地黄品种遗传关系、种类鉴别用分子标记ssr引物、试剂盒、应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及地黄品种遗传关系、种类鉴别用分子标记ssr引物、试剂盒、应用。
背景技术：2.地黄(rehmannia glutinosa libosch.)为玄参科(scrophulariaceae)地黄属(rehmanniaceae) 多年生草本植物，其根茎肉质，鲜时呈黄色，因而得名。地黄在我国主要分布在河南、河北、山东、天津、陕西、山西、四川、安徽、以江浙等地区。作为一种传统大宗中药材，地黄具有清热凉血、养阴生津的功效。现代药理学研究表明地黄在提高机体免疫力、抗癌、防癌等方面都具有积极作用。
3.我国最早地黄栽培品种记载见于一千余年前的《图经本草》，第一个近代地黄品种是崔大毛1917年选育的四齿毛，李开寿随后培育的金状元在很长一段时间内都是国内的主栽品种，同一时期较为著名的农家品种还有小黑英、郭里锚、邢疙瘩等。建国后，来自中国医学科学院药用植物所、河南温县农科所等单位选育出了以北京1号、北京3号和85-5 系列的现代地黄品种，这些现代品种在生产中逐渐取代了早期的农家种，开始占据地黄生产中的主导地位。但是随着审定品种数量的增多，特别是通过无性突变选育的品种大量出现，使得地黄品种的遗传基础狭窄、亲本材料来源单一、形态相似度高等问题开始凸显。品种验真、资源鉴定仍靠形态学差异和简单的理化测定，传统的表型特征区分品种受环境影响大，且性状鉴定易受主观影响，准确度不高，对于亲缘关系较近的品种鉴别能力差，严重限制了地黄遗传改良和品种更新。同时，缺乏有效的分子鉴定手段还将导致外形相似的品种在生产中难以提纯、去杂，导致药材产量和质量产生较大的波动，制约了地黄功效发挥。因此，了解不同品种地黄的亲缘关系，开发有效的分子鉴定方法区分栽培品种，丰富地黄优良性状是目前迫切需要解决的问题。
4.为克服品种间表型区分难题，分子标记被逐渐被应用于地黄的多样性分析和亲缘聚类研究。地黄作为我国传统中药材，拥有深厚的栽培和药用历史积淀。但其研究基础相比大田作物及其它模式植物，则明显滞后，目前地黄品种的分子鉴定研究基本以rapd、aflp、 srap及issr引物为主。1997年，choi首次使用rapd(random amplified polymorphicdna)标记技术对愈伤组织产生的地黄单株进行遗传多样性分析；hatano在一年也使用 rapd标记技术对茎尖快繁的地黄品种和fl代杂种的遗传背景进行了检测；陈京荔等利用20个rapd引物将19个地黄品种按照亲缘关系划分成4个亚类；yuan等用aflp (amplified fragment length polymorphism)分析新加坡市场上销售的地黄基因型与有效成份的关系；周延清等首先对怀地黄issr(inter-simple sequence repeat)扩增的体系进行了优化，然后利用rapd与issr技术对8个品种地黄和2个脱毒品系进行了遗传多样性分析；利用同样的引物组合，周延清等还对怀地黄“85-5”品种的16个单株的遗传多样性进行分析；吴志刚等利用rapd对16个栽培地黄品种、2个野生居群进行了亲缘关系和遗传特点分析。。石海霞等采用
10对srap标记对21个地黄种植进行遗传多样性分析，发现地黄种质遗传多样性水平为中等偏低水平；赵楠等使用issr标记分析了地黄居群间的基因流和进化关系。
5.上述研究受限于标记种类、数量及检测技术，其分析结果基本局限于对品种或居群进行遗传多样性评价和聚类，未实现对单个品种的特异鉴别，无法构建品种的指纹图谱。ssr (simple sequence repeats，微卫星序列即简单重复序列)分子标记技术是一种具有共显性遗传、多态性好、对dna浓度要求低的dna分子标记，广泛应用于品种鉴定、遗传分析和指纹图谱构建等方面。因此，需要研究开发出能够实现对单个地黄品种特异鉴别的ssr 分子标记，为构建品种的指纹图谱，对明确地黄品种间遗传关系、遗传和性能评估、品种选育等提供更科学的依据。
技术实现要素：6.为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供地黄品种遗传关系鉴别用分子标记ssr引物，能够实现对17个黄淮地区地黄品种遗传关系的鉴别，明确不同品种之间的遗传关联性，为品种选育提供科学依据。
