1.本发明属于蚂蟥加工技术领域，具体涉及一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法。
背景技术：2.菲牛蛭是一种吸血类医蛭科动物，含有丰富的天然抗凝血酶，被用来制备治疗和预防心脑血管疾病的药物，而且菲牛蛭已成功列入《广西壮族自治区壮药材质量标准》，为菲牛蛭作为药材的合法利用提供了依据。
3.但是，由于在不同的生活环境、饲养条件以及菲牛蛭的年龄大小差异，导致菲牛蛭中所含的主要药用成分天然抗凝血酶的含量差异很大，从而导致了原材料无法统一标准，进而导致了实际生产使用的诸多不便。还有，现有的获得天然抗凝血酶方法主要是将菲牛蛭杀死直接作为药材原料，这样的方法消耗较多的原料，成本居高不下；所得到的原料中抗凝血酶粗品的杂质会比较多，从而增加了除杂提纯的难度。
4.因此，亟需一种能够能高效重复利用菲牛蛭活体原料、而且便于除杂提纯以提供质量稳定的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法。
技术实现要素：5.本发明的目的是解决至少上述的缺陷，并提供以后将说明的优点。
6.本发明的另外一个目的是，提供一种可以将菲牛蛭进行重复利用以降低生产的成本的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法。
7.为了实现本发明的这些目的和其他优点，现提供一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，包括：选取处于饥饿状态的菲牛蛭活体，投喂至菲牛蛭活体自行脱落；快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下18℃～零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，得到抗凝血溶液；将抗凝血溶液置于0～15℃的环境中，依次经过过滤、蛋白分离沉淀、浓缩处理、浓度调配和冷冻干燥，即得到所述菲牛蛭抗凝血粗品。
8.上述方案中，具体的，处于饥饿状态的菲牛蛭活体为停止喂食超过12个月的菲牛蛭活体。
9.本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法中以人工配制的溶液进行投喂后再通过温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液，统一以吐出的溶液作为抗凝血粗品的提取原料，从而形成一个天然抗凝血酶的含量差异较小的范围作为参考标准，为后续的实际生产使用提供了便利。
10.其次，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法以人工配制的溶液进行投喂后再通过温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液，再将溶液经过处理而得到菲牛蛭抗凝血粗品，由于温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液的成分主要为菲牛蛭唾液腺的混合物，而唾液腺的混合物中含有的异源杂质含量少，从而减小后期的除杂提纯的难度。
11.还有，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法操作简单，便于对菲牛蛭进行批量的饲养管理，从而降低了获得菲牛蛭抗凝血粗品原料的成本。
12.还有，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法通过温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液而获得菲牛蛭抗凝血粗品的原料，相对于传统直接将菲牛蛭杀死来制备抗凝血粗品的方法能够保持菲牛蛭活体的生物活性，从而利于对菲牛蛭进行重复利用，进一步降低获得菲牛蛭抗凝血粗品原料的成本。
13.优选的是，在获得溶液之后，将菲牛蛭活体再次转移至38～40℃的环境中，使用35～37℃的人工配制溶液进行投喂至菲牛蛭活体自行脱落；然后快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下18℃～零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，再次得到抗凝血溶液。
14.上述方案中，通过将获得溶液后的菲牛蛭进行循环重复利用，以获得制备抗凝血粗品的原料，从而降低制备菲牛蛭抗凝血粗品原料的成本。
15.优选的是，所述投喂包括制备人工配置溶液，并保持人工溶液的温度为35～37℃；所述人工配制溶液具体包括：以浓度为0.9％的生理盐水为主，添加生理盐水重量0.95～1.05％的葡萄糖、生理盐水重量0.45～0.55％的复合氨基酸、生理盐水重量0.45～0.55％的维生素c、生理盐水重量2.9～3.5％的血清蛋白粉，搅拌均匀即可；其中，血清蛋白粉为家禽或家畜的血清蛋白粉。
16.上述方案中，通过人工配制溶液作为菲牛蛭吸食的溶液，喂饱菲牛蛭的同时能够刺激菲牛蛭分泌更多的抗凝血酶，从而增加了经过温度差异刺激后菲牛蛭吐出液体的总量。
17.优选的是，所述板面为表面光滑洁净的不锈钢板或玻璃板或瓷板或塑料板；其中，所述板面倾斜于水平面5～10度放置。
