抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及单域抗体，尤其涉及抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区 (rbd)的单域抗体及其编码基因，本发明进一步涉及它们在检测新型冠状病毒感染或制备治疗新型冠状病毒所导致疾病药物中的应用，属于新型冠状病毒单域抗体及其应用领域。
背景技术：2.sars-cov-2是单股正链rna冠状病毒，其病毒粒子外胞脂质双层膜，膜表面有三种糖蛋白：1.刺突糖蛋白(s，spike protein，含有两个亚基(subunit)，即s1和s2，其中s1主要包含有受体结合区(receptor bindingdomain,rbd)，负责识别细胞的受体(angiotensin-converting enzyme2,aec2)；s2含有膜融合过程所需的基本元件)，s承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点；2.小包膜糖蛋白(e，envelope protein，与包膜结合的蛋白)； 3.膜糖蛋白(m，membrane protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。
3.sars-cov-2所导致的covid-19，截止到2021年9月30号，全球 covid-19发病总例数达2.34亿，死亡人数达478.42万，新冠病毒突变株(如delta)引起的covid-19疫情仍在世界许多地区爆发流行。虽然全球已有多款不同工艺和技术方法研究的新冠疫苗上市，对新冠疫情的防御起到一定的作用，但对新冠病毒突变株(如delta)引起的covid-19 疫情的预防作用大打折扣。目前对于新冠病毒突变株引起的covid-19疫情的预防和治疗仍然缺乏有效措施。
4.上世纪九十年代初，比利时自由大学免疫研究所所长raymondhamers教授领导的抗体研究组，在辅导医学院学生的实习实验研究中，发现了一种在骆驼血液中自然存在，功能全，仅有重链的抗体。经过后续深入研究，仅一个重链抗体的可变区，称为单域抗体(single domainantibody),由于其仅有2-5nm大小，又称纳米抗体(nanobody)。骆驼单域抗体片段(“纳米体”)正越来越多地用于各种应用。它们最显著的优点是体积小；一个纳米体的分子量约为15kda，即常规igg的十分之一。此外，由于结构上的差异，纳米体表现出很高的稳定性和溶解性，例如它们骨架区域的标志可溶性氨基酸，以及通过额外的半胱氨酸残基在互补决定区域之间的二硫键。单域抗体技术也已成熟，ablynx公司的抗急性血栓单域抗体药物已在欧美上市，还有多个药物在临床前和临床期研究。与普通抗体相比，单域抗体稳定性好、亲和力较高，克服了小分子功能抗体的缺点，同时又具有分子质量小免疫原性弱、组织穿透力强，可在酵母菌、大肠杆菌等微生物中大量表达，可进行大规模生产，易于普及和应用，相对价格低廉等单克隆抗体、多克隆抗体不具备的优点，适应用于检测、疾病治疗等方面。因此，研发新型冠状病毒单域抗体对于新型冠状病毒的检测或治疗等均具有重要的应用前景。
技术实现要素：5.本发明的目的之一是提供针对新型冠状病毒表面膜蛋白(s蛋白)受体结合区(rbd)的单域抗体及其编码基因；
6.本发明的目的之二是将所述的单域抗体与酶相、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物中的一种或多种相偶联得到缀合物；
7.本发明的目的之三将所述的单域抗体以及缀合物应用于制备检测新型冠状病毒的试剂或治疗新型冠状病毒的药物；
8.本方面的目的之四将所述的抗2019-新型冠状病毒s蛋白rbd的单域抗体应用于制备检测新型冠病毒delta变异株s蛋白rbd的试剂或制备治疗由新型冠病毒delta变异株所导致的疾病的药物。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
10.本发明首先提供了针对2019-新型冠状病毒表面膜蛋白的受体结合区的单域抗体，所述单域抗体为r4c11或r4g10，包括框架区和3个互补决定区，其中，所述单域抗体r4c11的3个互补决定区的氨基酸序列分别为seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示；所述单域抗体r4g10的3个互补决定区的氨基酸序列分别为seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10所示。
11.进一步优选的，所述单域抗体r4c11的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
12.(1)seqidno.1所示的氨基酸序列；
13.(2)将seqidno.1所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；
14.(3)与seqidno.1所示的氨基酸序列至少有80％以上同一性的氨基酸序列，优选的，与seqidno.1所示的氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列，更优选的，与seqidno.1所示的氨基酸序列至少有95％以上同一性的氨基酸序列。
15.所述单域抗体r4g10的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
16.(1)seqidno.6所示的氨基酸序列；
17.(2)将seqidno.6所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；
18.(3)与seqidno.6所示的氨基酸序列至少有80％以上同一性的氨基酸序列，优选的，与seqidno.6所示的氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列，更优选的，与seqidno.6所示的氨基酸序列至少有95％以上同一性的氨基酸序列。
