1.本发明涉及微生物发酵提取技术领域，尤其涉及一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁 及破壁灵芝的提取方法。
背景技术：2.灵芝(学名:ganoderma lucidum(curtis)p.karst.)又称莎草，是真菌门担子菌亚门多孔菌 目灵芝菌科灵芝属药食两用真菌。灵芝子实体大多为一年生，有柄，小柄侧生。菌盖木质， 木栓质，扇形，具沟纹，肾形、半圆形或近圆形，表面褐黄色或红褐色，血红至栗色，有 时边缘逐渐变成淡黄褐色至黄白色，具似漆样光泽，盖表有同心环沟，边缘锐或稍钝，往 往内卷。菌肉白色至淡褐色，接近菌管处常成淡褐色，菌管小，管孔面淡白色，白肉桂色， 淡褐色至淡黄褐色，管口近圆形，菌柄侧生、偏生或中生，近圆柱形，有较强的漆样光泽。 担孢子卵形或顶端平截，双层壁，外壁透明、平滑，内壁褐色或淡褐色，具小刺，中央具 一油滴。
3.研究表明，灵芝中含有多糖、三萜、生物碱、氨基酸及有机锗等多种活性成分，具有 抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、保肝护肝等生物学功能。现有研究表明，灵芝的抗肿瘤活性 是由于具有特定结构的多糖，灵芝多糖除了具有增强免疫功能以及抑制肿瘤的功能以外， 还有显著的抗突变、降血脂、血糖、抗病毒等功效。灵芝三萜类化合物具有抑制细胞组织 胺的释放，促进消化器官机能，降血脂、血压和保肝的作用。然而，多糖和三萜等活性成 分不但存在于细胞壁内，还被灵芝中整齐致密的纤维素超分子结晶束结构和半纤维素-木质 素复合体层层包裹，导致提取困难及提取不完全。
4.灵芝破壁的技术有化学法、物理法、生物酶解法等。溶剂浸煮法只能使细胞胞质皱缩， 细胞壁没有破损，活性成分难以释出，提取率低；超声波辅助提取法和微波辅助提取法， 使细胞壁出现微小孔洞，提取率较溶剂浸提法略有提高，但设备要求高、不利于生产；超 微粉碎技术辅助提取法和酶辅助提取法分别通过物理方法和酶解法破坏细胞壁，使提取率 大大提高，但超微粉碎技术对设备要求高、能耗高、易吸附杂质；生物酶解法，酶易失活、 ph范围和最佳温度较难把控，不适合大规模生产。因此，急需一种活性成分提取率高，成 本低的方法对灵芝进行提取。
技术实现要素：5.针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及 破壁灵芝的提取方法，其解决了现有技术中存在的活性成分得率低的问题。
6.本发明一方面，提供一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，包 括以下步骤：
7.s1：将灵芝粉碎，加水，得到含水灵芝培养基；
8.s2：将哈茨木霉菌接种至步骤s1的含水灵芝培养基中进行破壁处理，得到破壁灵芝。
9.进一步地，步骤s1中，按质量计，灵芝：水＝1：0.5-3。
10.进一步地，步骤s2中，所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌1228，其保藏号为cctccno:m2015412。
11.进一步地，步骤s2中，所述破壁处理的时间为72-120h，温度为20-37℃。
12.进一步地，步骤s2中，按质量百分比计，所述哈茨木霉菌按5-10％的接种量接种至所 述含水灵芝培养基中。
13.进一步地，还包括步骤s3：对s2得到的破壁灵芝进行提取。
14.进一步地，所述提取包括破壁灵芝多糖提取：以水为提取剂对破壁灵芝多糖进行提取， 以ml/g计，破壁灵芝：水＝1：5-50，提取时间为1-10h，提取温度为25-100℃，提取次 数为1-3次。
15.进一步地，所述提取包括破壁灵芝三萜提取：以无水乙醇为提取剂对破壁灵芝三萜进 行提取，以ml/g计，破壁灵芝：无水乙醇＝1：5-50，提取时间为1-10h，提取温度为25-78℃， 提取次数为1-3次。
16.本发明另一方面，提供一种灵芝多糖提取物，通过上述利用哈茨木霉菌对灵芝进行破 壁及破壁灵芝的提取方法制备而成。
17.本发明又一方面，提供一种灵芝三萜提取物，通过上述利用哈茨木霉菌对灵芝进行破 壁及破壁灵芝的提取方法制备而成。
18.本发明的技术原理为：
