1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感及生物传感器的应用。
背景技术：2.大肠杆菌是一种常见的食源性病原体，可导致人体出现溶血性尿毒症综合征、出血性结肠炎、急性肾损伤甚至死亡等现象。食源性大肠杆菌暴发与食用受污染的食物有关，例如新鲜蔬菜、酸性饮料和碎牛肉。因此，对食品中大肠杆菌检测是食品安全检测中的重要一环。传统检测大肠杆菌的方法以微生物培养为代表，尽管能依据形态特征、生长特性等特异性鉴别菌种，但是操作过程繁琐，耗时较长，一般情况下检测时间需要数天，且容易被空气中的微生物污染。随着科研人员对微生物检测的关注，仪器分析、分子生物学、以及免疫学等技术在微生物检测中的应用出现大家的视野里，在一定程度上解决了传统微生物检测方法的耗时长、容易污染等问题，但是以上方法存在操作复杂、成本较高、特异性低以及灵敏度低等不足，导致检测结果不稳定。因此，开发一种经济实惠、简单快速、灵敏度较高的检测方式尤为重要。目前，生物传感器因检测速度快、经济实惠等优势被大家所熟知，但是现有方法存在灵敏度低，检测背景高等不足。
3.为了提高生物传感器在检测过程中的灵敏度，通常会加入具有催化功能的酶，加速氧化还原反应，将生化反应转化为荧光、比色、电化学信号。传统上用于催化的酶大部分为蛋白质酶，如常用于生物传感领域的辣根过氧化物酶，尽管其具有较高的催化活性，但存在保存要求高、酶活不稳定等缺点。然而，类似辣根过氧化物酶催化活性的脱氧核酶(dnazyme，由富含g(鸟嘌呤)的dna单链和hemin组成)具有体积较小，容易合成等优势，有望取代辣根过氧化物酶在生物传感中的位置。但是，在实际应用中发现脱氧核酶的活性并不高，达不到辣根过氧化物酶的活性。以往为了增强脱氧核酶的活性会通过序列筛选、修饰g4骨架、添加活性激活剂，添加侧翼序列等方式筛选高催化活性的脱氧核酶，这些方式为提高脱氧核酶活性提供了具有参考意义的思路，即使如此，脱氧核酶活性倍数远不及辣根过氧化物酶。因此，如何提高脱氧核酶活性是生物传感应用于检测中必须要考虑的重要因素之一。
技术实现要素：4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种邻近碱基对增强型脱氧核酶，并基于该脱氧核酶构建检测大肠杆菌的生物传感器，最终应用于大肠杆菌检测。
5.为了实现上述目的，本发明提供了一种邻近碱基对增强型脱氧核酶，所述增强型脱氧核酶的核苷酸序列g4-aa、g4-ag、g4-a-mda、g4-a-ap、g4-a-di中的一种；
6.所述g4-aa的核苷酸序列为：g4-aa-tttcgctatgtctg；
7.所述g4-ag的核苷酸序列为：g4-ag-tttcgctatgtctg；
8.所述g4-a-mda的核苷酸序列为：g4-a-/6-med a/-tttcgctatgtctg；(/6-med a/为
n6’甲基化腺嘌呤)；
9.所述g4-a-ap的核苷酸序列g4-a-/i2-amp/-tttcgctatgtctg；(/i2-amp/为2’氨基嘌呤)；
10.所述g4-a-di的核苷酸序列g4-a-/6-ide oxy i/-tttcgctatgtctg。(/6-ide oxy i/为次黄嘌呤)。
11.上述的邻近碱基对增强型脱氧核酶，进一步的，所述g4的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12.上述的邻近碱基对增强型脱氧核酶，进一步的，还包括g4-aa、g4-ag、g4-a-mda、g4-a-ap、g4-a-di的拓扑结构。
13.基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种生物传感器，包括权利要求1或2所述的邻近碱基对增强型脱氧核酶、互补dna链(cdna)、大肠杆菌适配体(aptamer)和氯铁血红素(hemin)。
14.上述的生物传感器，进一步的，所述互补dna链为cdna，
15.cdna的核苷酸序列如seq id no.3所示；
16.上述的生物传感器，进一步的，所述大肠杆菌适配体的核苷酸序列如seq id no.2所示。
17.上述的生物传感器，进一步的，所述生物传感器还包括mes缓冲液体系、abts
2-和h2o2。
18.上述的生物传感器，进一步的，所述邻近碱基对增强型脱氧核酶的浓度为200nm：所述互补dna链的浓度为400nm，所述氯铁血红素的浓度为200nm；所述abts
