1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法。
背景技术：2.多聚磷酸盐(polyphosphate，poly p)作为一种广泛存在的线性多聚体，由几个至数百个磷酸盐残基通过与atp磷酸酐键相同的的高能磷酸键相互聚合形成。近年来研究发现，poly p不仅是生物体中不可或缺的生物能和磷酸基团储存库、负电荷密度高的生物大分子，还在微生物中参与调节基因表达、调控细菌离子通道和dna摄取、代谢等，并与哺乳动物中瞬时电位的调节、线粒体代谢、细胞钙化等生理过程有着密切的关系。
3.聚磷酸盐激酶1(polyphosphate kinase 1，ppk1)是poly p合成代谢的关键酶。ppk1通过催化atp末端的磷酸基团转移到磷酸盐上而形成多聚磷酸盐这一可逆反应的发生，从而将磷酸盐聚集形成多聚磷酸盐。此外，ppk1还是生产腺嘌呤核苷酸(amp)、鸟嘌呤核苷酸(gmp)、胞嘧啶核苷酸(cmp)、尿嘧啶核苷酸(ump)、胸腺嘧啶核苷酸(tmp)等产品都会用到的一种酶。因此，ppk1具有广阔的应用前景，市场需求较大。
4.但是，现有ppk1的酶活一般在650u/mg左右，仍有待进一步的提高；并且ppk1对ph控制较为严格，在生产5＇-单磷酸核苷酸(特别是腺苷单磷酸)时，ppk1和腺苷激酶的最适ph不同但需要混合投料，这进一步影响了ppk1在实际应用中酶活的发挥。此外，目前还很少见有实现工业化发酵生产ppk1的报道。
技术实现要素：5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法。本发明通过对聚磷酸盐激酶1进行突变处理得到聚磷酸盐激酶1突变体，提高了聚磷酸盐激酶1的酶活；并构建了聚磷酸盐激酶1突变体的发酵生产体系，实现了聚磷酸盐激酶1突变体的工业化生产。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，包括以下步骤：
8.(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，ph为6.8-7.2，溶氧(do)为20-40％；发酵培养至发酵液稀释100倍后的od
600
值为0.40-0.60时，降温至21-23℃，向体系中加入iptg进行诱导培养，诱导培养20-24h；
9.培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/l时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5-1.0g/l；
10.(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。
11.优选的，步骤(1)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌由如下方法构建而成：
12.将pqe-60质粒用bspeⅰ和aflⅲ双酶切，再连接上序列如seq id no.5所示的片段，构建得到质粒pqe-n，所述质粒pqe-n的核苷酸序列如seq id no.6所示；用accⅲ和sphⅰ对质粒pqe-n双酶切，再将编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pqe-ppk1，所述重组表达载体pqe-ppk1的核苷酸序列如seq id no.7所示；
13.将获得的重组表达载体pqe-ppk1导入到大肠杆菌中，构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
14.优选的，步骤(1)中，聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的4-8％。
15.优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：蛋白胨2.5g/l、脱脂豆粉20g/l、葡萄糖5g/l、甜菜糖蜜5g/l，酵母膏8g/l、氯化钠3g/l、硫酸铵2.5g/l、三水磷酸氢二钾4g/l、柠檬酸铁铵0.3g/l、柠檬酸2.1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氨苄青霉素100ppm。
16.优选的，步骤(1)中，加入iptg，使iptg在体系中的终浓度为0.2mmol/l。
17.优选的，步骤(1)中，所述补料的组成为：葡萄糖200g/l、甜菜糖蜜200g/l、酵母膏80g/l、脱脂豆粉60g/l。
18.优选的，步骤(2)中，采用均质机进行破菌处理，均质处理的条件为：均质压力12,000psi，均质流量200-300l/hr。
19.优选的，步骤(2)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
20.本发明的有益效果：
21.(1)本发明首先对大肠杆菌聚磷酸盐激酶1进行了突变改造处理，将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的l突变为p，第247位的m突变为v，获得了聚磷酸盐激酶1突变体。本发明的聚磷酸盐激酶1突变体具有如下突出的优势：
22.①
本发明的聚磷酸盐激酶1突变体的酶活性达800-850u/mg，与野生型聚磷酸盐激酶1相比，酶活提高了23％-33％。
23.②
本发明的聚磷酸盐激酶1突变体对ph的适应范围广，能够在ph5.0-ph9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
24.③
本发明的聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性增加，酶的溶解度上升，更有利于酶的工业化应用。