18.上述方案中，以表面光滑洁净的板面作为菲牛蛭自行吐出溶液的支撑载体，且板面保持倾斜于水平面5～10度放置，使得菲牛蛭能够保持不易滑落的状态来吐出溶液，而由于倾斜角度的设置又使得溶液能够顺着板面向下滴落，从而便于溶液的收集工作。
19.其次，板面为表面光滑洁净的不锈钢板或瓷板，热传导能力比较强，易于保持设定的温度，从而使得菲牛蛭的温度刺激较大，更好的刺激菲牛蛭进行吐液。
20.优选的是，所述过滤具体包括：过滤采用食品级过滤网进行，过滤网的孔径为10～50微米，过滤的条件为0～15℃。
21.优选的是，所述蛋白分离沉淀具体包括：采用三氯乙酸或硫酸铵进行蛋白分离沉淀，1～4次，直到无明显沉淀物；其中，分离过程在0～15℃条件下进行。
22.优选的是，所述浓缩处理具体包括：在0～15℃的环境中，采用超滤设备进行超滤，截留分子量为4000～15000的物质；所述超滤设备包括钢膜、陶瓷膜和中空纤维膜。
23.优选的是，还包括在浓缩处理之后、冷冻干燥之前进行浓度调配，所述浓度调配具体包括：向所得溶液中加入辅料混合调配至所需浓度；所述辅料包括淀粉、海藻糖、葡萄糖和甘露醇。
24.优选的是，所述菲牛蛭抗凝血粗品的抗凝血酶活性含量为100～8000atu/克。
25.本发明的优点：
26.首先，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法中以人工配制的溶液进行投喂后再通过温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液，统一以吐出的混合溶液作为抗凝血粗品的提取原料，从而形成一个天然抗凝血酶的含量差异较小的范围作为参考标准，为后续的实际生产使用提供了便利。
27.其次，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法以人工配制的溶液进行投喂后再通过温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液，再将溶液经过处理而得到菲牛蛭抗凝血粗品，由于温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液的成分主要为菲牛蛭唾液腺的混合物，而唾液腺的混合物中含有的杂质含量少，从而减小后期的除杂提纯的难度。
28.还有，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法操作简单，便于对菲牛蛭进行批量的投喂管理，从而降低了获得菲牛蛭抗凝血粗品原料的成本。
29.还有，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法通过温度差异刺激菲牛蛭自行吐出溶液而获得菲牛蛭抗凝血粗品的原料，相对于传统直接将菲牛蛭杀死来制备抗凝血粗品的方法能够保持菲牛蛭活体的生物活性，从而利于对菲牛蛭进行重复利用，进一步降低获得菲牛蛭抗凝血粗品原料的成本。
30.还有，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法中通过人工配制溶液作为菲牛蛭的养殖饲料，喂饱菲牛蛭的同时能够刺激菲牛蛭分泌更多的抗凝血酶，从而增加了经过温度差异刺激后菲牛蛭吐出液体的总量。
31.还有，本发明的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法中以表面光滑洁净的板面作为菲牛蛭自行吐出溶液的支撑载体，且板面保持倾斜于水平面5～10度放置，使得菲牛蛭能够保持不易滑落的状态来吐出溶液，而由于倾斜角度的设置又使得溶液能够顺着板面向下滴落，从而便于溶液的收集工作。
具体实施方式
32.下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
33.实施例1
34.一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，包括以下步骤：
35.步骤一、选取2龄的健康、经过净化且处于饥饿状态的菲牛蛭活体20千克，置于38～40℃的环境中，使用35～37℃的鸡血进行投喂至菲牛蛭活体自行脱落。
36.步骤二、快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，得到抗凝血溶液。
37.步骤三、在吐完的菲牛蛭中选取仍具有活性的菲牛蛭，置于38～40℃的环境中，使用35～37℃的鸡血继续投喂至菲牛蛭活体自行脱落，再快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出而获得抗凝血溶液。重复以上操作至所有的菲牛蛭死亡。
38.步骤四、将所有的抗凝血溶液置于0℃的环境中，依次经过过滤、蛋白分离沉淀、浓缩处理和冷冻干燥，即得到所述菲牛蛭抗凝血粗品。
39.具体的，经过净化的菲牛蛭是指不携带常见致病菌的菲牛蛭。
40.实施例2
41.一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，包括以下步骤：
42.步骤一、取200升浓度为0.9％的生理盐水，添加2千克葡萄糖、1千克的复合氨基酸、1千克的维生素c、6千克的鸡血清蛋白粉，搅拌均匀即可得到人工配制溶液，保持人工配制溶液的温度为35～37℃，并将人工配制溶液置于38～40℃的环境中备用。
