1.一种间充质干细胞及其制备方法，属于间充质干细胞迁移能力提升方法技术领域。
背景技术：2.间充质干细胞（mesenchymal stem cells, mscs）作为一种颇具前景的种子细胞，已被广泛应用于自体细胞移植。临床应用mscs的早期想法是源于对神经系统的保护，并已用于治疗神经性损伤疾病方面的应用。不仅如此，基于mscs向多种类型细胞分化的潜能，可以广泛应用于多种损伤组织器官（心肌、软骨、脊髓等）的修复及再生。mscs的定向迁移对于机体内许多器官的发育和再生，以及组织损伤后的修复是必需的。许多报道发现移植的mscs对于机体的病灶部位会产生明显的趋化迁移效应。机体组织受损后其修复能力是有限的。因此，将具有多方向分化能力的间充质干细胞进行临床移植对于器官组织再生具有重大的意义。基于目前临床上的多数研究，发现移植后的mscs真正有效迁移至损伤或肿瘤部位的数量极少，从而严重影响了受损部位及肿瘤的修复效果，成为mscs临床移植中的最大瓶颈。
3.现有技术中，专利cn 201911163143.3公开了一种靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法，其通过向mscs细胞中转染mir-26b提高其迁移能力，其实际着重提高的仍是mscs迁移后在靶向位置的定植能力，仍然不能有效的提高mscs向目标位置的迁移能力。
技术实现要素：4.本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种具备高迁移能力的间充质干细胞及其制备方法。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞内转染mir-210。
6.对病灶部位的趋化性迁移是由受损部位所分泌出的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, vegf）、干细胞生长因子（stem cell factor, scf）、基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1, sdf-1）以及肝细胞生长因子（hepotacyte growth factor, hgf）等细胞因子所诱导引起的。发明人通过大量试验发现，在众多诱导因子中，hgf才是引起间充质干细胞最佳迁移效应的因子。在此基础上，发明人经过研究进一步发现，通过抑制剂su11274将c-met活性抑制后，处理后的细胞向hgf的迁移数目明显减少，这充分证明了c-met介导了hgf诱导的mscs的迁移效应，c-met的磷酸化水平与hgf诱导的迁移成正相关性。
7.为了充分利用上述发现中hgf对诱导迁移的影响，同时也为了获得最佳迁移效率的mscs，发明人尝试多种活性促进物质与hgf、c-met之间的关系，以及microrna家族中多种microrna对hgf、c-met影响，经过对不同microrna转染试验，发明人发现mir-210作为microrna家族中的一个小分子rna，可以影响肿瘤迁徙，也可以调控met表达，由此，上述技
术方案通过向mscs中转染mir-210，的确上调了细胞内c-met的活化水平，且转染后的细胞向hgf的迁移数量明显增加。并且经过构造软骨损伤模型，发现注射转染mir-210的mscs迁移至体内病灶部位的细胞数显著性地大于未转染组，进一步验证了，通过mir-210转染间充质干细胞最终能够获得一类具备高效趋化迁移能力的mscs。
8.优选的，所述的间充质干细胞为人源脂肪间充质干细胞。优选方案提供了一种间充质干细胞来源，脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells, admscs），具有来源广，成本低，易获得与保存，并且方便培养，便于实现体外规模培养，并且特别适用于特定个体针对性培养间充质干细胞，大大降低了排异可能。
9.一种以上所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：取培养至第四代的间充质干细胞接种至孔板，待融合度生长至80~90%时，进行mir-210 mimics的转染。
10.进一步优选的，所述的间充质干细胞培养方法为：含有间充质干细胞的人脂肪经冲洗和细胞筛网过滤获得间充质干细胞，加入含胎牛血清的l-dmem培养基，移入培养皿进行原代培养，去除非贴壁细胞并用pbs缓冲液洗瓶，重新添加新鲜原代培养液 ，培养至细胞达80%~90％融合时，加入胰酶消化，按1: 2比例传代培养。