2-的浓度为1mm；所述h2o2的浓度为2mm。
19.基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述生物传感器在检测大肠杆菌中的应用。
20.上述的应用，进一步的，所述应用的方法为：
21.(1)取待测液体添加到含有大肠杆菌适配体的mes缓冲液中孵化得到体系一；
22.(2)往所述体系一中加入所述的邻近碱基对增强型脱氧核酶、hemin和cdna链孵化，得到体系二；
23.(3)将所述体系二转入石英比色皿中，加入h2o2和abts
2-，摇匀得到体系三；
24.(4)紫外分光光度计测取体系三在420nm处吸光度随时间的变化值。
25.与现有技术相比，本发明的优点在于：
26.(1)本发明提供了一种邻近碱基对增强型脱氧核酶，通过改变g4邻近两位的碱基并根据沃森-克里克碱基互补配对原则与邻近第二位杂交互补，进而增强dnazyme的活性。
27.(2)本发明提供了一种生物传感器，具有简单、快速、特异性检测大肠杆菌等优势。实验结果显示，通过g4尾端碱基对的杂交可以明显进一步增强dnazyme的催化活性。在最佳条件下，邻近碱基对增强型脱氧核酶生物传感器能够特异性检测大肠杆菌，检测范围为2
×
10
2-2
×
107cfu/ml，检测限为16cfu/ml，具有较高的回收率和检测灵敏度。
28.(3)本发明提供了一种生物传感器在检测大肠杆菌中的应用，基于邻近碱基对调节dnazyme催化活性现象，即g4-bio 5’端的g4核心部分与氯铁血红素(hemin)结合所形成的dnazyme，此时，g4-bio尾端由于a:t碱基对的存在，dnazyme活性受到抑制。存在cdna时
(能打开g4-bio的环状部分)，不仅恢复脱氧核酶自身具备的催化活性，且由于g4尾端+2位a碱基被t所互补，进一步增强dnazyme催化活性。将特异性识别大肠杆菌的适配体引入缓冲溶液中，互补dna(cdna)和g4-bio的浓度导致于互补dna(cdna)结合，因此g4-bio并不表达出高活性。当存在靶向g4-bio、cdna、aptamer溶液中的大肠杆菌，大肠杆菌能优先结合大肠杆菌aptamer，游离的cdna能够于g4-bio结合，使其g4-bio茎状部分打开，从而使g4 dnazyme酶活恢复，从而达到检测大肠杆菌的目的。
附图说明
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
30.图1为本发明实施例1中邻近碱基对增强脱氧核酶示意图。
31.图2为本发明实验一中嘌呤:嘧啶的不同杂交碱基时，吸光度随时间变化结果。
32.图3为本发明实施例2中四种嘌呤类似物的结构示意图。
33.图4为本发明实验二中不同嘌呤类似物对催化活性的影响后，随时间的吸光度变化结果。
34.图5为本发明实验三中g4-aa:o和g4-aa:t的过氧化行为研究结果。a为在h2o2(2mm)存在下，g4 dnazymes在404nm处的吸光度衰退动力学分析；b为g4-aa:t-hemin与h2o2(2mm)反应过程中可见区随时间变化的光谱变化；c为g4-aa:o-hemin与h2o2(2mm)反应过程中可见区随时间变化的光谱变化。
35.图6为本发明实施例4中基于自由互补dna的竞争分析机制示意图。
36.图7为本发明实验四中特异性分析结果。
37.图8为本发明实验五中工作曲线分析结果。
具体实施方式
38.以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
39.以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
40.所用核酸序列详见表1。
41.表1:核苷酸序列
[0042][0043][0044]
实施例1
[0045]
一种脱氧核酶，其核苷酸序列具有以下结构：
[0046]
只要是能形成g4结构的序列，都可以有这种现象。
本实施例中优选的g4序列如seq id no.1(具体为表1种的original-g4)所示，具体为：gggttgggtgggttggg。
[0047]
改变g4尾端近两位的碱基种类，并根据沃森-克里克碱基互补配对原则添加互补链杂交g4链邻位第二位剩余的碱基序列形成16种脱氧核酶类型，具体为：g4-aa、g4-ac、g4-ag、g4-at、g4-ca、g4-cc、g4-cg、g4-ct、g4-ga、g4-gc、g4-gg、g4-gt、g4-ta、g4-tc、g4-tg、g4-tt中的一种。
