分离自冶炼厂土壤的类芽孢杆菌lyx-1及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株分离自铅锌冶炼厂土壤的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1及其在含苯废水处理中的应用。
背景技术：2.苯是一种优良的有机溶剂，被用作溶剂及合成香料、油漆、染料、塑料、医药、炸药、橡胶等领域。苯是一种无色具有特殊芳香气味的液体，被称作为芳香杀手，属于剧毒溶剂，少量的吸入也会对人体造成长期的损害。苯能在神经系统和骨髓内蓄积，使神经系统和造血组织受到损害，引起血液中白血球、血小板数减少，长期接触可引起白血病。同时其衍生物诸如甲苯、二甲苯等都属于易致癌物质。由于苯被广泛应用，带来大量的含苯废水，因其对生物和环境的毒性、致突变性和致癌性，世界各国对于环境中苯含量严格把控，我国也不例外，我国对水体中苯的最高允许浓度分值为：地表水0.01mg/l(gb3838-2002地表水环境质量标准)，工业废水中苯的排放标准0.1mg/l(gb18918-2002城镇污水处理厂污染物排放标准)。因此，面对庞大的含苯废水，如何能有效处理，实现达标后再排放，成为研究的难点和热点。
3.含苯废水往往具有有机物含量高、生物毒性大，可生化性差等特点，导致处理难度大。目前对含苯废水常用的处理方法为活性炭吸附法、电化学法、催化氧化法等，其中活性炭吸附技术应用相对较为广泛，但活性炭法虽然对苯的吸附容量大，但活性炭的吸附苯容量一旦达到饱和之后，因废水环境复杂，活性炭结构还会发生坍塌或堵塞，同时活性炭的吸附性能也失去，导致活性炭常常被废弃变成危废，因此后期处理成本处理较高，因此需寻找经济高效的替代处理技术，国外研究发现微生物技术不但处理效果较好，而且成本也较低，无二次污染，因而微生物技术受到广泛关注，而相关技术研究我国较少。
4.目前已知的类芽孢杆菌(及其相近属)用途多为产生抗菌物质的功能微生物，表现出较强的抗菌作用，主要用于药物开发或植物保护生防菌开发，具体如下：
5.1、花榜清，刘振民，吴正钧，张锋华，苏永红，张秋香，类芽孢杆菌抗菌物质的研究进展，应用化工，2018，47(7)：1462-1467,1472；
6.2、卢美欢，李利军，马英辉，陈雅寒，安德荣，埃吉类芽孢杆菌swl-w8的鉴定及其对白菜软腐病的生物防治效果，农药学学报，2020，22(5)：791-800；
7.3、罗雨晴，盛浩，袁红，周清，张亮，多粘类芽孢杆菌lrs-1诱导黄瓜抗疫霉病的苯丙烷类代谢基因表达与调控研究，西南农业学报，2020,33(10)：2262-2266；
8.4、cn202011268718.0的发明《一种类芽孢杆菌cl01及其应用》告知了：类芽孢杆菌 cl01，保藏编号为gdmcc no：20161。cl01菌株抑菌谱广，抑菌能力强，不仅对梨炭疽病菌、梨黑斑病菌、梨轮纹病菌、梨腐烂病菌等梨树上常见病原真菌具有强抑制作用，同时对水稻纹枯病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、马铃薯晚疫病菌等植物病原菌具有强拮抗作用，可替代或减少化学农药使用，提高食品和生态环境安全。
9.类芽孢杆菌还具有以下用途：
10.1、cn110628680a的发明《类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用》告知了分离自土壤的类芽孢杆菌kctc 43073，其分类地位是paenibacillus sp.。该新种类芽孢杆菌具有有机磷农药残留降解功能。
11.2、cn103031262a的发明《一株类芽孢杆菌及其产生的微生物胞外多糖絮凝剂及应用》告知了类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)zd01及其所产的胞外多糖絮凝剂pe-1，并进一步提供了该絮凝剂在废水处理中固体悬浮物的沉淀、染料色素的脱色及重金属离子的去除等方面的应用。
12.至于类芽孢杆菌在对污水中污染物的代谢方面的研究国内外均未见报道。
技术实现要素：13.本发明要解决的问题是提供能够用于含苯废水处理的菌株
‑‑
类芽孢杆菌(paenibacillussp.)lyx-1及其用途。
14.为了解决上述技术问题，本发明提供一株类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1，其保藏编号：cgmcc no.22158。
15.该菌株16s rdna基因序列如seq id no.1所示。
16.本发明还同时提供了上述类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1用途：处理含苯废水。即，去除含苯废水中的苯。
17.本发明的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1分离自铅锌冶炼厂土壤，保藏信息如下：
18.保藏名称：类芽孢杆菌paenibacillus sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.22158，保藏时间2021年4月9日。
19.该菌株的菌落特征如下：为杆菌，表面粗糙，不产胞子，具有小的荚膜，分裂方式为三分裂(单体细胞横向分裂形成三个子代细胞)，革兰氏阴性，菌体大小为(1.0～6.0)μm
×
(0.2～0.3) μm，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈柠檬白色，不透明。
