1.本发明属于生物医药领域，特别涉及二氢青蒿素在制备促进骨组织再生修复药物中的应用。
背景技术：2.在临床上，肿瘤、创伤、炎症等导致的骨骼缺损造成的功能丧失是影响患者生活质量的一个重要问题。尽管骨具有优异的先天再生能力，但大面积骨缺损的修复仍需借助外源性干预。传统的自体骨移植、异体骨移植存在二次损伤、免疫排斥和疾病传播等缺点，这些都限制了其临床应用。近些年来，骨组织工程修复成为一个新的研究热点，通过将支架材料植入缺损部位，为细胞提供仿生的组织微环境，从而实现修复组织缺损的目标。骨髓间充质细胞(bone marrow stem cells,bmscs)作为骨组织工程中重要的种子细胞，具备自我更新、多向分化潜能及免疫调节能力。然而，bmscs经过体外长期传代或体内衰老导致干性下降，表现为增殖及成骨向分化能力下降，成脂向分化倾向升高，最终损害其促骨再生修复的效果。因此，我们亟需找到有效的干预策略维持和促进bmscs的干性功能，从而提高其在骨组织工程中的应用效果。
3.目前，许多研究表明通过使用重组细胞因子、三维培养、低氧分压扩增等理化刺激的方式可以一定程度上维持bmscs的功能，但是这些方式存在价格昂贵、操作复杂等弊端，大大降低了实际临床转化应用的可行性。近年来，小分子化合物的应用在癌症、胚胎发育、组织再生领域逐渐兴起，其具备价格低廉、来源广泛、应用便捷等优点，因此备受广大研究者关注。
4.二氢青蒿素(dihydroartemisinin，dha)是分子量为284.3的一种小分子，在疟疾治疗方面表现出良好作用，并得到广泛应用。但是目前尚未有关于dha促进传代性衰老骨髓间充质干细胞干性功能的报道。
技术实现要素：5.发明目的：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了二氢青蒿素在制备促进骨组织再生修复药物中的应用。
6.技术方案：为达到上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供了二氢青蒿素在制备促进骨组织再生修复药物中的应用。
8.所述药物通过维持骨髓间充质干细胞干性功能，促进骨组织再生修复。
9.所述药物包含二氢青蒿素或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料。
10.本发明的第二方面，提供了一种促进骨组织再生修复的组合物，所述组合物中包含二氢青蒿素。
11.本发明的第三方面，提供了所述组合物在制备促进骨组织再生修复药物中的应
用。
12.所述药物包含二氢青蒿素或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料。
13.本发明的第四方面，提供了二氢青蒿素在骨髓间充质干细胞体外培养中的应用，所述二氢青蒿素能够维持长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞的干性功能。
14.本发明的第五方面，提供了一种能够维持长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞干性功能的培养基，所述培养基中含有二氢青蒿素。
15.本发明的第六方面，提供了一种能够维持长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞干性功能的体外培养方法，该方法包括采用含二氢青蒿素的培养基培养。
16.优选地，培养方法为：α-mem培养基中加入dha，置于5％co2浓度的37℃孵箱中培养，每隔2-3天更换新鲜培养基。
17.有益效果：本发明利用dha成功建立了骨髓间充质干细胞的体外的培养、大量扩增的方法，能够获得足够数量的骨髓间充质干细胞。经历长期传代扩增后，dha预处理的骨髓间充质干细胞的干性功能仍得以维持，表现为具备良好的增殖、自我更新能力及成骨分化能力，抑制成脂分化倾向，使得骨髓间充质干细胞更适合应用于体内骨组织再生修复。
附图说明
18.图1为cck8相对吸光度统计图，反映第三代bmscs在不同浓度dha处理0-7天后细胞的增殖情况。吸光度越高，细胞数量越多，即增殖能力越强；
19.图2为dha处理第三代bmscs在dha处理2天后细胞的干性基因sox2、oct4的表达情况。其中，a为rt-qpcr图，b为蛋白表达水平图及统计图；
20.图3为bmscs长期传代至第八代后，dha每代连续处理情况下bmscs干性基因sox2、oct4的表达情况。其中，a为rt-qpcr图，b为蛋白表达水平图及统计图；
21.图4为bmscs长期传代至第八代后，dha每代连续处理情况下bmscs增殖标记物ki67免疫荧光染色图(图中白色亮点代表ki67阳性细胞)，反映dha连续传代处理bmscs后细胞的增殖情况，右图为左图中阳性细胞比例统计图；
22.图5：a为bmscs长期传代至第八代后，dha每代连续处理后，在成骨诱导培养基情况下连续诱导7天后的碱性磷酸酶染色图，反映dha连续传代处理bmscs后细胞的体外成骨能力(图中着色较深区域为染色阳性区域)，右图为碱性磷酸酶活性半定量统计图；b为bmscs长期传代至第八代后，dha每代连续处理后，在成骨诱导培养基情况下连续诱导14天后的茜素红染色图，反映dha连续传代处理bmscs后细胞的体外成骨能力(图中着色较深区域为染色阳性区域)，右图为对应的钙结节阳性面积半定量统计图；