7.本发明的之二在于提供地黄品种种类鉴定用分子标记ssr引物，能够实现dna水平上对17个黄淮产区地黄品种的区分鉴别。
8.本发明的目的之三在于提供一种地黄品种遗传关系鉴别用试剂盒，包括本发明提供的 ssr引物，实现对17个黄淮地区地黄品种遗传关系的鉴别。
9.本发明的目的之四在于提供一种地黄品种鉴别用试剂盒，包括本发明提供的ssr引物，实现17个黄淮地区地黄品种在dna水平上的鉴别。
10.本发明的目的之五在于提供本发明ssr引物在地黄品种遗传关系鉴别、种类鉴定、绘制遗传图谱、构建ssr指纹图谱方面的应用。
11.为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
12.地黄品种遗传关系鉴别用分子标记ssr引物，所述引物包含50对引物，所述引物序列如seq id no.1～100所示。
13.地黄品种种类鉴定用分子标记ssr引物，所述引物包括15对引物，所述引物序列如 seq id no.1～30所示。
14.本发明具体实施方式中验证，采用本发明提供的50对ssr引物分别对黄淮地区来自野生、农家种、主栽品种的17份种植资源的dna进行扩增，对其扩增结果进行分析，通过遗传关系聚类分析，以及计算不同品种两两品种间的遗传相似度，结果显示，17个品种间遗传相似系数变幅在0.552-0.984，平均值为0.729，显示品种间遗传背景相近的趋势；通过比较不同品种间平均遗传相似系数的大小，明确不同品种之间的衍生关系、遗传差异、演进关系等，能够为育种选育提供科学的依据。
15.本发明具体实施方式中验证，采用本发明提供的15对ssr引物分别对黄淮地区来自野生、农家种、主栽品种的17份种植资源的dna进行扩增，能够通过不同引物对之间扩增产物的差异组合精确区不同的地黄品种，同时本发明ssr引物还具有以下有益效果：
16.1、不同ssr引物两两组合或者更多组合，明确每个品种特异扩增片段组合，兼顾了检测的稳定性和便捷性；
17.2、15对引物扩增片段大小在107bp-354bp之间，普遍具备了扩增稳定、重复性好、
带型判读简单的特点；
18.3、15对ssr引物均可实现在17个品种间的多峰扩增，稳定性、多态性、分辨率好，将17个品种的特异性扩增片段组合在一起即可构成了其ssr指纹图谱。
附图说明
19.图1为17个地黄品种的遗传关系聚类分析图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
21.1、下述实施例采用的地黄品种材料：
22.17个地黄品种分别为：北京3号、怀丰、吨王、脱毒北京3号、怀中1号、金线钓鱼、金九、小黑英、野生1号、沁怀、85-5、太空育种、红薯王、大田选育野生、野生2号、金九野生、修武野生，以上地黄品种统一种植于武陟县大封镇驾部村，并由河南中医药大学药学院董诚明教授经过连续多年的提纯和鉴定，品种名称正确无误，各品种纯合、无杂株。每个品种种植小区面积1m2，小区间隔60cm，种栽于5月初以条播方法种植，行距30cm，株距30cm；所有品种于7月采摘幼嫩叶片，新鲜叶片经干冰处理后，置超低温冰箱保存备用。
23.2、下述实施例采用的试剂：
24.pcr扩增用的常规引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；m13荧光引物由美国赛默飞科技公司合成；dntp(10pmol/μl)购自上海生物工程技术服务有限公司；buffer (10x)、taq酶(2.5u/μl)购自天根生化科技有限公司；甲酰胺、pcr板、封膜、liz500 内标、pop7胶购自美国赛默飞科技公司。
25.3、下述实施例采用的仪器：
26.pcr仪为德国eppendorf公司的mastercycler pro s(eppendorf ag,hamburg, germany)；样品研磨利用jxfstprp-64l型研磨仪(上海净信实业发展有限公司)；离心机采用avanti jxn-26型离心机(美国贝克曼公司)；微量分光光度计测定dna浓度(美国， thermofisher公司，型号nd-1000)；abi3730遗传分析系统(美国赛默飞科技公司)用于检测电泳产物。
27.实施例1
28.本实施例提供50对ssr引物，其序列如seq id no.1～100。
29.实施例2pcr反应
30.2.1样品采集与dna提取
31.上述17个品种的每个品种选取长势和大小一致的地黄3株，每株选取幼嫩叶片3～5 片干冰暂存，ctab法提取总dna，0.8％琼脂糖电泳和微量分光光度计测定dna的纯度和浓度，所有样品稀释至50ng/μl，-20℃保存、备用；