[0048]
g4-aa：gggttgggtgggttgggaatttcgctatgtctg；
[0049]
g4-ac：gggttgggtgggttgggactttcgctatgtctg；
[0050]
g4-ag：gggttgggtgggttgggagtttcgctatgtctg；
[0051]
g4-at：gggttgggtgggttgggattttcgctatgtctg；
[0052]
g4-ca：gggttgggtgggttgggcatttcgctatgtctg；
[0053]
g4-cc：gggttgggtgggttgggcctttcgctatgtctg；
[0054]
g4-cg：gggttgggtgggttgggcgtttcgctatgtctg；
[0055]
g4-ct：gggttgggtgggttgggcttttcgctatgtctg；
[0056]
g4-ga：gggttgggtgggttggggatttcgctatgtctg；
[0057]
g4-gc：gggttgggtgggttggggctttcgctatgtctg；
[0058]
g4-gg：gggttgggtgggttgggggtttcgctatgtctg；
[0059]
g4-gt：gggttgggtgggttggggttttcgctatgtctg；
[0060]
g4-ta：gggttgggtgggttgggtatttcgctatgtctg；
[0061]
g4-tc：gggttgggtgggttgggtctttcgctatgtctg；
[0062]
g4-tg：gggttgggtgggttgggtgtttcgctatgtctg；
[0063]
g4-tt：gggttgggtgggttgggtttttcgctatgtctg。
[0064]
在本发明中改变g4邻近两位的碱基并根据沃森-克里克碱基互补配对原则与邻近第二位杂交互补，发现如果g4(dnazyme核心序列)序列的相邻两位侧翼碱基是腺嘌呤时，这种嘌呤与嘧啶的杂交可以增强dnazyme的活性。
[0065]
基于g4尾端邻近碱基对杂交抑制脱氧核酶活性的思路，改变g4尾端近两位的碱基种类，并添加互补链杂交g4链邻位第二位剩余的碱基序列形成16种脱氧核酶类型。图1表示g4尾端+1位为a，+2位碱基对a:t或g:c时，会出现增强原有脱氧核酶活性的现象。
[0066]
实验一：考察16种脱氧核酶的活性
[0067]
分别将16种g4 dna(200nm)和其互补dna链(400nm)，以及hemin(200nm)添加至2
×
mes缓冲液体系(50mm mes、400mm nacl、40mm kcl、0.1％triton x-100，ph 5.5)。在室温下孵化30min，形成混合物。然后，将以上混合物转移到石英比色皿中，并添加abts
2-(1mm)和h2o2(2mm)后，开始催化反应。运用紫外分光光度计在450-700nm范围内收集uv-vis光谱，并通过动力学分析模式监测420nm处abts
·-的产生速率。
[0068]
图2为嘌呤:嘧啶的不同杂交碱基时，吸光度随时间变化结果。表2为各种g4-dnazyme的催化性能参数。
[0069]
表2：各种g4-dnazyme的催化性能参数。
[0070]
[0071][0072]
*v和tof分别代表催化速率和转换频率。
[0073]
从图2和表2(表2显示图2中dnazyme的催化速率和转换频率)的结果可以看出：在以上16种脱氧核酶中，若g4尾端邻位碱基为aa(两个腺嘌呤)且+2位的a与相应互补链的t碱基杂交(即g4-aa:t)，会出现脱氧核酶活性增强的现象，脱氧核酶活性可以在原有g4-adnazyme的基础上，进一步提高至约3.0倍，如图2中a图。这也证明了hemin堆积在g4的g4平面上。此外，g4尾端邻位碱基为ag(腺嘌呤-鸟嘌呤)，所对应的互补链杂交位置为c(胞嘧啶)时，同样会出现类似的情况，如图2中c图。但是，从图2中b、d-p图均未出现增强脱氧核酶的效果。以上现象称为邻近碱基对增强脱氧核酶活性作用。
[0074]
实施例2：考察邻近碱基对增强脱氧核酶现象在嘌呤类似物的可能性。
[0075]
为了研究，选择了不同嘌呤类似物，如：甲基化腺嘌呤(mda)、2-氨基嘌呤(ap)和次黄嘌呤(di)形成g4 dnazyme。具体为：