25.(2)本发明还对聚磷酸盐激酶1突变体的发酵培养基、发酵培养条件以及诱导培养条件进行了优化。其中，本发明的发酵培养基选择糖蜜作为碳源之一，具有以下好处：
26.①
含有高浓度的腐熟型有机质、腐殖酸、生化类黄腐酸、氨基酸、高吸收率的npk；
27.②
含有在发酵过程中产生的ugf；
28.③
降低粉尘及颗粒料的粉化率，减少了损失；
29.④
促进菌体生长，改善部分生产性能；
30.⑤
降低成本，糖蜜比葡萄糖便宜一半左右。
31.加入少量柠檬酸能减少菌种延滞期时间；加入脱脂豆粉、酵母膏都可降低成本。
32.综上，本发明通过生产菌的构建和发酵工艺的优化，实现了聚磷酸盐激酶1突变体的规模化、工业化生产，并显著提高了聚磷酸盐激酶1的酶活。
附图说明
33.图1：通过分子动力学模拟软件分析野生型聚磷酸盐激酶1的亲水性。
34.图2：通过分子动力学模拟软件分析聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性。
35.图3：质粒pqe-n的结构示意图。
36.图4：重组表达载体pqe-ppk1的结构示意图。
37.图5：琼脂糖凝胶电泳验证图；泳道m：marker；泳道1：pqe-n；泳道2：pqe-ppk1双酶切。
38.图6：诱导表达后蛋白的sds-page检测结果；图中，m：marker；泳道1：未添加诱导剂iptg；泳道2-7：分别为诱导表达6h、8h、10h、12h、14h、16h的检测结果。
39.图7：纯化蛋白的western blot检测结果。
40.图8：聚磷酸盐激酶1突变体与野生型聚磷酸盐激酶1的酶活与ph之间的关系；图中，1为聚磷酸盐激酶1突变体，2为野生型聚磷酸盐激酶1。
具体实施方式
41.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
42.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
43.本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业渠道购买得到。其中：
44.本实施例和对比例中所使用的大肠杆菌为，菌株名称为e.coli k-12(atcc 25404)。
45.一级种子培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，氨苄青霉素100ppm。
46.二级种子培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，氨苄青霉素100ppm。
47.发酵培养基：蛋白胨2.5g/l、脱脂豆粉20g/l、葡萄糖5g/l、甜菜糖蜜5g/l，酵母膏8g/l、氯化钠3g/l、硫酸铵2.5g/l、三水磷酸氢二钾4g/l、柠檬酸铁铵0.3g/l、柠檬酸2.1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氨苄青霉素100ppm。
48.补料：葡萄糖200g/l、甜菜糖蜜200g/l、酵母膏80g/l、脱脂豆粉60g/l。
49.上述培养基中所使用的原料均为市售产品，其中所使用的“脱脂豆粉”为低温脱脂的黄豆粉，购自山东万德福生物科技有限公司。
50.实施例1：聚磷酸盐激酶1突变处理
51.发明人从现有数据库中获得野生型聚磷酸盐激酶1氨基酸序列如seq id no.1所示；编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。对其进行拓扑并分析，构建盒子，在charmm力场下进行能量最小化，然后进行nvt平衡和npt平衡，对成品进行1ns的md模拟，最终选择将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的l突变为p，第247位的m突变为v；突变后的聚磷酸盐激酶1突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
52.通过分子动力学模拟软件分析突变前后聚磷酸盐激酶1的亲水性，结果分别如图1和图2所示。结果表明：突变后的聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性提高。
53.实施例2：聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的构建
54.(1)对pqe-60质粒用bspeⅰ和aflⅲ双酶切，再连接上序列如下的大小为124bp的片段
55.tccggactcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaagcatgc；(seq id no.5)
56.构建得到质粒pqe-n(结构示意图如图3所示)，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
57.(2)用accⅲ和sphⅰ对质粒pqe-n双酶切，把优化后的编码聚磷酸盐激酶1突变体的ppk1基因(核苷酸序列如seq id no.4所示)连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pqe-ppk1(结构示意图如图4所示)，其核苷酸序列如seq id no.7所示。
58.将构建的重组表达载体pqe-ppk1用accⅲ和sphⅰ两个酶进行酶切验证，结果如图5所示。结果表明：ppk1基因(seq id no.4所示)已成功整合到质粒pqe-n上。
59.(3)将构建的重组表达载体pqe-ppk1导入到到大肠杆菌中，获得转化子。将转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb平板上涂布，挑出能够长的单菌落，将其作为阳性转化子。
