洗脱组分1(e1)，再加入1.6cvs洗脱缓冲液得到洗脱组分2(e2)，最后加入0.8cvs洗脱缓冲液得到洗脱组分3(e3)。
[0242]
9)将产物elution1,2,3进行western blot检测，并冻至-80℃，即为纯化好的分泌型ezrin蛋白。
[0243]
实施例8敲除ezrin可以明显抑制肺癌细胞的生长和侵袭
[0244]
使用crispr/cas9技术(px459-ezrin-sgrna1和px459-ezrin-sgrna2)敲除肺癌细胞株hcc827中ezrin基因，通过筛选单克隆后，使用western blot检测各个克隆细胞内的ezrin的蛋白表达(图11a)。sgrna 1号序列的a11克隆和sgrna 3号序列的f9克隆为阳性克隆，成功挑选到了来自不同靶序列的两个克隆ezr-1a11和ezr-3f9。ezr-1a11和ezr-3f9克隆的ezrin蛋白表达完全缺失(图11a)。使用hcc827 nc对照细胞、ezr-1a11和ezr-3f9细胞，分别接种2000个细胞至96孔板进行共9天的细胞增殖cck8实验，ezr-1a11和ezr-3f9细胞和nc组比，细胞增殖明显减慢，p《0.01(图11b、c)。可见使用ezr-1a11和ezr-3f9克隆进行cck8实验和平板克隆实验表明ezrin表达缺失后可以在体外明显抑制肺癌细胞的生长。裸鼠成瘤实验，*为和hcc827nc对照组比肿瘤体积显著减小p《0.01；同样证实了缺失ezrin后可以明显抑制肺癌细胞在裸鼠体内的生长(图11d)。体外基质胶侵袭实验，*为和hcc827 nc对照组比，穿过基质胶的细胞数目显著减少，具有统计学意义p《0.01，也证实敲除ezrin后抑制肺癌细胞穿透基质胶的侵袭能力(图11e)。
[0245]
实施例9恢复细胞外ezrin水平，不能逆转恢复肺癌细胞的增殖能力
[0246]
在完全缺失ezrin表达的hcc827 ezr-3f9细胞中，使用纯化的分泌型ezrin蛋白处理细胞，以恢复细胞外ezrin水平(不恢复细胞内ezrin)，图12a:cck8细胞增殖实验，hcc827 ezr-3f9细胞使用或不使用分泌型ezrin蛋白处理，处理组和pbs处理组比无统计学差异；图12b:hcc827 ezr-3f9细胞使用或不使用分泌型ezrin蛋白处理，平板克隆实验表明ezrin处理组和pbs处理组比无明显差异。
[0247]
可见cck8细胞增殖实验和平板克隆实验均表明，单纯恢复细胞外ezrin的表达并不能逆转恢复肺癌细胞的增殖能力(图12)。这提示细胞内ezrin可以抑制肿瘤细胞的增殖，而分泌型ezrin并不影响肿瘤细胞自身的增殖能力。
[0248]
实施例10分泌型ezrin可以显著抑制外周血白细胞的侵润迁移能力
[0249]
将敲除ezrin的hcc827 f9细胞和未敲除的阴性对照hcc827细胞分别和外周血白细胞共培养(transwell小室共培养，上室为白细胞，中间铺基质胶，下室为肺癌细胞)(图13a上两图)；使用5微米孔径的transwell小室，加入30微升bd matrigel基质胶(1:2稀释)，上室加入2
×
106人外周血白细胞，下室分为细胞接种组和ezrin处理组；细胞接种组分别接种(接种量1
×
105)大量分泌ezrin的细胞hcc827(即图13a中的secrete ezr cells)、或ezrin敲除细胞hcc827 f9(即图13a中的ezr ko cells)；发现敲除ezrin后肺癌细胞可以明显提高对免疫细胞的招募趋化能力，免疫细胞穿过基底膜向肿瘤细胞聚集的数量显著增加(图13b)。使用细胞计数仪(z2 beckman coulter)精确计数各组下室白细胞数目分别为：hcc827组为870813.3
±
14706.3，hcc827 f9为1377466.7
±
45202.1，两者相比具有统计学
差异p《0.01(图13c)。进一步，将transwell小室共培养的下室使用纯化的分泌型ezrin处理(实验组每24h加入分泌型ezrin蛋白20ul，约1ug分泌型ezrin，体积是20微升)，而不加入任何细胞(上室为白细胞，中间铺基质胶，下室为仅为添加或不添加分泌型ezrin的培养基)(图13a下两图)。发现在下室中加入纯化的重组分泌型ezrin蛋白，可以明显抑制白细胞穿过基底膜的趋化运动能力；而下室无分泌型ezrin组白细胞侵润穿过基质胶的细胞数目明显增多(图13b)。分泌型ezrin处理组白细胞穿透数目为56226.7