32.2.2合成tp-m13-ssr引物的制备
33.合成上述实施例1提供的50对ssr引物序列，所有引物对的上游引物5端连接m13 序列(acacgacgttgtaaaacgac)形成50对tp-m13引物，序列结果如下表1所示，其中下划线标
识m13序列，将引物稀释至1pm/μl(上游)和10pm/μl(下游)备用；在 m13序列分别引入fam、pet、vic和ned荧光基团提供四种荧光引物，稀释至10pm/μl 备用。
34.表1
35.36.[0037][0038]
2.3pcr反应和扩增
[0039]
利用上述50对tp-m13引物对上述提取的17个品种的每个品种的dna在上述提供的pcr仪上进行扩增；
[0040]
pcr反应体系：dna 2.0μl，buffer(10x)1.2μl，dntp(10pmol/μl)0.2μl，上游引物(1pm/μl)1.0μl，下游引物(10pm/ul)0.38μl，m13荧光引物(10pm/ul)0.28μl， taq酶(2.5u/μl)0.1μl，无菌水6.84μl，总体积为12.0μl。pcr扩增程序为：95℃变性5min，94℃变性30s，68-58℃或65-55℃或62-52℃(视引物具体退火温度而定)退火60s，72℃延伸45
–
60s，36个循环；最终72℃延伸10min。
[0041]
实施例3pcr产物分析与数据处理
[0042]
3.1电泳检测
[0043]
首先将实施例2获得的对应各个品种的pcr产物进行电泳检测，具体步骤包括，将 fam、pet、vic和ned荧光标记的pcr产物用按照2:4:2:2的比例混合均匀后，从混合液中吸取1μl加入到dna分析仪专用深孔板孔中，板中各孔分别加入0.1μl liz500分子量内标和8.9μl去离子甲酰胺；将样品在pcr仪上温度95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上，瞬时离心10s后置放到dna分析仪上(abi3730)；
[0044]
3.2结果分析
[0045]
3.2.1品种间聚类分析
[0046]
50对ssr引物扩增片段进行汇总后，利用软件tassel3.0和fig tree(v 1.4.3)对地黄品种进行聚类分析和作图，如图1所示，两个材料间所有直线的长度和为其遗传距离。结果显示，17个地黄品种共分为3个一级群，分别是怀中1号(亚群ⅰ)、怀丰、吨王和金线钓鱼(亚群ⅱ)，以及剩余的13个品种(亚群iii)。北京3号和脱毒北京3号，(亚群iv)。亚群ⅱ的三个品种均为当地的地方品种，其中，吨王和金线钓鱼两个地方亲缘关系较近；在亚群iii的13个品种中，北京3号和脱毒北京3号聚为一个二级分群，剩余的11个品种中，金九单独为一个3级分支，另外10个品种归为一个分支，其中，小黑英、金九野生、修武野生、野生2号和大田选育野生聚为一个4级分支，野生1号、沁怀、红薯王、太空育种和85-5归为另一个4级分
支。小黑英所在的分群中，小黑英为5级分支，野生2号、大田选育野生、金九野生与修武野生，分别归属于6级分支。沁怀和85-5所在的分群中，地方品种沁怀自成一个分类，剩余4个品种中，野生1号单独归为6级分类，红薯王为7 级分类，85-5和太空育种作为亲缘关系最近的2个材料。
[0047]
3.2.2品种间遗传相似性分析
[0048]
品种的遗传相似系数(genetic similarity，gs)根据公式：gs＝m/(m+n)计算，m表示基因型间共有带型数目，n为基因型间差异带型数目；
[0049]
计算结果如下表2所示：
[0050]
表2
[0051]
[0052][0053][0054]
对上述表2所示的各个品种的遗传相似系数的极值进行统计，结果如下表3所示：
[0055]
表3
[0056][0057]