19.本发明通过从稻田、树林等富含纤维素的环境中筛选出多种能分解纤维素、木质素等 的微生物，并建立了菌种库，包括赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus fusiformis)、空气芽孢杆菌 (bacillus aerius)、桔青霉(penicillium citrinum)、匍枝根霉(rhizopus stolonifer)、哈茨木霉菌 (trichoderma harzianum)等，通过进一步研究意外发现哈茨木霉菌1228，可以非常高效的 分解灵芝中的纤维素，破坏其细胞壁及致密的结构，使活性成分充分释出，并且释放的活 性成分具有更好的疗效。这是可能是由于该菌种可特异性的降解灵芝中的细胞壁而不破坏 灵芝内的活性成分，对活性成分包括多糖、三萜或其他活性成分并没有降解作用，从而使 活性成分具有更好的疗效。
20.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
21.(1)本发明通过使用哈茨木霉菌1228，其保藏号为cctcc no:m2015412，可特异 性的只降解灵芝中的细胞壁而不破坏有效成分，使得破壁灵芝有效成分提取率明显增高。 灵芝多糖最高提取率高达50.57mg/g，远高于同批次灵芝多糖常规提取法的提取率 34.02mg/g；灵芝三萜提取率达到17.12mg/g，明显高于同批次灵芝三萜常规提取法的提取 率10.67mg/g。
22.(2)本发明的灵芝提取物活性高，灵芝多糖的超氧阴离子清除率为26.05％，远高于 同批次灵芝多糖常规提取法。
23.(3)本发明的提取时间短、提取效率高、提取条件温和、溶剂用量少，有利于大规 模的批量化生产。
24.(4)本发明中的破壁处理采用固态发酵方法，使得哈茨木霉菌更易生长，活力更高， 使得灵芝活性成分的提取率更高。
附图说明
25.图1为本发明的破壁灵芝提取方法的技术路线图。
26.图2为本发明实施例1中不同菌种对纤维素的降解率图。
27.图3为本发明实施例1中培养的哈茨木霉菌效果图。
具体实施方式
28.下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。本发明所用灵芝为青海雪 芝隆生物科技有限公司提供的同批次灵芝。
29.实施例1菌种筛选
30.1、菌种初筛
31.利用纤维素分解菌筛选培养基，从稻田、树林等富含纤维素的环境中筛选能分解纤维 素、木质素等的微生物。根据菌落周围透明圈的有无、大小和清晰度可大致判断菌株产纤 维素酶的能力。
32.纤维素分解菌筛选培养基：cmc-na 5g，硝酸钠1g，七水合磷酸氢二钠1.2g，磷酸二 氢钾0.9g，七水硫酸锰0.5g，氯化钾0.5g，酵母膏0.5g，酪素0.5g，以蒸馏水定容至 1000ml。筛选出的菌种如表1所示。
33.表1筛选菌种
[0034][0035][0036]
2、菌种复筛
[0037]
以同产地、同批次的灵芝为实验材料，灭菌后粉碎，加入灵芝：水＝1：0.5(质量比) 的水，将表1中的筛选菌种接种至该含水灵芝培养基上，接种量为含水灵芝培养基重量的 5％，于恒温摇床中26℃振荡培养，进行固态发酵，每12h观察一次，48h后以纤维素降解 率(纤维素降解率通过硝酸乙醇法测定)为指标，通过单因素实验考察菌种对纤维素降解 率的影响，结果如图2。
[0038]
从图2可以看出，经微生物破壁处理后纤维素含量都有所下降，其中lz51破壁后纤 维素含量最低。经鉴定，该菌种为哈茨木霉菌1228，菌种保藏号为m2015412。哈茨木霉 菌1228已于2015年6月27日，保存于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址 是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏号为cctcc no:2015412，拉丁文名称 为trichoderma harzianum1228。培养的哈茨木霉菌如图3所示。
[0039]
实施例2灵芝破壁工艺优化
[0040]
以同产地、同批次的灵芝为实验材料，将灵芝清洗晾干，灭菌后粉碎，加入一定量的 水，得到含水灵芝培养基；在该含水灵芝培养基中接入菌种进行破壁，菌种接种量为含水 灵芝培养基重量的10％，破壁结束后，平摊于不锈钢盘上，烘箱60℃干燥，得到破壁灵