11.生长于l-dmem中的mscs早期原代培养时，细胞大小形态不均一。培养至第四代以后在倒置显微镜下观察，细胞形态比较均一，生长排列整齐成长梭形，外观类似成纤维细胞样（图1a）。
12.进一步优选的，所述的含有间充质干细胞的人脂肪用含青霉素与链霉素的pbs冲洗1~5次后，加入等体积0.075%ⅰ型胶原酶，37℃，消化30 min，每5分钟混匀摇动。悬液经pbs洗涤两次后，1500 r/min离心10 min，pbs重悬经70 μm细胞筛网过滤。
13.进一步优选的，所述的胎牛血清在l-dmem培养基中的体积分数为10%。
14.进一步优选的，所述的添加新鲜原代培养液后，置于37℃、5% 二氧化碳浓度培养箱内，每3天更换一次培养液，进行培养。
15.与现有技术相比，本发明所具有的有益效果是：发明人发现hgf引起的细胞迁移数明显高于其他因子。选取不同浓度（0、25、50、100 ng/ml）的hgf刺激mscs后，western blo显示hgf在50 ng/ml的浓度刺激时，c-met的磷酸化水平（即活化水平）最高。用抑制剂su11274 将c-met活性抑制后，处理后的细胞向50 ng/ml hgf的迁移数目明显减少。将mir-210转染进入admscs后，发现磷酸化水平的c-met显著高于对照，且转染后的细胞迁移能力也显著提高。进一步地，建立关节软骨损伤模型后，体内迁移实验计数定位于受损部位的标记细胞，发现转染mir-210的mscs迁移能力更强。通过admscs组和mir-210-admscs组在损伤大鼠的关节腔内注射pkh26标记的admscs，分别在细胞移植后第2天和第6天用荧光共聚焦显微镜观察pkh26标记的admscs的定位，并对迁移至受损部位的细胞进行计数。admscs组和mir-210-admscs组均有pkh26标记的细胞出现，且mir-210-admscs组标记的细胞数明显高于admscs组；注射后第6天，admscs组和mir-210-admscs组均有大量的pkh26标记的细胞出现，且mir-210-admscs组迁移至受损部位的标记的细胞数已高于admscs组100%。间充质干细胞来源于正常脂肪组织，体外培养操作流程规范，获得的间充质干细胞形态均一，且符合细胞表面流式鉴定。对上述获取的间充质干细胞通过转染mir-210，促进了c-met高表达，使mscs在体外向hgf诱导的迁移能力更强，体内向骨组织损伤部位迁移效果更佳，由此，得到了一种具备高迁移能力的间充质干细胞。
2000试剂盒。
[0030] 下腹部抽脂80 ml放入离心管中，用含双抗（青霉素+链霉素）的pbs冲洗3次后，加入等体积0.075%ⅰ型胶原酶，37℃，消化30 min，每5分钟混匀摇动。悬液经pbs洗涤两次后，1500 r/min离心10 min，pbs重悬经70 μm细胞筛网过滤，加入含体积分数10%胎牛血清 的l-dmem培养基，移入培养皿进行原代培养，孵育24小时以后，将非贴壁细胞去除掉，pbs洗瓶一次后，重新添加新鲜原代培养液，置于37℃、5% co2培养箱内，每3天更换一次培养液。待细胞达80%~90％融合时，加入0.25%的胰酶，于37℃下消化，按1: 2比例传代培养。
[0031]
通过流式细胞仪对第四代培养的admscs表面的标记cd34、cd45、cd29、cd90、cd106 (1: 200)进行鉴定。贴壁的细胞胰酶消化后用pbs洗涤，室温孵育上述抗体30 min后，106/ml细胞悬浮液进入流式细胞仪(becton dickinson, usa)进行检测，鉴定确认admscs。
[0032]
pkh26标记admscs：取第四代培养的admscs胰酶消化成单细胞悬液，pbs洗涤一次后离心，去上清，剩余上层液体体积少于25μl。按照pkh26 (sigma公司) 试剂盒说明书在染色前，配置好4
×
10-6
mol/l染色工作液，快速将细胞悬液加入到染色液中充分混匀孵育2~5 min。加入等量血清终止染色反应，孵育1 min后离心弃上清，用10 ml 含血清培养基重悬细胞，移至另一新的离心管中，反复清洗3遍。重悬至实验所需的细胞浓度。细胞涂片，荧光镜下观察细胞标记情况，实现对细胞的标记。
[0033]