19.本发明进一步提供了所述单域抗体的编码基因，其中，所述单域抗体r4c11编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
20.(1)seqidno.2所示的多核苷酸序列；或(2)与seqidno.2所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与seqidno.2所示的多核苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与seqidno.2所示的多核苷酸序列至少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与seqidno.2所示的多核苷酸序列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与seqidno.2所示的多核苷酸序列至少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与seqidno.2所示的多核苷酸序列有99％以上同一性的多核苷酸序列；
21.所述单域抗体r4g10的编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
22.(1)seq id no.7所示的多核苷酸序列；或(2)与seq id no.7所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与seq id no.7所示的多核苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与seq id no.7所示的多核苷酸序列至少有 80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与seq id no.7所示的多核苷酸序列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与seqid no.7所示的多核苷酸序列至少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与seq id no.7所示的多核苷酸序列有99％以上同一性的多核苷酸序列。
23.本发明进一步将所述的抗新型冠状病毒s蛋白rbd的单域抗体与 fc融合得到的fc融合蛋白；其中，所述fc基因序列可以是来源于igg，iga，igm的fc基因序列或来源于人igg1，igg2，igg3或igg4。
24.本发明更进一步将所述单域抗体与酶相(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物中的一种或多种相偶联得到缀合物，这些缀合物可用于检测新型冠状病毒或治疗新型冠状病毒导致的相关疾病。
25.本发明还提供了含有单域抗体的编码基因的表达载体、含有fc融合蛋白的编码基因的表达载体；所述的表达载体可以是原核表达载体、真核表达载体或其它的表达载体。
26.本发明还公开了含有所述表达载体的重组宿主细胞。其中，所述的宿主细胞为原核表达细胞、真核表达细胞，真菌细胞或酵母细胞，所述真核表达细胞优选cho细胞。
27.本发明提供的单域抗体可以结合不同新冠病毒突变株的rbd，这为预防和治疗不同新冠病毒突变株所致新冠感染疾病提供潜在的可行性。
28.由此，本发明进一步提供了抗新型冠状病毒s蛋白rbd的单域抗体、所述单域抗体的编码基因以及抗新型冠状病毒s蛋白rbd的单域抗体与 fc蛋白融合得到的fc融合蛋白、单域抗体与酶相、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物中的一种或多种相偶联得到缀合物在制备诊断 2019-新型冠状病毒试剂或或治疗新型冠状病毒药物中的应用，其中所述的2019-新冠状病毒优选是新型冠状病毒delta变异株。
29.本发明通过免疫羊驼构建噬菌体展示库，富集筛选得到针对新型冠状病毒rbd的单域抗体，其活性高、具有强的中和或结合能力，可以结合不同新冠病毒突变株的rbd，能应用于制备检测新型冠状病毒感染的试剂或制备治疗新型冠状病毒所导致的疾病药物。
30.本发明所涉及的术语定义
31.本文所用的术语“单域抗体(sdab)”是指包含了抗体中单个可变域的片段，也称为纳米抗体(nanobody)。和完整的抗体一样，它可以选择性的和特定抗原结合。与完整抗体的150－160kda的质量相比，单域抗体则显得小得多，大约只有12－15kda。第一个单域抗体是从骆驼的重链抗体中人造工程制作出来的，称为“vhh区段”。
32.术语“框架区(framework region)”，即骨架区，在免疫球蛋白的h和 l链的近n端约有110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区(v)和恒定区(c)。可变区内包含超变区hvr(hypervariable region)或称互补决定区 cdr(complementarity-determining region)与fr骨架区。
33.本文所用的术语序列的“同一性(identity)”可以与“相同性”互换使用，指的是序列之间通过序列比对软件例如blast确定的相似程度。序列比对的方法和软件对于本领域
技术人员是公知的。可以通过对已知序列进行一个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18或更多个)氨基酸或碱基的取代、缺失和/或添加而获得经改造的核苷酸序列。例如，通过常规手段(例如保守取代等)，对本发明的序列seq id no：1-198中一个或多个所示的氨基酸或核苷酸序列进行改造，可以获得与这些具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％的序列同一性，并且具有基本相同的性能，这都在本发明的保护范围之内。优选地，本发明通过保守取代获得序列同一性，但并不限于保守取代。