药典中齐墩果酸对照法)为指标，采用l9(34)正交表考察提取时间、提取温度、提取剂用 量对破壁后灵芝三萜提取率的影响。各因素水平设计如表4所示。
[0070]
因素a提取剂用量：a1＝10ml/1g灵芝，a2＝30ml/1g灵芝，a3＝50ml/1g灵芝。
[0071]
因素b提取时间：b1＝1h，b2＝2h，b3＝3h。
[0072]
因素c提取温度：c1＝25℃，c2＝50℃，c3＝78℃。
[0073]
因素d提取次数：d1＝1次，d2＝2次，d3＝3次。
[0074]
表4灵芝三萜提取工艺正交试验表
[0075]
试验号因素a因素b因素c因素d三萜提取量(mg/g灵芝)11(10ml无水乙醇/1g发酵灵芝)1(1h)1(25℃)1(1次)1.3721(10ml无水乙醇/1g发酵灵芝)2(2h)2(50℃)2(2次)7.8431(10ml无水乙醇/1g发酵灵芝)3(3h)3(78℃)3(3次)15.0842(30ml无水乙醇/1g发酵灵芝)1(1h)2(50℃)3(3次)4.5652(30ml无水乙醇/1g发酵灵芝)2(2h)3(78℃)1(1次)10.0762(30ml无水乙醇/1g发酵灵芝)3(3h)1(25℃)2(2次)10.3473(50ml无水乙醇/1g发酵灵芝)1(1h)3(78℃)2(2次)6.6483(50ml无水乙醇/1g发酵灵芝)2(2h)1(25℃)3(3次)6.0893(50ml无水乙醇/1g发酵灵芝)3(3h)2(50℃)1(1次)12.95k18.094.195.938.13 k28.327.998.458.27 k38.5612.7910.598.57 r0.478.604.660.44 [0076]
由表4可以看出，最优三萜提取工艺为a3b3c3d3，且b3》c3》a3》d3。可见溶剂用 量对三萜提取率影响不大，影响最大的提取时间r＝8.60，随时间增长，提取率增加。提取 温度影响其次，r＝4.66，温度越高提取率越高，但溶剂无水乙醇的沸点为78度，已达极 限。
[0077]
2、单因素试验：取实施例2中最适发酵条件制备的破壁灵芝1g，加入50ml无水乙醇 在78℃浸提1h、2h、3h、4h、5h、6h，考察提取时间对多糖提取率的影响。按本实施例 步骤1的方法进行检测，可知当提取时间达到5h后，三萜提取率达到17.12mg/g，之后便 不再升高。
[0078]
3、取实施例2中最适发酵条件制备的破壁灵芝3g，置于100ml圆底瓶中，加入50ml 无水乙醇，在25℃下浸提10h，放置室温，过滤得提取液根据药典通过齐墩果酸对照法测 定该破壁灵芝总三萜含量为11.17mg/g。
[0079]
试验例1
[0080]
实验组1：实施例4中按照以下条件制备的灵芝多糖提取物：取实施例2中最适发酵 条件制备的破壁灵芝1g，加入50ml水在100℃浸提5h。
[0081]
对照组1：将灵芝清洗晾干，磨成粉末，得到未经破壁的灵芝；取未经破壁的灵芝1g， 加入50ml水在100℃浸提5h。
[0082]
对照组2：与实验组1类似，不同之处在于：灵芝破壁所用的菌种为绿色木霉菌。
[0083]
实验组2：实施例5中按照以下条件制备的灵芝三萜提取物：取实施例2中最适发酵 条件制备的破壁灵芝1g，加入50ml无水乙醇在78℃浸提5h。
[0084]
对照组3：将灵芝清洗晾干，磨成粉末，得到未经破壁的灵芝；取未经破壁的灵芝1g， 加入50ml无水乙醇在78℃浸提5h。
[0085]
对照组4：与实验组2类似，不同之处在于：灵芝破壁所用的菌种为绿色木霉菌。
[0086]
1、活性成分含量检测：
[0087]
按照实施例4、5的方法检测对照组1、2中的多糖含量、对照组3、4中的三萜含量。 经检测，对照组1中多糖含量为34.02mg/g，对照组2中多糖含量为40.12mg/g，对照组3 中三萜含量为10.67mg/g，对照组4中三萜含量为13.77mg/g。
[0088]
由以上结果可知，对照组1、2中的多糖含量明显低于实验组1中的多糖含量50.76 mg/g，对照组3、4中的三萜含量明显低于实验组2中的三萜含量17.12mg/g。
[0089]
2、抗氧化活性检测：
[0090]
以邻苯三酚自氧化法测定同体积多糖提取液下，实验组1、对照组1、2的抗氧化活性。 结果表明，对照组1中超氧阴离子清除率为11.05％，对照组2中超氧阴离子清除率为 17.85％。实验组1中超氧阴离子清除率为26.05％。
