番茄ps-2基因的kasp标记开发及应用
技术领域
1.本发明属于番茄育种技术领域，特别涉及番茄ps-2基因的kasp标记开发及应用。
背景技术：2.番茄味美、营养丰富且具有保健功能，在人们饮食结构中具有非常重要的地位。番茄栽培面积不断扩大，已成为各地全年供应重要的蔬菜之一。番茄杂种优势十分明显，当前番茄生产上全部使用杂交种子，但目前番茄在杂交种子生产上，大多仍然利用人工授粉进行杂交制种，不但费时、费力制种成本高，而且影响杂交种纯度。
3.番茄雄性不育类型都是隐性核不育，番茄雄性不育系在利用上存在一定困难，利用雄性不育系进行育种时，后代可育株与不育株发生分离。利用早期标记性状，幼苗时期根据标记性状鉴别不育株和可育株，能解决原来两用系只有在开花时，才能鉴别可育株的问题。不育系商品性状较差，所以在实际应用中需将雄性不育基因进行转育。但普通的不育系转育周期很长，要通过杂交、自交各重复多代才能转育成一个优良的雄性不育系。因此，如何在早期有效鉴定可育株与不育株，将直接影响其应用价值。
技术实现要素：4.本发明之目的在于提供番茄ps-2基因的kasp标记开发及应用，解决现有技术中的问题，对雄性不育材料和雄性可育材料均能够准确地进行鉴定，在番茄雄性不育植株的筛选中具有较高的实用性。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：番茄ps-2基因的kasp标记开发，包括：（1）番茄材料选定：纯合雄性不育材料ms7015和番茄材料p1059，ps-2基因定位于第4条染色体，该基因和ful基因连锁，且ps-2番茄雄性不育基因为隐性单基因；（2）番茄叶片dna提取：采用ctab法从番茄叶片中提取基因组dna；（3）使用kasp引物进行pcr扩增：kasp引物包括f3引物、f4引物，f3引物的核苷酸序列为：kps-2-wild-rff3：gaaggtgaccaagttcatgctcgttaatttatcgatacc，f4引物的核苷酸序列为：kps-2-mut-shf4：gaaggtcggagtcaacggattcgttaatttatcgatacg，反向引物kps-2r5：aatattcaaatttctgattccacca，其中kps-2-wild-rff3和kps-2-mut-shf4引物中gaaggtgaccaagttcatgc序列和gaaggtcggagtcaacggatt序列分别对应fam荧光标签和hex荧光标签序列；将提取的dna分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行pcr扩增反应。
6.优选的，所述反应体系为pcr反应体系：反应体系总体积10ul，其中2x kasp master mix：5ul，kasp primer mix：0.14ul，模板dna：1ul，ddh20：3.86ul；pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环；
94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环；pcr反应使用applied biosystems 7500real-time pcr system进行。
7.优选的，包括：对扩增产物的检测和分析：使用applied biosystems 7500real-time pcr system自带的软件对pcr产物进行基因分型和数据分析。
8.本发明还提供番茄ps-2基因的kasp标记开发的应用，用于番茄ps-2雄性不育基因的分子标记辅助育种。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明番茄ps-2基因的kasp标记开发可用于番茄ps-2雄性不育基因的分子标记辅助育种；对雄性不育材料和雄性可育材料均能够准确地进行鉴定，在番茄雄性不育植株的筛选中具有较高的实用性。
附图说明
10.图1为本发明的实施例3利用kasp分子标记检测24份测试番茄品种材料的分型图。
11.图2为本发明的实施例4利用kasp分子标记检测f2测试群体中ps-2基因的分型图。
具体实施方式
12.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
13.实施例1（1）番茄材料；纯合雄性不育材料ms7015（ps-2+/+)和番茄材料p1059（ps-2-/-)，前人利用形态标记已将ps-2基因定位于第4条染色体，该基因和ful基因连锁，且ps-2番茄雄性不育基因为隐性单基因。
14.（2）番茄叶片dna提取；采用常规ctab法从番茄叶片中提取基因组dna。
15.（3）kasp分子标记设计番茄雄性不育性状的分子标记物，包括f3引物、f4引物，f3引物的核苷酸序列为：kps-2-wild-rff3：gaaggtgaccaagttcatgctcgttaatttatcgatacc，f4引物的核苷酸序列为：kps-2-mut-shf4：gaaggtcggagtcaacggattcgttaatttatcgatacg，反向引物kps-2r5：aatattcaaatttctgattccacca，其中kps-2-wild-rff3和kps-2-mut-shf4引物中gaaggtgaccaagttcatgc序列和gaaggtcggagtcaacggatt序列分别对应fam荧光标签和hex荧光标签序列。