23.图6为bmscs长期传代至第八代后，dha每代连续处理后，在成脂诱导培养基情况下连续诱导21天后的油红o染色图，反映dha连续传代处理bmscs后细胞的体外成脂倾向(图中着色较深区域为染色阳性区域)，右图为对应的油红o阳性面积比例统计图；
24.图7为bmscs长期传代至第八代后，dha每代连续处理后，将bmscs负载于支架材料植入裸鼠皮下2个月的micro-ct影像图和组织学染色学，反映dha处理的bmscs的体内成骨能力。其中，a为2个月后的形成的异位组织的micro-ct扫面重建图(白色区域为矿化程度高区域)及对应的扫描区骨体积占总体积的比值，b为对应区域的he染色(块状深染区域为阳
性区域)。
具体实施方式
25.实施例1
26.为了验证dha对早期代数bmscs增殖能力的影响，我们通过cck8细胞增殖实验进行验证。
27.实验组中bmscs中加入浓度为0.1、1.0、10μm的dha溶液，对照组bmscs中加入等体积药物溶剂dmso，在相同条件下连续培养0-7天，分别在0、1、2、3、5、7天于细胞中加入cck8显色液孵育后，取显色液在450nm处测量吸光度以判断细胞数量。
28.结果显示：
29.dmso对照组cck8吸光度低、实验组吸光度高，dha浓度达1μm时实验组和对照组吸光度相比具有统计学意义，见图1；
30.结论：
31.通过cck8增殖实验证明，早期代数使用dha可以明显促进bmscs增殖能力。
32.实施例2
33.为了验证dha对早期代数bmscs自我更新能力的影响，我们通过rt-qpcr及western blot实验进行验证。
34.实验组中bmscs中加入浓度为1.0μm的dha溶液，对照组bmscs中加入等体积药物溶剂dmso，在相同条件下连续培养两天后，使用rt-qpcr及western blot实验检测bmscs细胞中干性相关蛋白sox2、oct4表达水平。
35.结果显示：
36.dmso对照组干性相关蛋白sox2、oct4表达水平较低，实验组经过dha干预后，干性相关蛋白sox2、oct4表达上升，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图2a及图2b；
37.结论：
38.通过dha处理的早期代数bmscs的rt-qpcr及western blot实验结果证明，dha促进体外培养的早期代数bmscs干性。
39.实施例3
40.为了验证dha在体外长期连续传代扩增中促进bmscs干性维持的作用，我们通过rt-qpcr、western blot实验进行证明。
41.对照组和实验组bmscs每代汇合至70-80％后经过胰酶消化后置于新的培养皿当中继续培养，如此反复连续传代，从第三代扩增至第八代，期间实验组中bmscs中加入浓度为1.0μm的dha溶液，对照组bmscs中加入等体积药物溶剂dmso，在bmscs达到第八代后，使用rt-qpcr及western blot实验检测bmscs细胞中干性相关蛋白sox2、oct4表达水平.。
42.结果显示：
43.dmso对照组干性相关蛋白sox2、oct4表达水平较低，实验组经过dha干预后，干性相关蛋白sox2、oct4表达上升，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图3a及图3b；
44.结论：
45.通过传代过程中dha处理的bmscs的rt-qpcr及western blot实验结果证明，dha在体外长期连续传代扩增中促进bmscs干性维持的作用。
46.实施例4
47.为了验证dha在体外连续传代扩增中维持bmscs增殖和克隆形成能力的作用，我们通过增殖标记物ki67免疫荧光染色及克隆形成实验(colony forming unit，cfu)实验进行验证。
48.对照组和实验组bmscs每代汇合至70-80％后经过胰酶消化后置于新的培养皿当中继续培养，如此反复连续，从第三代传代扩增至第八代，期间实验组中bmscs中加入浓度为1.0μm的dha溶液，对照组bmscs中加入等体积药物溶剂dmso，在bmscs达到第八代后，使用细胞免疫荧光技术，镜下随机拍照并分别统计增殖标记物ki67的阳性细胞数目。
49.结果显示：
50.实验组的ki67阳性细胞数目多，而dmso对照组的ki67阳性细胞数目较少，实验组和对照组相比具有统计学意义。通过ki67免疫荧光染色实验证明：dha在体外连续传代中可以明显促进bmscs的增殖能力，见图4；
51.结论：
52.通过传代过程中dha处理的bmscs的ki67免疫荧光实验结果证明，dha在体外长期连续传代扩增中促进bmscs增殖能力维持的作用。
53.实施例5
54.为了验证dha在体外连续传代扩增中维持bmscs成骨分化能力的作用，我们通过碱性磷酸酶、茜素红染色实验进行验证。
55.对照组和实验组bmscs每代汇合至70-80％后经过胰酶消化后置于新的培养皿当中继续培养，如此反复连续，从第三代传代扩增至第八代，期间对照组每代加入dmso溶液，实验组每代加入1.0μm的dha，在bmscs达到第八代后，对照组和实验组每隔2-3天加入更换新鲜的成骨培养基，进行以下处理：