[0091]
由以上结果可知，实验组1的抗氧化活性明显高于对照组1、2的抗氧化活性。这可 能是由于对照组1中的多糖有效成分未被完全提取，对照组2中的多糖有效成分在破壁的 时候被部分降解。
[0092]
经体外细胞检测，可知灵芝三萜提取物的抗酪氨酸酶活性具有与灵芝多糖类似的结 果。
[0093]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实 施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方 案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明 的权利要求范围当中。
技术特征：1.一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：将灵芝粉碎，加水，得到含水灵芝培养基；s2：将哈茨木霉菌接种至步骤s1的含水灵芝培养基中进行破壁处理，得到破壁灵芝。2.如权利要求1所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，步骤s1中，按质量计，灵芝：水＝1：0.5-3。3.如权利要求1所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，步骤s2中，所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌1228，其保藏号为cctcc no:m2015412。4.如权利要求1所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，步骤s2中，所述破壁处理的时间为72-120h，温度为20-37℃。5.如权利要求1所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，步骤s2中，按质量百分比计，所述哈茨木霉菌按5-10％的接种量接种至所述含水灵芝培养基中。6.如权利要求1所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，还包括步骤s3：对s2得到的破壁灵芝进行提取。7.如权利要求6所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，所述提取包括破壁灵芝多糖提取：以水为提取剂对破壁灵芝多糖进行提取，以ml/g计，破壁灵芝：水＝1：5-50，提取时间为1-10h，提取温度为25-100℃，提取次数为1-3次。8.如权利要求6所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法，其特征在于，所述提取包括破壁灵芝三萜提取：以无水乙醇为提取剂对破壁灵芝三萜进行提取，以ml/g计，破壁灵芝：无水乙醇＝1：5-50，提取时间为1-10h，提取温度为25-78℃，提取次数为1-3次。9.一种灵芝多糖提取物，其特征在于，由权利要求7所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法制备而成。10.一种灵芝三萜提取物，其特征在于，由权利要求8所述的一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法制备而成。
技术总结本发明提供了一种利用哈茨木霉菌对灵芝进行破壁及破壁灵芝的提取方法。包括以下步骤：S1：将灵芝粉碎，加水，得到含水灵芝培养基；S2：将哈茨木霉菌接种至步骤S1中的含水灵芝培养基进行破壁处理，得到破壁灵芝。所述哈茨木霉菌为哈茨木霉菌1228，其保藏号为CCTCC NO:M2015412。本发明可特异性的只降解灵芝中的细胞壁而不破坏有效成分，使得破壁灵芝有效成分提取率明显增高。本发明的灵芝提取物活性高，提取时间短、提取效率高、提取条件温和、溶剂用量少，有利于大规模的批量化生产。有利于大规模的批量化生产。
技术研发人员：吴雨来 张洋 李加友 费思瑜 徐甄 李鸿志 李明 文振祥 刘兵 刘赟霄
受保护的技术使用者：青海雪芝隆生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/5