[0076]
g4-a-mda：gggttgggtgggttggga/6-med a/tttcgctatgtctg；
[0077]
g4-a-ap：gggttgggtgggttggga/i2-amp/tttcgctatgtctg；
[0078]
g4-a-di：gggttgggtgggttggga/ide oxy i/tttcgctatgtctg。
[0079]
实验二：考察上述g4-a-mda、g4-a-ap、g4-a-di三种g4 dnazyme的活性。
[0080]
图3插图为嘌呤类似物的结构示意图。图4为不同嘌呤类似物对催化活性的影响后，随时间的吸光度变化。
[0081]
从图中可以看出：当这些嘌呤类似物置于g4尾端邻位第二位时，并与相应的碱基杂交，分析所产生的信号差异。mda和ap对过氧化活性的影响与g4-aa非常相似，当存在腺嘌呤类似物，辅以“t”型底座时，dna-t可以明显增强dnazyme的活性。对于di，由于它几乎可以补充任何碱基，碱基补体为t(胸腺嘧啶)或c(胞嘧啶)均能类似程度地增强dna-di dnazyme的活性。这一现象也表明了腺嘌呤类似物可以产生邻近碱基对增强效应。
[0082]
把第一位的碱基换成了其他非四种常见的碱基，发现嘌呤类似物也有效果。
[0083]
实验三、研究了g4-aa:o和g4-aa:t的过氧化行为：
[0084]
为了进一步阐明相邻aa:t的功能，深入研究了g4-aa:o和g4-aa:t的过氧化行为。dnazyme的催化循环开始于g4/hemin被h2o2氧化为中间体(化合物i)，该中间体包含一个fe(iv)＝o和一个卟啉阳离子自由基；fe(iv)＝o能被还原为hemin(fe(iii))，由此产生两个游离的单电子，两个电子氧化abts
2-，完成催化过程。
[0085]
(1)衰退动力学分析：将g4-aa(5μm)和其互补dna链(10μm)，以及hemin(5μm)添加至2
×
mes缓冲液体系。在室温下孵化30min，形成复合物。再将以上溶液转移到石英比色皿中，通过动力学分析模式监测404nm处吸光度变化，50s后添加h2o2(2mm)，继续观测动力学。
[0086]
(2)光谱分析：混合物合成步骤同上。将以上的混合物放入比色皿中，并运用紫外分光光度计在450-700nm范围内收集uv-vis光谱，并间隔30s重复收集。
[0087]
图5中a为在h2o2(2mm)存在下，g4 dnazymes在404nm处的吸光度衰退动力学分析。从图中可以看出，g4-aa:t的soret带的衰退率明显快于g4-aa:o。
[0088]
同时，还监测了dnazyme在可见区域的吸光度随时间的变化，以便观察在dnazyme的中间体上释放信号的量。图5中的b为g4-aa:t-hemin与h2o2(2mm)反应过程中可见区随时间变化的光谱变化，图5中的c为g4-aa:o-hemin与h2o2(2mm)反应过程中可见区随时间变化的光谱变化。探究类化合物i中间体的形成，吸光度的变化方向由箭头表示。
[0089]
从图中可知：g4-aa:t的吸光度在e波段(～500nm)和d波段(～630nm)的位置略有变化，550-600nm和650-700nm略有增加(b)。然而，g4-aa:o表明反应开始后0.5min内e波段和d波段迅速消失(c)。因此，该现象表明g4-hemin复合物的原始中间体已迅速生成。450-700nm的整体衰减发生在0.5min后，表明hemin降解是由h2o2的连续反应引起的。邻近碱基对增强的现象归因于相邻的aa:t加快形成(fe(iv)＝o)，以及卟啉阳离子自由基的产生。
[0090]
实施例3
[0091]
一种用于检测大肠杆菌的生物传感器，以大肠杆菌适配体为识别元件，实施例1的较高催化活性的脱氧核酶为信号放大元件。具体包括大肠杆菌适配体、200nm g4 dna、400nm与其互补dna链、200nm hemin、2
×
mes缓冲液体系、1mmabts
2-和2mm h2o2。
[0092]
大肠杆菌适配体的核苷酸序列aptamer如seq id no.2所示，具体为：
[0093]
gacggtggcagggaaaggggtcgggcatatggcggagggg。
[0094]
互补dna序列cdna如seq id no.3所示，具体为：
[0095]
tatgcccgacccctttccagt。
[0096]