mscs形态及表型鉴定参见附图1，根据附图1，生长于l-dmem中的脂肪来源的mscs早期原代培养时，细胞大小形态不均一。培养至第四代以后在倒置显微镜下观察，细胞形态比较均一，生长排列整齐成长梭形，外观类似成纤维细胞样（图1a）。用流式细胞仪对admscs的表面标记进行鉴定，结果发现cd29、cd90和 cd106呈现为阳性，而并不表达造血干细胞的标记cd34 和cd45（图1b）。
[0034]
将第四代的admscs接种于新的6孔板，待融合度生长至70%左右时，按照 lipofectaminetm 2000试剂盒说明对admscs进行mir-210 mimics的转染，获得转染mir-210的间充质干细胞。
[0035]
对比例一种间充质干细胞及其制备方法，采用实施例所述的间充质干细胞的制备方法但不进行mir-210转染，其他条件与实施例相同。
[0036]
性能测试将适量液氮加入到细胞培养皿中，后用蛋白质提取试剂（25 mm tris-hcl, ph 7.2, 150 mm nacl, 1% trion x-100, 1% sodium deoxycholate, 1 mm edta, 0.1% sds, 1% pmsf and 1mm navo3）对液氮处理后的admscs进行裂解。裂解液在4℃，12000 rpm离心5分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移到ep管中，用bca试剂盒(applygen, china)测定蛋白浓度。按按相同蛋白量上样，使用10%聚丙烯酰胺凝胶（sds-page gels）电泳分离蛋白，转移至pvdf膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入gapdh、c-met、p-c-met的一抗（1:1000）孵育过夜，tbst （100 mm tris-hcl, ph 7.4, 150 mm nacl, with 0.1% tween-20），每10分钟洗3遍后，用带辣根过氧化物酶标记二抗（1:3000）室温孵育1 h，再洗3遍，最终采用 ecl，最后用image j软件分析条带灰度值。
[0037]
统计学处理：采用spss11.0统计学软件对实验数据进行统计处理，计量资料以平均数
±
标准误（mean
ꢀ±ꢀ
se）表示。组间采用两样本t检验。p《0.05认为有显著差异性。
[0038]
1、admscs体外迁移实验，admscs向不同浓度不同细胞因子的迁移效应：参照附图2：利用boyden chamber 装置，上室对应每孔加入50 μl（含4
×
104个细胞）用l-dmem悬浮的admscs，下室加入l-dmem稀释后的不同浓度（0、5、25、50和100 ng/ml）的vegf、scf、sdf-1、hgf，每种浓度六个孔，每孔30 μl。完毕后置于培养箱内静止4 h，取出boyden chamber，松开螺帽，取出中间膜。刮去膜上面的细胞，于pbs中轻洗。将膜置于4%多聚甲醛中固定30 min，置于5%结晶紫中染色10 min，自来水漂洗，倒置相差显微镜采用200
×
拍照，每个孔拍六个视野，nih image j软件分析admscs的迁移数量。最终测试结果参照图2。
[0039]
根据图2（a）显示，25、50和100 ng/ml的vegf均诱导了admscs明显的跨膜迁移，vegf在25 ng/ml浓度时诱导了细胞的最大迁移数量。图2（b）显示，scf在25、50和100 ng/ml时都可以显著地引起细胞的迁移，scf在50 ng/ml浓度时诱导了细胞的最大迁移数量。图2（c）显示，sdf诱导的admscs的迁移呈现浓度依赖性，25、50和100 ng/ml的sdf均可以引起细胞的迁移，在100ng/ml时达到了最强的迁移效应。最后一组，50 ng/ml和100 ng/ml 的hgf均诱导了细胞明显的跨膜迁移，50ng/ml时细胞迁移数目最多（图2（d））。此外，我们在上下室均加入（chemokinesis）或不加入（control）50ng/ml的四种因子，发现细胞对的迁移数目无明显差别，两组均明显低于仅下室加50 ng/ml的四种因子的chemotaxis组，这表明这四种细胞因子所诱导的admscs的迁移是通过化学趋化性而非化学机动性引起的。
[0040]