±
1971.4，阴性对照组白细胞穿透数目为258546.7
±
2067.5，两者相比具有统计学差异p《0.01(图13c)。这一结果强烈提示：分泌型ezrin具有很强的免疫抑制功能。
[0250]
实施例11、分泌型ezrin而不是细胞内ezrin可以显著抑制外周血白细胞侵润迁移能力
[0251]
进一步，采用真核表达、亲和纯化法从细胞内纯化出细胞内ezrin蛋白(ezrin-intra)(图14a)。将外周血白细胞加入transwell小室上室，中间铺基质胶，下室分别加入重组分泌型ezrin蛋白(ezrin-extra)和重组细胞内ezrin蛋白(ezrin-intra)，重组分泌型ezrin蛋白(ezrin-extra)可以明显抑制白细胞穿过基底膜的趋化运动能力；而下室无分泌型ezrin组以及加入重组细胞内ezrin蛋白(ezrin-intra)组白细胞侵润穿过基质胶的细胞数目明显增多(图14b、c)。两者相比具有统计学差异p《0.01(图14b、c)。这说明，发挥免疫抑制功能的是分泌型ezrin而不是细胞内的ezrin蛋白，ezrin蛋白只有被分泌出细胞外才能发挥免疫抑制功能，而细胞破裂释放细胞内的ezrin蛋白并不具有免疫抑制活性。
[0252]
实施例12、建立表达分泌型ezrin的悬浮细胞株
[0253]
由于后续实验中需要用到大量的分泌型ezrin蛋白，并且制备封闭ezrin的单克隆抗体也需要针对分泌型ezrin蛋白天然构象表位，因此需要大量的表达纯化重组分泌型ezrin蛋白。而之前的重组分泌型ezrin蛋白，都是基于贴壁293ft细胞，取贴壁293ft细胞的培养上清分离纯化，表达产量低。为了解决此问题，构建了稳定表达n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft细胞株和c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin 293ft f2细胞株(f2细胞株是完全敲除内源性ezrin的293ft细胞，已排除内源性ezrin的干扰)，接下来将这两株贴壁细胞成功驯化成悬浮培养的细胞株(图15a)，培养细胞密度可以达到6
×
106细胞/ml，活性可以达到90％以上。进一步考马斯亮蓝染色(图15b)和western-blot(图15c)检测证实悬浮培养细胞真核表达分泌型ezrin蛋白大大增加了表达量，在10微升的培养上清中都能检测出极强的信号(贴壁培养法需要1毫升培养上清)(图15c)。为方便下一步大规模纯化分泌型ezrin蛋白提供了保证。
[0254]
具体如下：
[0255]
1)ezrin表达载体(pb510b-n-twin-strep
ⅱ‑
ezrin或pb510b-c-twin-strep
ⅱ‑
ezrin)的构建如前述
[0256]
2)质粒转染
[0257]
(1)培养293ft细胞或293ft f2细胞株(f2细胞株的构建见实施例5中的相关步骤)至对数期，细胞数目大约培养皿面积的70-90％，消化细胞。
[0258]
(2)设置细胞计数仪相关参数，测量细胞浓度。
[0259]
(3)按照3000试剂说明书要求，量取1.8
×
106个细胞总量，根据细胞密度，计算细胞悬液体积，接种到35mm细胞培养皿中。
[0260]
(4)稀释3000试剂：
[0261]
取1个1.5ml离心管加入培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
125ul
[0262]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3000
ꢀꢀꢀꢀꢀ
3.75ul
[0263]
(5)制备dna预混液，加入重组质粒，然后加入p3000
tm
试剂：
[0264][0265]
(6)将两个1.5ml离心管混合混匀，室温孵育5分钟。
[0266]
(7)将混合液加入到上述293ft细胞或者293ft f2细胞株的35mm细胞培养皿中，补充10％fbs dmem完全培养基至2ml。标记，放入37℃细胞培养箱中，次日加入含有嘌呤霉素的完全培养基2ml进行筛选。嘌呤霉素工作浓度为5ug/ml。筛选7天。
[0267]
3)贴壁细胞驯化成悬浮细胞
[0268]
(1)培养贴壁稳定建株293ft细胞或者293ft f2细胞株至对数期，细胞数目大约培养皿面积的70-90％，更换培养基为含有5％fbs的悬浮培养专用培养基smm 293-tii expression medium(购自义翘神州)。