图6为基于自由互补dna的竞争分析机制示意图。
[0097]
图中线路(1)为基于邻近碱基抑制dnazyme催化活性现象，即g4-bio 5’端的g4核心部分与hemin结合所形成的dnazyme，此时，dnazyme活性受到抑制。存在cdna时(能打开g4-bio的环状部分)，不仅恢复脱氧核酶自身具备的催化活性，且由于g4尾端+2位a碱基被t所互补，进一步增强dnazyme催化活性。
[0098]
图中线路(2)为将特异性识别大肠杆菌的适配体引入缓冲溶液中，互补dna(cdna)和g4-bio的浓度导致于互补dna(cdna)结合，因此g4-bio并不表达出高活性。
[0099]
图中线路(3)为当存在靶向g4-bio、cdna、aptamer溶液中的大肠杆菌，大肠杆菌能优先结合大肠杆菌aptamer，游离的cdna能够于g4-bio结合，使其g4-bio茎状部分打开，从而使g4 dnazyme酶活恢复。
[0100]
实验五、考察生物传感器的特异性：
[0101]
特异性研究：取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、假单胞菌浓度为2
×
108cfu/ml，菌液分别加到含有200nm大肠杆菌适配体(大肠杆菌适配体序列见表3-1)的mes缓冲液中孵化10min，再往该体系加入200nm g4-bio(含有g4序列)、200nm hemin，和200nm cdna孵化30min，将以上溶液转入比色皿中，加入h2o2(2mm)和abts
2-(1mm)，摇匀。运用紫外可见光分光光度计测取420nm处吸光度变化值。以未添加菌液的样品作为空白对照。
[0102]
图7为在大肠杆菌浓度为2
×
108cfu/ml条件下，特异性分析结果。从图中可以看出基于增强型脱氧核酶传感器仅对靶标为大肠杆菌具有响应，反观金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、假单胞菌与无靶标存在时，其响应值近似相同，且在420nm处表现出较低的吸光度变化值。由此可得出，该基于邻近碱基对增强型脱氧核酶传感器具有较显著的特异性。
[0103]
实验六、考察生物传感器的检测限：
[0104]
分别配制7个浓度(2
×
101cfu/ml、2
×
102cfu/ml、2
×
103cfu/ml、2
×
104cfu/ml、2
×
105cfu/ml、2
×
106cfu/ml、2
×
107cfu/ml)的大肠杆菌，将实施例2的传感器检测以上浓度的大肠杆菌，绘制工作曲线。
[0105]
图8为不同大肠杆菌浓度动力学分析结果。图中a显示随着大肠杆菌浓度的逐渐增加，在420nm处，75s的吸光度变化区域也随着增加。从图中b可知基于邻近碱基对增强型脱氧核酶的传感检测范围在2
×
10
2-2
×
107cfu/ml时表现出良好的线性相关性，相关系数为0.998，校准方程为y＝-0.192+0.177x，检测限约为16cfu/ml。
[0106]
实施例4
[0107]
一种实施例3的生物传感器在检测自然环境中大肠杆菌的应用，其应用方法为：
[0108]
将实验室自来水放入锥形瓶中，放置高温灭菌锅中，121℃灭菌15min。在超净工作台中加入不同浓度大肠杆菌于灭菌冷却后的水中混匀，制备样品。后续操作步骤参照实施例3。
[0109]
为了确保提出的基于邻近碱基对增强型脱氧核酶构建生物传感器检测大肠杆菌的检测方法在实际样本中检测大肠杆菌的实际应用意义。本章采用了标准添加法进行了进一步的验证与评估，以高温灭菌的自来水中添加不同浓度大肠杆菌，并以未添加大肠杆菌的水样作为对照。添加与未添加大肠杆菌的样品，采用传统平板计数法确定大肠杆菌浓度。
[0110]
表3为采用实施例2的生物传感器检测自来水中的大肠杆菌检测结果。
[0111]
表3：基于邻近碱基对增强型脱氧核酶检测自来水中的大肠杆菌
[0112][0113]
如表3所示，在添加不同终浓度大肠杆菌(0cfu/ml，2
×
102cfu/ml,2
×
103cfu/ml,2
×
104cfu/ml,2
×
105cfu/ml,2
×
106cfu/ml)下大肠杆菌检测的回收率在87％-96％之间，实验的相对标准偏差(rsd)较小，相对标准偏差在7％以内。因此，得出基于增强型脱氧核酶构建生物传感器检测大肠杆菌在真实样品中检测是可行、可靠的，该方法同样适合于其他实际样品中大肠杆菌的检测分析。
[0114]