43.步骤二、选取2龄的健康、经过净化且处于饥饿状态的菲牛蛭活体20千克，置于人工配制溶液进行投喂至菲牛蛭活体自行脱落。
44.步骤三、快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，得到抗凝血溶液。
45.步骤四、在吐完的菲牛蛭中选取仍具有活性的菲牛蛭，置于38～40℃的环境中，使用35～37℃的鸡血继续投喂至菲牛蛭活体自行脱落，再快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出而获得抗凝血溶液。重复以上操作至所有的菲牛蛭死亡。
46.步骤五、将抗凝血溶液置于0℃的环境中，依次经过过滤、蛋白分离沉淀、浓缩处理和冷冻干燥，即得到所述菲牛蛭抗凝血粗品。
47.实施例3
48.在实施例2的基础上，将鸡血清蛋白粉替换为牛血清蛋白粉。
49.实施例4
50.在实施例2的基础上，将步骤三的温度条件替换为零下18℃。
51.实施例5
52.在实施例2的基础上，将步骤五中的温度条件替换为15℃。
53.实施例6
54.一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，包括以下步骤：
55.步骤一、取200升浓度为0.9％的生理盐水，添加2千克葡萄糖、1千克的复合氨基酸、1千克的维生素c、6千克的鸡血清蛋白粉，搅拌均匀即可得到人工配制溶液，保持人工配制溶液的温度为35～37℃，并将人工配制溶液置于38～40℃的环境中备用。
56.步骤二、选取2龄的健康、经过净化且处于饥饿状态的菲牛蛭活体20千克，置于人工配制溶液进行投喂至菲牛蛭活体自行脱落。
57.步骤三、快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，得到抗凝血溶液。
58.步骤四、在吐完的菲牛蛭中选取仍具有活性的菲牛蛭，置于38～40℃的环境中，使用35～37℃的鸡血继续投喂至菲牛蛭活体自行脱落，再快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出而获得抗凝血溶液。重复以上操作至所有的菲牛蛭死亡。
59.步骤五、将所有的抗凝血溶液置于0℃的环境中，采用孔径为50微米食品级过滤网进行过滤得到第一滤液。
60.步骤六、在0℃的环境中，采用三氯乙酸将第一滤液进行蛋白分离沉淀，得到第二滤液。
61.步骤七、在0℃的环境中，采用超滤设备进行超滤，截留分子量为4000～15000的物质，得到浓缩液。
62.步骤八、在0℃的环境中，测定浓缩液的抗凝血酶活性，所得浓缩液抗凝血酶活性含量为75atu/克，目标干物质所需抗凝血酶活性含量为750atu/克，则取10克浓缩液与1克葡萄糖进行混合，再冷冻干燥至物料的水分含量≤5％，即得到所述菲牛蛭抗凝血粗品。
63.实施例7
64.在实施例6的基础上，将步骤五中的三氯乙酸替换为硫酸铵。
65.实施例8
66.在实施例6的基础上，将步骤七中的葡萄糖替换为淀粉。
67.实施例9
68.在实施例6的基础上，将步骤七中的葡萄糖替换为海藻糖。
69.实施例10
70.在实施例6的基础上，将步骤七中的葡萄糖替换为甘露醇。
71.对比例1
72.一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，包括以下步骤：
73.步骤一、取2龄的健康、经过净化且处于饥饿状态的菲牛蛭20千克，以鸡血喂养至菲牛蛭处于饱腹状态后机械切取菲牛蛭的头部，获得6千克的原料；按重量比1：4将原料与质量浓度0.8％的氩化钠溶液混合，再将混合物置干4～6℃的冷室中静置，使混合物温度达到4～6℃。
74.步骤二、用带有冷却装置的胶体磨机反复碾磨步骤一中的混合物并控制温度处于4～6℃，混合物在胶体磨机中反复碾磨每次停留时间不超过30秒，转速在3000转/分钟，使混合物中菲牛蛭原料碾磨成50微米的浆状物，然后将浆状物在4～6℃的冷室中放置24小时，再冷冻干燥至物料水分≤5％，即得到菲牛蛭抗凝血粗品1.4千克。
75.对比例2
76.一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，包括以下步骤：
77.步骤一、将乙酸、柠檬酸、氯化钠和碳酸钠混合制成溶液浓度为0.1％、ph值为4.5的水溶液。
78.步骤二、取1龄以上的健康、经过净化且处于饥饿状态的菲牛蛭20千克，置于水溶液中至菲牛蛭处于饱腹状态，取出饱腹的菲牛蛭进行挤压，获得菲牛蛭的唾液。
79.步骤三、在取完唾液的菲牛蛭中选取仍具有活性的菲牛蛭，置于水溶液中继续喂养至菲牛蛭处于饱腹状态，再取出饱腹的菲牛蛭进行挤压以获得菲牛蛭的唾液；重复以上操作至所有的菲牛蛭死亡。
80.步骤四、将获得的所有菲牛蛭的唾液置于0℃的环境中，依次经过过滤、蛋白分离沉淀、浓缩处理、浓度调配和冷冻干燥，即得到所述菲牛蛭抗凝血粗品。
81.菲牛蛭抗凝粗品的指标测定
82.1、按照实施例1～5以及对比例1～2的方法分别进行菲牛蛭的养殖并获得菲牛蛭抗凝血粗品，按顺序分成1～7组。其中，选育的菲牛蛭为同一批次且活性状态相近的菲牛蛭，饲养场地为同一饲养棚的多个饲养池，饲养初始时间一致。记录采样次数、第1次和第2次采集得到的抗凝血溶液(或唾液)重量、总共采集得到的抗凝血溶液(或唾液)重量、最终得到的抗凝血粗品的总重量并采用凝血酶滴定法进行抗凝血酶活性含量的测定，结果如表1所示。
83.表1：