34.术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
35.术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照一个方向读取。氨基酸有100多种不同类型，其中 20种常用，本发明不排除氨基酸链上有其他物质，例如糖类、脂类等修饰，本发明也不限于20种常用的氨基酸。
36.术语“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”是指dna或rna中碱基的排列顺序，即在dna中为a、t、g、c的排列顺序，或者在mrna中a、 u、g、c的排列顺序，也包括rrna、trna、mrna中碱基的排列顺序。应该理解，本发明请求保护的抗体基因除了dna序列外，也涵盖 rna(rrna、trna、mrna)以及它们的互补序列。
37.本发明中所述的取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如ile、val、leu或ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如lys和arg、glu和asp、gln和asn之间的相互取代)等。因氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而成的突变体可以通过对编码野生型蛋白质的dna实施例如作为公知技术的定点诱变 (参见例如nucleic acid research，vol.10，no.20，p.6487-6500，1982，通过引用其全文引入本说明书)来制作。
38.术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(tijssen,techniquesin biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic probes, "overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays,1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点(tm)约5-10℃。tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、ph和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在ph 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0m钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选
择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5
×
ssc和1％sds，在42℃下培养；或5
×
ssc，1％sds，在65℃下培养，在0.2
×
ssc中洗涤和在65℃下于 0.1％sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
39.在本说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸，并非限定，但优选为20个以下、 15个以下、10个以下、或7个以下，更优选为5个以下。就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体dna互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，以上述合成寡核苷酸为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链dna 转化宿主细胞。将转化细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收dna。而且，在保持其活性的同时对酶等生物活性肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变源处理基因的方法，以及选择性地断开基因，然后删除、取代、插入或添加选定核苷酸，再进行连接的方法。
40.术语“表达载体(expression vectors)”是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、rbs、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。本发明包括但不限于原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或其它细胞表达载体。
41.术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
42.术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、 f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
附图说明
43.图1新冠状病毒rbd蛋白单域抗体的建库pcr产物核酸电泳图。
44.图2新冠状病毒rbd蛋白单域抗体的sds-page电泳图。
45.图3新冠状病毒rbd蛋白单域抗体稀释不同浓度和与新冠状病毒 rbd蛋白的elisa结果图。
46.图4新冠状病毒rbd蛋白单域抗体与新冠状病毒rbd蛋白竞争 hace2蛋白的elisa结果图。
47.图5新冠状病毒rbd蛋白单域抗体的bli亲和力测定结果图。
48.图6新冠状病毒rbd蛋白单域抗体的假病毒中和试验结果图。
49.图7新冠状病毒rbd蛋白单域抗体与新冠状病毒rbd蛋白和变异株 rbd蛋白的elisa结果图。