16.实施例2kasp分子标记的扩增；将提取的dna分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行pcr扩增反应。
17.pcr反应体系：反应体系总体积10ul，其中2x kasp master mix：5ul，kasp primer mix：0.14ul，模板dna（50-100ng/ul）：1ul，ddh20：3.86ul。
18.pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环（每个循环降低0.6℃）；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。pcr反应使用applied biosystems 7500real-time pcr system进行。按照仪器手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
19.实施例3扩增产物的检测和分析；使用applied biosystems 7500real-time pcr system自带的软件对pcr产物进行基因分型和数据分析，其中设定纵坐标数值表示hex荧光信号值，横坐标数值表示fam荧光信号值。
20.基因分型结果见图1。y轴为hex荧光信号坐标轴，x轴为fam荧光信号坐标轴。图中的正方形为番茄雄性不育材料的分布点，仅检测到hex荧光信号；三角形为杂合基因型分布点，同时检测到hex荧光和fam荧光；圆形为番茄雄性可育材料的分布点，仅检测到fam荧光信号。两种纯合基因型的扩增信号，即纯合雄性不育和纯合雄性可育的扩增信号分别与原点连线，所形成的夹角越接近直角说明分型效果越好。由此可看出，kasp标记可用于雄性不育番茄的选育工作。
21.因此，本发明所述的kasp标记可用于番茄ps-2雄性不育基因的分子标记辅助育种。
22.实施例4为检测本发明kasp标记的实用性，将父母本材料杂交配制f2分离群体，并对f2分离群体中雄性不育基因ps-2进行kasp标记检测。采用实施例2中所述的方法，提取样本基因组dna作为pcr扩增模板；使用kasp引物进行pcr扩增；使用applied biosystems 7500real-time pcr system进行pcr反应；使用applied biosystems 7500real-time pcr system自带的软件对pcr产物进行基因分型和数据分析，其中设定纵坐标数值表示hex荧光信号值，横坐标数值表示fam荧光信号值。
23.检测分型结果显示，检测带型同图2中三角形为杂合的雄性可育材料（同时检测到hex和fam荧光信号）、检测带型同图2中圆点为纯合的雄性可育材料（仅检测到fam荧光信号）。
24.上述结果表明，所涉及的引物对雄性不育材料和雄性可育材料均能够准确地进行鉴定，在番茄雄性不育植株的筛选中具有较高的实用性。
25.序列1ps-2基因cds序列》solyc04g015530atggagaaattcaatgaagaagaagatcaagctaaggttacaacaattaatgtggatagctttggagctaaaggtgatggaagtatagatgatacaaatgcatttcaaaaagcatggaaagaagcttgttcatcttcacatgttgtgaattttgtggtgtcccagaacaagaaatatcttctcaaaccaatcaaattttatgggccatgcaaatcttccattacaatgcagatttatggaaccctattagcatctgatgatacttcagattacaagaaggatagtaggcactggcttatttttgatagtgttcaaaaattggttgttggaggagctggagttatcaatggcaatggcaaaatttggtggcaacattcttgcaaaattaataaaaaattgccatgcaaggtagcacccacggccctgacattttacaagtgtaacaacttgaaagtgaaggaccttaaaatagaaaatgcacaacaaatacatttgctaattgagaagtgtgttggtgttgaagttacaaaattggtagtgacttctccagaaaatagccctaatactgatggaatccatataactagcactcaaaatattcaaatttc