2、不同细胞因子在各自最佳迁移浓度下对admscs迁移能力的影响：参照附图3：根据性能测试1，得到四种细胞因子诱导admscs趋化性迁移的最佳浓度，通过同样的试验方法，对25 ng/ml vegf、50 ng/ml scf、100 ng/ml sdf-1及50 ng/ml hgf诱导admscs的迁移数目进行统计，通过图3对比发现，100 ng/ml sdf-1和50 ng/ml hgf引起的细胞迁移数明显高于其他两种因子，其中50 ng/ml hgf 引起的细胞迁移数量高于100 ng/ml sdf-1组，50 ng/ml scf诱导的迁移细胞数略高于25 ng/ml vegf，但这两组差异均不显著。
[0041]
3、hgf诱导的mscs迁移能力与受体c-met之间的关系测试：参照附图4：在蛋白水平检测不同浓度hgf刺激admscs后c-met的表达，是否与各浓度下hgf诱导的细胞迁移数有一定的关系，最终结果参照附图4。
[0042]
不同浓度（0、25、50、100 ng/ml）的hgf预处理mscs半小时，western blot检测c-met总蛋白及磷酸化水平的表达情况（图4a）。image j定量分析c-met总蛋白及磷酸化的表达水平，以未经hgf处理的mscs中c-met磷酸化的表达水平作为对照，标准化值为1，其他不同浓度的hgf处理的mscs中c-met磷酸化比值与之对比（图4b）。50 ng/ml hgf诱导的细胞迁移和用c-met抑制剂su11274预处理mscs半小时后向50 ng/ml hgf的迁移对比（*p《0.05）（图4c）。
[0043]
根据图4测试结果，western blot显示不同浓度（0、25、50、100 ng/ml）hgf刺激后的admscs中，c-met总蛋白的表达没有显著性的变化。而用50 ng/ml hgf刺激的细胞中磷酸化c-met的表达水平明显高于其他浓度刺激后的表达程度。这种相同浓度（50ng/ml）的hgf引起的细胞最大迁移数量与c-met磷酸化达到最高水平的正相关性，提示了c-met的磷酸化水平与细胞迁移能力密切相关。进一步地，我们用10μmol/l的su11274 （c-met抑制剂）对admscs预处理半小时后，进行细胞迁移实验。结果发现，c-met活性被抑制后大大减少了细
胞向50 ng/ml hgf的迁移数目，充分证明了c-met介导了hgf诱导的mscs的迁移效应。以上证明了可以通过体外人为的基因修饰，来提高胞内c-met的表达含量，进而获得一类定向迁移能力更强的admscs。
[0044]
4、mir-210转入admscs后c-met的表达及细胞迁移能力测试：将实施例与对比例获得的转染mir-210的间充质干细胞，western blot检测c-met的表达情况。测试结果参照附图5。
[0045]
根据图5测试结果，与对比例相比，转染了mir-210的细胞表达磷酸化的c-met水平有显著性增加（图5a、b）。进一步地，用50 ng/ml的hgf分别诱导未转染的admscs（对比例）和经mir-210转染的admscs（实施例）进行细胞迁移实验。结果发现，转染了mir-210的实施例细胞迁移数量明显的高于对比例（图5c）。这证明了，我们通过体外mir-210的修饰后，获得了一种具备高定向迁移能力的admscs。
[0046]
5、实施例与对比例细胞迁移能力在软骨损伤模型中的测试：sd大鼠股骨髁骨软骨缺损模型建立：雄性sd大鼠（4周龄）采用3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后碘伏消毒。在右膝的髌骨右侧做长约1 cm的纵向切口，内侧切开关节囊及股四头肌肌腱，暴露股骨髁滑车，在股骨髁滑车正中间采用直径为1 mm的角膜环钻取直径1 mm，深1 mm的骨软骨缺损，完成后将髌骨复位，缝合关节囊。术后大鼠行常规饲养。
[0047]
30只sd大鼠随机平分为三组。对照组：单纯切开关节囊，缝合后关节腔内注射5
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106个pkh26标记的admscs；对比例：软骨缺损模型完成后，受损处注射5
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106个pkh26标记的admscs（记为admscs组）；实施例：软骨缺损模型完成后，受损处注射5