56.①
在连续培养7天后，进行碱性磷酸酶染色，镜下随机拍照并统计染色阳性区域的比例；
57.②
相同条件下连续培养14天后，进行茜素红染色，镜下随机拍照并分别统计染色阳性区域的比例。
58.结果显示：
59.实验组阳性染色面积比例较高，而dmso对照组阳性染色面积比例较低，实验组和对照组相比具有统计学意义。见图5a及图5b。
60.结论：
61.通过碱性磷酸酶染色以及茜素红染色实验证明，体外长期传代扩增过程中dha处理可以维持bmscs成骨分化能力。
62.实施例6
63.为了验证dha在体外连续传代扩增中抑制bmscs成脂分化倾向的作用，我们通过油红o染色实验进行验证。
64.对照组和实验组bmscs每代汇合至70-80％后经过胰酶消化后置于新的培养皿中继续培养，如此反复连续，从第三代传代至第八代，期间对照组每代加入dmso溶液，实验组每代加入1.0μm的dha，在bmscs达到第八代后，对照组和实验组每隔2-3天加入更换新鲜的成脂培养基，在连续培养21天后，进行油红o染色，镜下随机拍照并统计染色阳性区域的比
例。
65.结果显示：实验组阳性染色面积比例较低，而dmso对照组阳性染色面积比例较高，实验组和对照组相比具有统计学意义。见图6。
66.结论：通过油红o染色实验证明，体外长期传代扩增过程中dha处理可以抑制bmscs成脂倾向。
67.实施例7
68.为了验证dha连续体外传代处理的bmscs植入体内后具有较强的骨形成能力，我们通过micro-ct和he染色验证。
69.对照组和实验组bmscs每代汇合至70-80％后经过胰酶消化后置于新的培养皿当中继续培养，从第三代传代扩增至第八代，期间对照组每代加入dmso溶液，实验组每代加入1.0μm的dha，在bmscs达到第八代后，将对照组和实验组细胞载于胶原支架材料上，植入裸鼠皮下，8周后取出支架材料，进行以下实验：
70.①
对8周后形成的异位组织进行micro-ct扫描，并统计组织高密度影像区域占据总体积的比例；
71.②
对8周后形成的异位组织进行切片及he染色，观察异位骨形成情况并镜下随机拍照。
72.结果显示：
73.实验组组织影像学密度较高、高密度影像体积占比大、骨形成相关组织学变化明显，而dmso对照组高密度影像体积比例较低，实验组和对照组高密度影像体积占比具有统计学意义，见图7a及图7b。
74.结论：
75.通过裸鼠皮下细胞支架的micro-ct及he染色实验证明，体外长期传代扩增过程中dha可以维持bmscs的成骨分化能力，并且bmscs移植入体内后具有更好的骨形成能力。
技术特征：1.二氢青蒿素在制备促进骨组织再生修复药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过维持骨髓间充质干细胞干性功能，促进骨组织再生修复。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含二氢青蒿素或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料。4.一种促进骨组织再生修复的组合物，其特征在于，所述组合物中包含二氢青蒿素。5.权利要求4所述的组合物在制备促进骨组织再生修复药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包含二氢青蒿素或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的辅料。7.二氢青蒿素在骨髓间充质干细胞体外培养中的应用，其特征在于，所述二氢青蒿素能够维持长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞的干性功能。8.一种能够维持长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞干性功能的培养基，其特征在于，所述培养基中含有二氢青蒿素。9.一种能够维持长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞干性功能的体外培养方法，其特征在于，所述方法包括采用含二氢青蒿素的培养基培养。
技术总结本发明提供了二氢青蒿素在制备促进骨组织再生修复药物中的应用。本发明还提供了二氢青蒿素在骨髓间充质干细胞体外培养中的应用，所述二氢青蒿素能够维持长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞的干性功能。本发明利用DHA成功建立了骨髓间充质干细胞的体外的培养、大量扩增的方法，能够获得足够数量的骨髓间充质干细胞，且经历长期传代扩增后的骨髓间充质干细胞能够维持干性功能，表现为保持良好的增殖和自我更新、成骨向分化能力，使骨髓间充质干细胞更适合应用于骨组织工程再生修复领域。胞更适合应用于骨组织工程再生修复领域。
技术研发人员：刘燕 王若茜 王禹 杨伟国 金姗姗 谢正伟
受保护的技术使用者：北京大学口腔医学院
技术研发日：2022.05.20
技术公布日：2022/7/5