[0269]
(2)使用此培养基贴壁培养2-3代，将细胞消化，离心更换为有2％fbs的悬浮培养专用培养基smm 293-tii expression medium。细胞密度调整为1
×
106，共计20毫升含细胞的培养液，至于250ml摇瓶。将摇瓶置于37℃，5％co2，150-175rpm转速的恒温摇床中培养。
[0270]
(3)根据细胞状态，每隔4-5天换液或传代，每次传代均将血清浓度降低为之前的一半。即开始为2％，逐渐降低为1％、0.5％、0.25％、0.125％、0。每次传代保留一半原培养基。当血清降低为0.125％后，下次换液直接更换成无血清的smm 293-tii expression medium。至此贴壁细胞驯化成悬浮细胞。
[0271]
实施例13制备单克隆抗体以及免疫治疗
[0272]
使用表达分泌型ezrin重组蛋白(携带twin-strepⅱ标签)的293ft悬浮细胞株大量表达带twin-strepⅱ标签的分泌型ezrin，收集培养上清，使用strep-tactin xt树脂进行亲和纯化，得到了足量的分泌型ezrin蛋白。
[0273]
将分泌型ezrin蛋白作为抗原免疫balb/c健康雌性小鼠，取脾脏，制备细胞悬液，将小鼠b细胞和骨髓瘤细胞混合，使用50％peg促使细胞融合，形成杂交瘤细胞。经过筛选鉴定，挑选到高特异性杂交瘤细胞株clone a02，并制备了单克隆抗体。
[0274]
将clone a02抗体、ep924y抗体(abcam)偶联至含有protein a的磁珠上，再分别和天然有活性分泌型ezrin蛋白孵育，进行免疫沉淀实验；12小时后，洗涤磁珠，电泳，进行western blot检测(图16)；input为5微升含有分泌型ezrin蛋白的培养上清，加入sds上样缓冲液变性后；ip为使用抗体免疫共沉淀实验泳道。
[0275]
可见clone a02抗体可以有效识别天然有活性分泌型ezrin蛋白，而对比使用商品化的识别细胞内胞浆ezrin单克隆抗体ep924y(abcam公司)，该抗体不能有效识别天然有活性分泌型ezrin蛋白，而只能识别变性后的ezrin蛋白。
[0276]
随后进行了体外细胞实验，使用5微米孔径的transwell小室，加入30微升bd matrigel基质胶(1:2稀释)，上室加入2
×
106人外周血白细胞，下室分为hcc827细胞接种组和分泌型ezrin处理组，分别在下室中加入clone a02抗体、ep924y抗体(abcam)进行中和；clone a02抗体可以有效封闭肿瘤细胞分泌释放的ezrin蛋白，明显促进白细胞的侵润；而ep924y抗体不能识别分泌型ezrin蛋白，不能促进白细胞的侵润。(图17)
[0277]
将llc细胞(小鼠肺癌细胞)(2
×
106)注射至c57小鼠背部皮下，7天后分别使用pbs、clone a02抗体、ep924y抗体对成瘤小鼠进行尾静脉注射，注射抗体剂量为100μg/只，每周注射一次；clone a02抗体注射治疗组，可以明显抑制小鼠移植瘤的生长；而ep924y抗体注射治疗小鼠和阴性对照组相比无差异。
[0278]
(图18)
[0279]
以上充分说明clone a02抗体可以有效识别天然有活性分泌型ezrin蛋白，解除分泌型ezrin蛋白对免疫细胞的抑制作用，从而发挥抗肿瘤的作用。
[0280]
实施例14
[0281]
不同种属分泌型ezrin对人白细胞免疫抑制效果功能分析
[0282]
为了研究分泌型ezrin同源相似序列是否也具有免疫抑制作用，分析了ezrin在不同物种中的相似程度。ezrin的蛋白序列在很多物种中均存在，家兔(oryctolagus cuniculus)的ezrin蛋白序列和人类的ezrin蛋白序列同源性为94％(551/586)，即586个氨基酸分子中有551个完全一致；非洲爪蟾(xenopus tropicalis)的ezrin蛋白序列和人类的ezrin蛋白序列同源性为82％(482/586)，即有482个氨基酸分子一致；同样的和小鼠(mus musculus)相比ezrin蛋白序列同源性为97％(566/586)；和大鼠(rattus norvegicus)相比ezrin蛋白序列同源性为96％(565/586)；和牛(bos taurus)相比ezrin蛋白序列同源性为94％(553/586)。