具体实施方式
50.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人
员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
51.实施例1噬菌体展示免疫羊驼单域抗体基因库的设计构建
52.(1)免疫羊驼：使用2019-cov的rbd蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司)分5次免疫羊驼，在第3次，4次，5次免疫后采血进行抗体效价测试，抗体效价达标后进行下一步。
53.(2)分离羊驼外周血淋巴细胞和提取纯化rna：采集免疫3次，4 次，5次的羊驼全血，分离羊驼外周血淋巴细胞，用rna抽提试剂盒 (qiagen)，从得到的淋巴细胞中提取总rna。
54.(3)巢式pcr方法获得羊驼重链抗体可变区-vhh：为提高扩增特异性，逆转录引物采用重链抗体的特异引物，合成cdna第一链，以此模板，分别用两套引物进行pcr扩增重链抗体vhh基因片段。采用巢式 pcr方法，第一次pcr扩增中大于800bp的为普通重链基因片段，在 800～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，切胶回收缺失轻链重链抗体基因片段，以此为模板用vhh特异性引物经pcr扩增得到vhh 目的基因(500bp)(图1)。
55.多样性引物的合成：
56.重链fd 5’引物:
57.ytl-1:ggtggtcctggctgcnctn；
58.ytch-2:ggg gta cct gtc atc cac gga cca gct ga；
59.轻链fd 3’引物:
60.ytvhh-f:
61.gatcgccggccagktgcagctcgtggagtcnggngg；
62.ytvhh-b:
63.catgtgtagattcctggccggcctggcctgaggagacggtgacc tgg；
64.(4)vhh片段和噬菌体展示载体分别用sfii(neb公司)酶切，按适当比例用t4连接酶(neb公司)进行连接反应，然后电转化tg1感受态。
65.(5)vhh抗体基因库的库容及多样性的鉴定和保存：根据转化后测定的滴度乘以转化的总量计算库容量。进行了10个电转化，库容量为1.2
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108；随机选出电转后做滴度测定的平板上生长的20个克隆，进行pcr 和测序鉴定，20个菌落pcr，全部阳性，扩增片段大小与插入的vhh大小相同；20个克隆测序结果显示没有重复vhh序列，该抗体基因库的库容量和多样性符合设计要求。
66.实施例2针对新冠状病毒rbd蛋白的单域抗体的筛选获得
67.(1)针对rbd特异性单域抗体的筛选
68.用2019-cov的rbd蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司)包被免疫管，用4％脱脂牛奶pbst封闭，加入上述的噬菌体库结合一定时间，经洗涤，去除非特异性结合噬菌体，用tea洗脱特异结合的噬菌体，然后扩增，进行2-3轮筛选。
69.表l亲和筛选对噬菌体抗体的富集效应
[0070][0071]
(2)elisa方法测定单个克隆培养上清，进行阳性克隆筛选
[0072]
方法一：从单个菌落生长分离较好的琼脂平板上随机挑取单个菌落，接种在含有amp的2yt液体培养基的96孔培养板(biofil公司)中培养过夜，离心，分离上清，以2019-conv的rbd蛋白为抗原进行噬菌体elisa测定，挑选出针对rbd蛋白的阳性孔克隆，经dna测序以鉴定针对rbd特异性单域抗体克隆的基因序列。
[0073]
方法二：从单个菌落生长分离较好的琼脂平板上随机挑取单个菌落，接种在含有amp的2yt液体培养基的96孔培养板中培养过夜，离心，分离上清，以人ace2蛋白(北京义翘神州科技股份有限公司)为抗原包被96孔elisa板(corning公司)，同时加入每个克隆的培养上清和2019-conv的rbd蛋白进行竞争性结合筛选，按照计算公式：(x＝克隆孔培养上清的od450值-空白孔od450值/(rbd蛋白双孔平均od450值-空白孔od450值)，抑制率＝(1-x)
×
100％，挑选抑制率大于60％以上的克隆，进行抗体克隆，表达纯化后，再进一步做竞争抑制试验。
[0074]
采用上述方法筛选得到两株阳性针对rbd特异性单域抗体，分别命名为pror4c11和pror4g10；
[0075]
其中，pror4c11的氨酸酸序列为seqidno.1所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.2所示，其3个互补决定区(pror4c11cdr1，pror4c11cdr2，pror4c11cdr3)的氨基酸序列分别seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示；
[0076]
pror4g10的氨酸酸序列为seqidno.6所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.7所示，其3个互补决定区(pror4g10cdr1，pror4g10cdr2，pror4g10cdr3)的氨基酸序列分别seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10所示。
[0077]
实施例3特异性单域抗体表达质粒的构建
[0078]
pcr分别扩增实施例3所获得的pror4c11和pror4g10特异性的单域抗体基因，获得带有限制性内切酶bbsi和bamhi位点pcr产物，用限制性内切酶bbsi和bamhi分别处理pcr产物和载体(psjf2载体)(kimis.biosicbiochem.2002,66(5):1148-51，中国专利zl201110280031)，经t4连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdab-psjf2，并进行基因序列测定以确定其序列的正确性。