由上述表2和表3所示的结果可知，17个品种间遗传相似系数最大为0.984，最小为0.552，平均值为0.729，表明黄淮产区地黄品种遗传背景较为相近。两两品种间遗传相似系数均数的变幅为0.65(金九野生)-0.791(脱毒北京3号)。5个野生地黄中选育的品种中金九野生和修武野生相似度达到0.904，大田选野生和野生2号为0.96，只有野生1号呈现较好的遗传多样性。总体看，这5个品种的品种间平均遗传相似系数显著低于品种整体均值，显示出较好的遗传差异，为下一步地黄品种遗传背景的拓宽指明了方向。剩余的12个品种中，脱毒北京3号、怀中1号和北京三号相互亲缘关系最近，显示了3个品种中存在明显的衍生关系，该结果与怀中1号育种人董诚明教授结论一致；所有品种中，太空育种和85-5的遗传相似系数达0.98，表明了二者间存在紧密的演进关系；地方品种小黑英和沁怀是12个品种中拥有和野生来源品种相似平均遗传相似系数的品种，表明在目前的品种选育中，利用率较低，但二者都显示了较好的生产抗逆特性，可以在今后的育种中加以重点利用。
[0058]
3.2.3品种特异性片段和指纹图谱构建
[0059]
分析毛细管电泳结果：使用genemarker(v2.2.0)对测序结果进行分析，将每个tp-m13-ssr引物针对每个样品的扩增片段长度，通过对50对ssr引物特异片段大小的比较和其在17个品种间分布情况的分析，发现单一引物无法实现对全部品种的区分，而多个引物组合可将每个品种鉴别，在将50对引物进行多态性冗余去除后，结合检测的稳定性和可靠度(每个品种有2个以上引物实现鉴定)，最终选取15对ssr引物，如seqidno.1～30所示，即可实现对17个品种的特异性区分，即每个品种都具有了特异扩增片段组合，具体选取的该15对ssr引物对每个样品的扩增片段长度记录结果如下表4所示：
[0060]
表4
[0061]
[0062][0063]
由上概述表4所示的结果可知，采用本发明提供的15对ssr引物扩增每个品种，扩增片段大小在107bp-354bp之间，普遍具备了扩增稳定、重复性好、带型判读简单的特点，15对ssr引物均可实现在17个品种间的多峰扩增，其中引物p14是扩增片段数最多的引物，p14在17个品种间多态性最好。
[0064]
同时，每个品种都具有了特异扩增片段组合，将17个品种的特异扩增片段组合在一起就构成了其ssr指纹图谱；ssr引物的多态性信息量利用公式pic(polymorphicinformationcontent)＝1-∑fi2计算，fi为i位点的基因频率；标记索引系数(markerindex,mi)根据公式mi＝等位基因数*pic计算；ssr引物的dp(discriminatorypower)表示每对ssr引物能分辨品种的最大值；计算结果如下表5所示：
[0065]
表5
[0066][0067]
由上述表5所示的结果可知，采用本发明提供的15对srr引物能够构建17个品种的指纹图谱，实现对17个品种在dna水平上的鉴别。
[0068]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：1.地黄品种遗传关系鉴别用分子标记ssr引物，其特征在于，所述引物包含50对引物，所述引物序列如seq id no.1～100所示。2.地黄品种种类鉴定用分子标记ssr引物，其特征在于，所述引物包括15对引物，所述引物序列如seq id no.1～30所示。3.地黄品种遗传关系鉴别用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的ssr引物。4.地黄品种种类鉴定用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的ssr引物。5.一种如权利要求1所述的ssr引物在地黄品种遗传关系鉴别、绘制遗传图谱中的应用。6.一种如权利要求2所述的ssr引物在地黄品种种类鉴定、构建ssr指纹图谱中的应用。
技术总结本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及地黄品种遗传关系、种类鉴别用分子标记SSR引物、试剂盒、应用。采用本发明提供的50对SSR引物分别对黄淮地区17份种植资源的DNA进行扩增，通过聚类分析和遗传相似度分析，明确不同品种之间的衍生关系、遗传差异、演进关系等，能够为育种选育提供科学的依据。同时，采用本发明提供的15对SSR引物，能够通过不同引物对之间扩增产物的差异组合精确区不同的地黄品种，能够实现DNA水平上对17个黄淮产区地黄品种的区分鉴别，构成了其SSR指纹图谱。构成了其SSR指纹图谱。构成了其SSR指纹图谱。
技术研发人员：李春鑫 张永战 陈国参 杨铁钢 刘永康 王艳 张英涛 杨金星 刘彬
受保护的技术使用者：河南省农业科学院经济作物研究所
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/5