[0283]
2、合成了家兔、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、牛的ezrin基因序列，将其插入真核表达载体，并转染至293ft f2细胞中(293ft f2细胞为ezrin基因敲除细胞，293ft f2不表达人ezrin蛋白)，构建稳定表达这些不同种属ezrin蛋白的293ft f2细胞株。
[0284]
3、驯化悬浮培养两株293ft f2细胞株，收集培养上清，纯化家兔、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、牛来源的分泌型ezrin蛋白。
[0285]
4、对人源分泌型ezrin蛋白ezrin(h)、兔源分泌型ezrin蛋白ezrin(o)、非洲爪蟾来源分泌型ezrin蛋白ezrin(x)、小鼠来源分泌型ezrin蛋白ezrin(m)、大鼠来源分泌型ezrin蛋白ezrin(r)、牛来源分泌型ezrin蛋白ezrin(b)进行白细胞侵润实验：使用5微米孔径的transwell小室，加入30微升bd matrigel基质胶(1:2稀释)，上室加入2
×
106人外周血白细胞，下室分别加入ezrin(h)、ezrin(o)、ezrin(x)、ezrin(m)、ezrin(r)、ezrin(b)，观察并测量侵润穿入下室中的白细胞的数量。发现家兔、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、牛来源的分泌型ezrin蛋白和人源的一样，同样可以明显抑制白细胞穿过基底膜的趋化运动能力。这说明不同来源序列相似的分泌型ezrin蛋白同样对人白细胞具有免疫抑制作用。结果见图19。
技术特征：1.一种细胞外ezrin蛋白在制备免疫抑制剂中的应用，所述的细胞外ezrin蛋白是由细胞分泌到细胞外的蛋白，氨基酸序列包括:如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示序列中的至少一种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在制备抑制白细胞制剂中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在制备抑制白细胞浸润迁移制剂中的应用，所述的细胞外ezrin蛋白是由细胞分泌到细胞外的蛋白，氨基酸序列包括:如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示序列中的至少一种。4.一种识别细胞外ezrin蛋白的抗体在制备免疫激活剂中应用，所述的细胞外ezrin蛋白是由细胞分泌到细胞外的蛋白，氨基酸序列包括：如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示序列中的至少一种。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是在制备让胞外ezrin蛋白失去免疫抑制功能的试剂中的应用。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是在制备解除ezrin蛋白抑制白细胞浸润迁移能力的激活剂中的应用。7.一种识别细胞外ezrin蛋白的抗体在制备抗肿瘤制剂中的应用，所述的细胞外ezrin蛋白是由细胞分泌到细胞外的蛋白，氨基酸序列包括：如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示序列中的至少一种。
技术总结本发明公开了一种细胞外Ezrin蛋白的应用。本发明在支气管肺泡分泌液和母乳中首次发现分泌型Ezrin蛋白。随后在人体各种和外界相通的管腔粘膜中也发现该蛋白高表达，如胃粘膜、肠道粘膜、胆囊粘膜、胎盘绒毛膜、子宫内膜等。进一步实验发现细胞内Ezrin可以抑制肿瘤细胞的增殖，而分泌型Ezrin不影响细胞的增殖能力。分泌型Ezrin可以明显抑制白细胞穿过基底膜的侵润能力，而细胞内的Ezrin几乎不具有该项能力。这一结果表明细胞外的分泌型Ezrin具有很强的免疫抑制功能，进而有望成为治疗免疫相关疾病药物开发的新途径。疫相关疾病药物开发的新途径。疫相关疾病药物开发的新途径。
技术研发人员：王理 喻风雷 李嵬 胡琪康 刘文亮
受保护的技术使用者：中南大学湘雅二医院
技术研发日：2021.06.11
技术公布日：2022/7/5