60.将阳性转化子接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，33℃培养至od
600
＝0.6，缓慢降温至22℃，加入iptg(使iptg的终浓度为0.2mmol/l)，诱导培养16h。诱导培养结束后，超声破菌，离心，分离上清液，进行sds-page验证，其结果如图6所示。在80.3kda处有表达条带，与外源插入的目的基因ppk1所表达蛋白的理论计算得到的分子量一致。
61.采用his-镍亲和层析柱对目的蛋白进行分离纯化，得到的纯化蛋白。对纯化蛋白进行western blot检测，结果如图7所示。
62.由图7可以看出，采用本发明的聚磷酸盐激酶1突变体生产菌可以成功表达聚磷酸盐激酶1突变体。
63.由此证明：本实施例已成功构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
64.实施例3：聚磷酸盐激酶1突变体的发酵生产
65.(1)菌种活化：
66.将实施例2构建的聚磷酸盐激酶1突变体生产菌划线接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板中，33℃、培养12h。
67.(2)一级种培养：
68.从平板划取1接种环菌体接到一级种子培养基中，33℃、ph7.0，培养16h。
69.(3)二级种培养：
70.以1％(体积分数)接种量，将一级种子液接种于二级种子培养基中，33℃、溶氧(do)30-40％，培养至od
600nm
值0.3(稀释100倍)。
71.(4)发酵培养：
72.以4％接种量(即二级种子液的接入量为发酵培养基重量的4％)，将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的二级种子液接种至发酵罐(10t发酵罐)中进行发酵培养，发酵培养的温度为33℃，ph为6.8-7.2，溶氧(do)为20-40％；发酵培养至发酵液稀释100倍后的od
600
值为0.5
时，降温至22℃，向体系中加入iptg至终浓度为0.2mmol/l进行诱导培养，诱导培养22h；
73.培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/l时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5-1.0g/l。
74.(5)诱导培养结束后进行放罐，将放罐后的发酵液采用均质机进行破菌处理，均质处理的条件为：均质压力12,000psi，均质流量300l/hr；均质处理后离心，分离上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。
75.上述发酵生产过程中，溶氧(do)采用溶氧电极测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。od
600
和ph值采用取样测定。
76.对比例1：
77.将seq id no.2所示的ppk1基因通过常规基因工程的手段整合到质粒pqe-n中，构建得到重组表达载体；然后将构建的重组表达载体导入到大肠杆菌中，获得转化子，筛选阳性转化子，并进行验证，构建得到生产菌a。
78.利用构建的生产菌a，按实施例3的发酵生产条件进行培养，为节省成本，将发酵罐的体积调整成10l，发酵罐中发酵培养基的添加量按比例相应的进行调整，生产得到培养液a。
79.对比例2：
80.将优化后的编码聚磷酸盐激酶1突变体的ppk1基因(核苷酸序列如seq id no.4所示)通过常规基因工程的手段整合到质粒pqe-60中，构建得到重组表达载体；然后将构建的重组表达载体导入到大肠杆菌中，获得转化子，按实施例3的方法筛选阳性转化子，并进行验证，构建得到生产菌b。
81.利用构建的生产菌b，按实施例3的发酵生产条件进行培养，为节省成本，将发酵罐的体积调整成10l，发酵罐中发酵培养基的添加量按比例相应的进行调整，生产得到培养液b。
82.对比例3：
83.将实施例3中的发酵培养基的组成调整为：
84.蛋白胨12g/l、葡萄糖10g/l、酵母膏8g/l、氯化钠3g/l、硫酸铵2.5g/l、三水磷酸氢二钾4g/l、柠檬酸铁铵0.3g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氨苄青霉素100ppm。
85.将补料的组成调整为：葡萄糖40g/l、蛋白胨30g/l、酵母膏100g/l。
86.将发酵罐的体积调整成10l，发酵罐中发酵培养基的添加量按比例相应的进行调整。
87.培养过程中监测体系的葡萄糖含量。
88.其与条件同实施例3，生产得到培养液c。
89.试验例1：
90.对实施例3的到培养液，以及对比例1-对比例3得到的培养液a-培养液c中的蛋白进行纯化。计算目的蛋白的表达量并对目的蛋白的酶活进行检测。其中：
91.目的蛋白的纯化方法如下：
92.加样至预先用结合缓冲液(20mmol/lna2hpo4，500mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)平衡的his-镍亲和层析柱。用洗涤缓冲液a(20mmol/l na2hpo4，500mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)和洗涤缓冲液b(20mmol/l na2hpo4，
500mmol/l nacl，30mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液(20mmol/l na2hpo4，500mmol/lnacl，500mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)洗脱目的蛋白，收集洗脱液，得到纯化蛋白。