[0079]
实施例4特异性rbd单域抗体的表达、纯化和鉴定
[0080]
(1)将实施例4所述的含有质粒sdab-psjf2的菌种接种在含氨基苄青霉素的lb培养板上，37℃过夜。(2)挑选单个菌落接种于20ml的含氨基苄青霉素的lb培养液中，37℃，摇床培养过夜。(3)转种于100ml含氨基苄青霉素的2yt培养液中，37℃摇床培养，220转/分，培养到od值达0.6～1.0时，加入0.1miptg，继续培养过夜。离心5000转/分钟，20分钟，收菌。(5)加入0.05mtris缓冲液洗2次菌体，用高渗蔗糖，提取细菌胞周质中表达的可溶性单
域抗体，离心收上清中可溶性单域抗体蛋白。(6)经ni+离子亲和层析磁珠(beaverbeadstm his-tag proteinpurification,苏州海狸生物医学工程有限公司)分离获得纯度达90％以上的单域抗体蛋白，结果见sds-page电泳图2，两个蛋白分子量约为15kd。
[0081]
纯化的特异性rbd单域抗体活性测定和竞争抑制率测定：
[0082]
活性测定：用1μg/ml rbd蛋白包被96孔elisa板，4℃过夜，用2％脱脂牛奶pbst，37℃封闭1-1.5小时，加入不同稀释浓度的纯化单域抗体，37℃，1小时，pbst洗板3次，加入1:3000倍稀释的鼠抗 c-myc-hrp二抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，37℃，1小时，pbst 洗板3次，加入tmb底物，室温10-15分钟，加入终止剂，测定od450 值，结果见图3。
[0083]
竞争抑制率测定：用2μg/ml ace2-his蛋白包被96孔elisa板，4℃，过夜，用2％脱脂牛奶pbst，37℃封闭1-1.5小时，加入不同稀释浓度的纯化单域抗体50微升/孔，同时加入rbd-fc蛋白4mg/ml，50微升/孔， 37℃，1小时，pbst洗板3次，加入1:3000倍稀释的兔抗鼠igg-hrp二抗(北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃，1小时，pbst洗板3次，加入tmb底物，室温10-15分钟，加入终止剂，测定od450值，计算竞争抑制率按公式计算：x＝(不同纯化单域稀释浓度+rbd蛋白的od450 平均值-空白孔od450平均值/(rbd蛋白平均od450值-空白孔od450 平均值)，抑制率＝(1-x)
×
100％，结果如图4所示，同浓度下r4c11 对ace抗原的竞争率为66.31％，r4g10对ace2抗原的竞争率为87.26％。
[0084]
实施例5特异性rbd单域抗体的亲和力常数检测
[0085]
用otectbli无标记分子互作仪测定单域抗体与rbd的亲和力常数，用 0.02％pbst预湿ahc传感器10min，将rbd-hfc重组蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)稀释浓度为50nm作为固化物，将抗体设置浓度梯度 1000nm,500nm,250nm，加入96孔板，使用0.02％pbst,和ph＝1.5的1m gly-hcl作为再生液，进行亲和力测试，特异性rbd单域抗体亲和力测试结果如图5和表2。
[0086]
表2 bli亲和力测定结果
[0087] kdkakdr4g108.243nm3.102
×
10-5
m-1
s-1
2.557
×
10-3
s-1
r4c113.544nm1.108
×
10-5
m-1
s-1
3.928
×
10-4
s-1
[0088]
试验例1假病毒中和试验
[0089]
采用水疱性口炎病毒(vsv)假病毒系统检测纳米体的中和活性。这些假病毒被限制在一轮复制中，从而使它们能够在bsl-2实验室中进行。简单地说，用pcaggs-sars-cov-2-spike
△
18(编码sars-cov-2穗突基因的质粒)转染293t细胞，在5％二氧化碳，37℃下培养24小时。取出培养基，加入vsv
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g-egfp感染细胞2小时后，然后用pbs(gibco)洗涤细胞3次。加入添加2％胎牛血清(gibco)的杜尔贝科改良鹰培养基 (dmem，gibco)，在37℃下培养24h。收集含有假病毒的上清液，用0.22
‑ꢀ
μm的过滤器进行过滤。通过感染veroe6细胞来检测病毒滴度。将4倍连续稀释的纳米体与假病毒混合，在37c下孵育1h。将混合物加入含有 veroe6细胞的96孔板中，在37c下孵育24h。用cls(perkinelmer)对平板进行成像，以获得荧光斑块。用harmo公司分析了其对假型sars-cov-2抗体的抑制作用，抑制作用结果如图6所示，r4c11的ic50 为45.39nm，r4g10的ic50为0.87nm。
[0090]
试验例2特异性rbd单域抗体对新冠病毒delta变异株s蛋白rbd的活性测定试验
[0091]
用1μg/ml rbd蛋白和1μg/ml delta rbd蛋白包被96孔elisa板，4℃过夜，用2％脱
脂牛奶pbst，37℃封闭1-1.5小时，加入纯化单域抗体， 37℃，1小时，pbst洗板3次，加入1:3000倍稀释的鼠抗c-myc-hrp二抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，37℃，1小时，pbst洗板3次，加入tmb底物，室温10-15分钟，加入终止剂，测定od
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值，野生型 rbd结果作为对照，变异株为实验组，试验结果如图7所示，相比对新冠病毒野生型rbd的结合效果，r4c11未对delta变异株rbd表现出结合力，而r4g10对野生型和delta变异株均表现出较高的结合效力。