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106个pkh26标记的mir-210转染后的admscs（记为mir-210-admscs）。
[0048]
荧光共聚焦显微镜下观察admscs在软骨损伤部位的定位：三组均在细胞移植后第2天和第6天收集右侧股骨髁，将受损区进行冰冻切片，荧光共聚焦显微镜下观察pkh26标记的admscs的定位情况。
[0049]
向对照组、对比例admscs组和实施例mir-210-admscs组大鼠的关节腔内注射pkh26标记的admscs，分别在细胞移植后第2天和第6天用荧光共聚焦显微镜观察pkh26标记的admscs的定位，并对迁移至受损部位的细胞进行计数，测试结果参照附图6。
[0050]
根据图6测试结果，对照组未损伤的大鼠关节腔内未见明显红色荧光细胞。注射后第2天，admscs组和mir-210-admscs组均有pkh26标记的细胞出现，且mir-210-admscs组标记的细胞数明显高于admscs组；注射后第6天，对照组仍未出现标记细胞，而admscs组和mir-210-admscs组均有大量的pkh26标记的细胞出现，且mir-210-admscs组标记的细胞数仍明显高于admscs组。
[0051]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
技术特征：1.一种间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞内转染mir-210。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞为人源脂肪间充质干细胞。3.一种权利要求1或2所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：取培养至第四代的间充质干细胞接种至孔板，待融合度生长至80~90%时，进行mir-210 mimics的转染。4.根据权利要求3所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述的间充质干细胞培养方法为：含有间充质干细胞的人脂肪经冲洗和细胞筛网过滤获得间充质干细胞，加入含胎牛血清的l-dmem培养基，移入培养皿进行原代培养，去除非贴壁细胞并用pbs缓冲液洗瓶，重新添加新鲜原代培养液，培养至细胞达80%~90％融合时，加入胰酶消化，按1: 2比例传代培养。5.根据权利要求4所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述的含有间充质细胞的人脂肪用含青霉素与链霉素的pbs冲洗1~5次后，加入等体积0.075%ⅰ型胶原酶，37℃，消化30 min，每5分钟混匀摇动；6. 悬液经pbs洗涤两次后，1500 r/min离心10 min，pbs重悬经70 μm细胞筛网过滤。6.根据权利要求4所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述的胎牛血清在l-dmem培养基中的体积分数为10%。7.根据权利要求6所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述的添加新鲜原代培养液后，置于37℃、5% 二氧化碳浓度培养箱内，每3天更换一次培养液，进行培养。
技术总结一种间充质干细胞及其制备方法，属于间充质干细胞迁移能力提升方法技术领域。现有技术中，移植后的MSCs真正有效迁移至损伤或肿瘤部位的数量极少，从而严重影响了受损部位及肿瘤的修复效果，成为MSCs临床移植中的最大瓶颈。本发明的间充质干细胞来源于正常脂肪组织，体外培养操作流程规范，获得的间充质干细胞形态均一，且符合细胞表面流式鉴定。对上述获取的间充质干细胞通过转染miR-210，促进了c-Met高表达，使MSCs在体外向HGF诱导的迁移能力更强，体内向骨组织损伤部位迁移效果更佳，由此，得到了一种具备高迁移能力的间充质干细胞。到了一种具备高迁移能力的间充质干细胞。
技术研发人员：梅景顺 刘超 郑兵 曹玉福 荣大千
受保护的技术使用者：山东灵犀生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.19
技术公布日：2022/7/5