[0084][0085]
根据表1的数据，将组1～组3和组7的数据进行对比，组1～组5的采集次数均明显高于组7的采集次数；组1～组5第1次采集得到的抗凝血溶液明显高于组7第1次采集得到的唾液，组1～组5总共采集得到的抗凝血溶液也明显高于组7总共采集得到的唾液。说明：采用本发明的方法进行菲牛蛭的投喂以及获得菲牛蛭抗凝血溶液，能够得到更多的菲牛蛭抗凝血溶液，即本发明的方法得到的菲牛蛭抗凝血粗品的原料相对于对比例2的方法所得的菲牛蛭抗凝血粗品的原料更多。
[0086]
2、采用凝血酶滴定法分别对组1～组5各组所得的抗凝血溶液、组6所得的浆状物和组7所得的唾液进行抗凝血酶活性含量的测定，结果如表2所示。
[0087][0088]
根据表2的数据，将组1的数据和组2～5的数据进行对比，可知采用本发明制备得到的人工配制溶液进行投喂相对于传统以鸡血进行投喂所得到的抗凝血溶液中抗凝血酶活性含量更大。
[0089]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此，在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
技术特征：1.一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，包括：选取处于饥饿状态的菲牛蛭活体，置于38～40℃的环境中，投喂至菲牛蛭活体自行脱落；快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下18℃～零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，得到抗凝血溶液；将抗凝血溶液置于0～15℃的环境中，依次经过过滤、蛋白分离沉淀、浓缩处理和冷冻干燥，即得到所述菲牛蛭抗凝血粗品。2.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，在获得溶液之后，将菲牛蛭活体再次转移至38～40℃的环境中，使用35～37℃的人工配制溶液进行投喂至菲牛蛭活体自行脱落；然后快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下18℃～零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，再次得到抗凝血溶液。3.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，所述投喂包括制备人工配置溶液，并保持人工溶液的温度为35～37℃；所述人工配制溶液具体包括：以浓度为0.9％的生理盐水为主，添加生理盐水重量0.95～1.05％的葡萄糖、生理盐水重量0.45～0.55％的复合氨基酸、生理盐水重量0.45～0.55％的维生素c、生理盐水重量2.9～3.5％的血清蛋白粉，搅拌均匀即可；其中，血清蛋白粉为家禽或家畜的血清蛋白粉。4.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，所述板面为表面光滑洁净的不锈钢板或玻璃板或瓷板或塑料板；其中，所述板面倾斜于水平面5～10度放置。5.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，所述过滤具体包括：过滤采用食品级过滤网进行，过滤网的孔径为10～50微米，过滤的条件为0～15℃。6.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，所述蛋白分离沉淀具体包括：采用三氯乙酸或硫酸铵进行蛋白分离沉淀1～4次，直到无明显沉淀物；其中，分离过程在0～15℃条件下进行。7.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，所述浓缩处理具体包括：在0～15℃的环境中，采用超滤设备进行超滤，截留分子量为4000～15000的物质；所述超滤设备包括钢膜、陶瓷膜和中空纤维膜。8.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，还包括在浓缩处理之后、冷冻干燥之前进行浓度调配，所述浓度调配具体包括：向所得溶液中加入辅料混合调配至所需浓度；所述辅料包括淀粉、海藻糖、葡萄糖和甘露醇。9.如权利要求1所述的菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，其特征在于，所述菲牛蛭抗凝血粗品的抗凝血酶活性含量为100～8000atu/克。
技术总结本发明公开了一种菲牛蛭抗凝血粗品的提取方法，包括选取处于饥饿状态的菲牛蛭活体，置于38～40℃的环境中，投喂至菲牛蛭活体自行脱落；快速将脱落的菲牛蛭活体转移至零下18℃～零下5℃的板面上，刺激菲牛蛭将体内溶液吐出，得到抗凝血溶液；将抗凝血溶液置于0～15℃的环境中，依次经过过滤、蛋白分离沉淀、浓缩处理和冷冻干燥，即得到所述菲牛蛭抗凝血粗品。本发明的方法中菲牛蛭活体原料能高效重复利用，而且得到的菲牛蛭抗凝血粗品便于除杂提纯。纯。
技术研发人员：覃壬 李洪 贺嘉允
受保护的技术使用者：广西蛭郎中生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.19
技术公布日：2022/7/5