结论：本发明改变了g4尾端邻位后两位碱基，并添加与之互补的dna单链，由此形成了16种不同的g4 dnazyme类型。发现了g4链邻位碱基为aa，互补位为碱基t时可以进一步提高脱氧核酶的催化活性，该现象成为邻近碱基对增强dnazyme活性现象。若g4链邻位碱基为ag，互补位碱基为c时也存在相同的现象。随后，分析了g4-aa:t dnazyme在多种缓冲液、反应基质、ph中应用情况，结果表明邻近碱基对增强脱氧核酶效应具有普适性；通过紫外光谱分析得出邻近碱基对增强效应并不影响脱氧核酶原本的结构；通过g4尾端aa的距离、不同碱基类似物分别分析得出该现象仅存在于g4的邻位，腺嘌呤类似物同样具备该效应。本文基于邻近碱基对增强脱氧核酶效应构建了简单、快速的大肠杆菌检测体系，通过对检测体系的特异性、工作曲线分析，证明了该传感器具有高特异性、较低检测限的优良性能。该方法也能应用于水源中大肠杆菌检测。
[0115]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
技术特征：1.一种邻近碱基对增强型脱氧核酶，其特征在于，所述增强型脱氧核酶的核苷酸序列g4-aa、g4-ag、g4-a-mda、g4-a-ap、g4-a-di中的一种；所述g4-aa的核苷酸序列为：g4-aa-tttcgctatgtctg；所述g4-ag的核苷酸序列为：g4-ag-tttcgctatgtctg；其中g4-a-mda的核苷酸序列为：g4-a-/6-med a/-tttcgctatgtctg；g4-a-ap的核苷酸序列g4-a-/i2-amp/-tttcgctatgtctg；g4-a-di的核苷酸序列g4-a-/6-ide oxy i/-tttcgctatgtctg。2.根据权利要求1所述的邻近碱基对增强型脱氧核酶，其特征在于，所述g4的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.一种生物传感器，其特征在于，包括权利要求1或2所述的邻近碱基对增强型脱氧核酶、互补dna链、大肠杆菌适配体和氯铁血红素。4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述互补dna链为cdna，cdna的核苷酸序列如seq id no.3所示。5.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述大肠杆菌适配体的核苷酸序列如seq id no.2所示。6.根据权利要求3至5种任一项所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包mes缓冲液体系、abts
2-和h2o2。7.根据权利要求6所述的生物传感器，其特征在于，所述增强型脱氧核酶的浓度为200nm：所述互补dna链的浓度为400nm，所述氯铁血红素的浓度为200nm；所述abts
2-的浓度为1mm；所述h2o2的浓度为2mm。8.一种权利要求3至7中任一项所述生物传感器在检测大肠杆菌中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：(1)取待测液体添加到含有大肠杆菌适配体的mes缓冲液中孵化得到体系一；(2)往所述体系一中加入权利要求1或2所述的邻近碱基对增强型脱氧核酶、氯铁血红素和互补dna链孵化，得到体系二；(3)将所述体系二转入石英比色皿中，加入h2o2和abts
2-，摇匀得到体系三；(4)紫外分光光度计测取体系三的420nm处吸光度变化值。
技术总结本发明公开了一种邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感器及生物传感器的应用，增强型脱氧核酶的核苷酸序列G4-AA、G4-AG、G4-A-MdA、G4-A-AP、G4-A-dI中的一种；生物传感器包括增强型脱氧核酶、互补DNA链、大肠杆菌适配体和氯铁血红素。本发明通过改变G4邻近两位的碱基并根据沃森-克里克碱基互补配对原则与邻近第二位杂交互补，进而增强DNAzyme的活性。基于增强型脱氧核酶的生物传感器，能特异性检测大肠杆菌，具有较高的检测灵敏度和回收率。具有较高的检测灵敏度和回收率。具有较高的检测灵敏度和回收率。
技术研发人员：李旺 苏志鹏 任佳丽
受保护的技术使用者：中南林业科技大学
技术研发日：2022.05.18
技术公布日：2022/7/5