tgattccaccattgccacaggtgatgattgcatctcaattgtggatggatctcagaaggtcttagccactggcattacttgtggaccaggtcatggaattagtattggaagtttgggaggtggaaattcagaagctcatgtgtctgatattcatgtaaatggagctaagctttatgaaactacaaatggacttaggattaagacttggccgggaggatttggaagtgcaagcaatattaagtatcaaaatgtggttatgaataatgtcaaaaatccaataattatagaccaaaattattgtgatcaagctgatggtccatgcaaagctgagactgactcggcagttgaagtgaaaaatgtgatttatcaaaatatcaaaggcacaagtgcaacaaatgatgcaataagtatcaagtgcagcaaaaaaattccatgtgaaggaattttgatggagaatgtgaaattgttaggaggaaatggtgaaactccaaatggtatttggggaaatatcaataatcttacgtgcaaaaatgttttaccagaatgtcaaaaaaactcaaaaattgtataa序列2ps-2基因蛋白序列》solyc04g015530mekfneeedqakvttinvdsfgakgdgsiddtnafqkawkeacssshvvnfvvsqnkkyllkpikfygpckssitmqiygtllasddtsdykkdsrhwlifdsvqklvvggagvingngkiwwqhsckinkklpckvaptaltfykcnnlkvkdlkienaqqihlliekcvgvevtklvvtspenspntdgihitstqniqisdstiatgddcisivdgsqkvlatgitcgpghgisigslgggnseahvsdihvngaklyettnglriktwpggfgsasnikyqnvvmnnvknpiiidqnycdqadgpckaetdsavevknviyqnikgtsatndaisikcskkipcegilmenvkllggngetpngiwgninnltcknvlpecqknskiv尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：1.番茄ps-2基因的kasp标记开发，其特征在于，包括：（1）番茄材料选定：纯合雄性不育材料ms7015和番茄材料p1059，ps-2基因定位于第4条染色体，该基因和ful基因连锁，且ps-2番茄雄性不育基因为隐性单基因；（2）番茄叶片dna提取：采用ctab法从番茄叶片中提取基因组dna；（3）使用kasp引物进行pcr扩增：kasp引物包括f3引物、f4引物，f3引物的核苷酸序列为：kps-2-wild-rff3：gaaggtgaccaagttcatgctcgttaatttatcgatacc，f4引物的核苷酸序列为：kps-2-mut-shf4：gaaggtcggagtcaacggattcgttaatttatcgatacg，反向引物kps-2r5：aatattcaaatttctgattccacca，其中kps-2-wild-rff3和kps-2-mut-shf4引物中gaaggtgaccaagttcatgc序列和gaaggtcggagtcaacggatt序列分别对应fam荧光标签和hex荧光标签序列；将提取的dna分别加入全裙边96孔板，配制反应体系进行pcr扩增反应。2.根据权利要求1所述的番茄ps-2基因的kasp标记开发，其特征在于：所述反应体系为pcr反应体系：反应体系总体积10ul，其中2x kasp master mix：5ul，kasp primer mix：0.14ul，模板dna：1ul，ddh20：3.86ul；pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环；pcr反应使用applied biosystems 7500real-time pcr system进行。3.根据权利要求2所述的番茄ps-2基因的kasp标记开发，其特征在于，包括：对扩增产物的检测和分析：使用applied biosystems 7500real-time pcr system自带的软件对pcr产物进行基因分型和数据分析。4.根据权利要求3所述的番茄ps-2基因的kasp标记开发的应用，其特征在于：用于番茄ps-2雄性不育基因的分子标记辅助育种。
技术总结本发明公开了番茄ps-2基因的KASP标记开发及应用，通过番茄材料选定，番茄叶片DNA提取，使用KASP引物进行PCR扩增实现番茄ps-2基因的KASP标记开发；并对扩增产物的检测和分析，本发明番茄ps-2基因的KASP标记可用于番茄ps-2雄性不育基因的分子标记辅助育种；对雄性不育材料和雄性可育材料均能够准确地进行鉴定，在番茄雄性不育植株的筛选中具有较高的实用性。用性。用性。
技术研发人员：贾芝琪 李纪锁 康东木 贾明朝 张砚迪 李营
受保护的技术使用者：河南七度农业科技有限公司 北京博纳东方农业科技发展有限公司 北京中研益农种苗科技有限公司
技术研发日：2022.04.21
技术公布日：2022/7/5