93.目的蛋白的酶活检测方法如下：
94.参考“多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定”(中国生物制品学杂志，2020年5月第33卷第5期)的方法对不同生产菌在相同条件下培养后得到的上清液中的聚磷酸盐激酶1的酶活进行检测，具体检测方法如下：
95.根据dapi染色法，在波长为415nm处激发，550nm处检测dapi-polyp复合物的荧光，测定ppk催化生成的polyp含量，从而计算出ppk酶活性浓度。
96.酶催化作用反应体系：50mmol/lhepes-koh(ph 7.2)，40mmol/l硫酸铵，4mmol/lmgcl，22mmol/l磷酸肌酸，20μg/ml肌酸激酶，10μgppk。37℃孵育15或30min加入40mmol/ledta终止反应，使用10umol/l dapi与纯化蛋白酶按1：1混合，于415nm处激发550nm处测定每个反应重复3次。以不同反应条件得到的最大值为蛋白酶活性。配制1000、500、250、125、62.5、0ng/ml系列浓度的polyp标准品采用dapi染色法测定以poly p标准品浓度为横坐标以荧光强度为纵坐标建立poly p标准曲线，根据poly p标准曲线计算polyp的浓度取均值并按下式计算酶活性。ppk酶活性(u/mg)定义为在测定条件下每分钟每毫克酶催化1pmol磷酸盐掺入poly p中的量。
97.酶活性(u/mg)＝poly p(pmol/l)*v/(m*t)
98.式中v为反应总体积(l)，m为待测酶的质量(mg)，t为反应时间(min)。
99.结果见表1。
100.表1：
101.组别聚磷酸盐激酶1的表达量聚磷酸盐激酶1的酶活(u/mg)实施例332g/l800-850对比例130g/l630-645对比例215g/l800-850对比例313g/l800-850
102.试验例2：
103.将试验例1中得到的纯化蛋白(即聚磷酸盐激酶1突变体和野生型聚磷酸盐激酶1)在不同ph条件下测试其酶活，酶活测定方法参考试验例1。
104.结果如图8所示，结果表明：与野生型聚磷酸盐激酶1相比，本发明的聚磷酸盐激酶1突变体对ph的适应范围广，能够在ph5.0-ph9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
105.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。
技术特征：1.一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，ph为6.8-7.2，溶氧为20-40％；发酵培养至发酵液稀释100倍后的od
600
值为0.40-0.60时，降温至21-23℃，向体系中加入iptg进行诱导培养，诱导培养20-24h；培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/l时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5-1.0g/l；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌由如下方法构建而成：将pqe-60质粒用bspeⅰ和aflⅲ双酶切，再连接上序列如seq id no.5所示的片段，构建得到质粒pqe-n，所述质粒pqe-n的核苷酸序列如seq id no.6所示；用accⅲ和sphⅰ对质粒pqe-n双酶切，再将seq id no.4所示的编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pqe-ppk1，所述重组表达载体pqe-ppk1的核苷酸序列如seq id no.7所示；将获得的重组表达载体pqe-ppk1导入到大肠杆菌中，构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的4-8％。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：所述发酵培养基的组成为：蛋白胨2.5g/l、脱脂豆粉20g/l、葡萄糖5g/l、甜菜糖蜜5g/l，酵母膏8g/l、氯化钠3g/l、硫酸铵2.5g/l、三水磷酸氢二钾4g/l、柠檬酸铁铵0.3g/l、柠檬酸2.1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氨苄青霉素100ppm。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入iptg，使iptg在体系中的终浓度为0.2mmol/l。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述补料的组成为：葡萄糖200g/l、甜菜糖蜜200g/l、酵母膏80g/l、脱脂豆粉60g/l。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
技术总结本发明公开了一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，包括以下步骤：(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
技术研发人员：岳明瑞 谢沛 曹华杰 郭永胜
受保护的技术使用者：新泰市佳禾生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/5