20.该菌株16s rdna基因序列如seq id no.1所示。
21.本发明菌株由采集于湖南省株洲市某铅锌冶炼厂土壤中筛选获得，根据sherlock mis软件系统对菌株lyx-1定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比library数据库，初步鉴定菌lyx-1为类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)，相似指数si(similarity index)为0.98；用16s rdna测序鉴定方法也证明该菌株为类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)。
22.本发明还涉及所述的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1在含苯废水处理中的应用。具体的，所述菌株用于去除含苯废水中的苯。将本发明菌株接种至含苯废水中，在15～35℃、 150～200r
·
min-1
的好氧条件下进行培养0.5～1d，可有效去除废水中的苯。
23.本发明所述的含苯废水，是指主要含苯的废水，其苯浓度为1～400mg
·
l-1
。
24.该菌株能用于含苯废水处理，在好氧条件下、ph7.0、温度25～30℃、od
415nm
0.2、苯浓度200mg
·
l-1
(cod
cr
为510mg
·
l-1
)转速180r
·
min-1
的条件下，培养1天，过滤，苯的去除率为99.99％，苯浓度降低至0.02mg
·
l-1
，cod
cr
降低至20mg
·
l-1
，可达到城镇污水处理厂污染物排放标准(gb18918-2002)(苯0.1mg/l，cod
cr
为50mg
·
l-1
)中的一级a标准。
25.类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)在对污水中污染物的代谢方面的研究国内外均未见报道，有关类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)(及其相近属)可降解含苯废水的研究尚属空白，本发明涉及一株分离自铅锌冶炼厂土壤的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1及其在含苯废水处理中的应用，属于首次发现。
26.综上所述，本发明经筛选获得了一株用于含苯废水处理的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.) lyx-1，其具有高效处理含苯废水的潜力，为控制含苯废水排放对环境的影响提供了技术基础，应用前景广阔。
附图说明
27.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
28.图1为类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1(放大13000倍)；
29.图2为16s rdna pcr扩增结果(lyx-1：菌株lyx-1；marker：dna标准分子量)；
30.图3为基于16s rdna序列的菌株系统发育树。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
32.培养基使用前需要进行常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min，此为常识。
33.实施例1、降解菌株的筛选与鉴定
34.1材料与方法
35.1.1培养基和试剂
36.富集培养基：苯(0.05、0.1、0.20、0.3或0.4g)(逐步提高加入进行驯化富集)，cacl2·
6h2o 0.1g，mgcl
2 0.25g，k2hpo
4 1.5g，nh4cl 1g，蛋白胨9g，h2o 1000ml，ph＝6.5～7.5；
37.基础培养基：nh4no31.00g，mgso4.7h2o 0.5g，(nh4)2so
4 0.5g，kh2po
4 0.5g，nacl 0.5g， k2hpo
4 1.5g，h2o 1000ml，ph4.0；
38.基础培养基加入1.5％(w/v，每100ml加1.5g)琼脂和0.8g.l-1
的苯即配成相应的固体基础培养基；
39.ph7.0、苯浓度200mg
·
l-1
(cod
cr
为510mg
·
l-1
)的油漆生产过程产生的含苯废水。
40.1.2菌株对含苯废水处理效能的测定
41.将纯化后的单个菌株以菌量od
415nm
＝0.2接种到100ml含苯的废水(ph7.0、苯浓度 200mg
·
l-1
，cod
cr
为510mg
·
l-1
)250ml三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30℃、 180r
·
min-1
的恒温摇床上振荡好氧培养1天。培养结束后，用0.20μm膜过滤，除去菌丝体，滤液用于相应苯和cod
cr
的测定，苯的含量用气相色谱测定，cod
cr
值采用cod仪测定。
42.去除率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)
×
100/对照样品残留量。
43.1.3优势降解菌株选育
44.1.3.1菌株来源
45.采集湖南省株洲市某铅锌冶炼厂土壤。
46.1.3.2降解菌株的分离、纯化和筛选
47.从每份铅锌冶炼厂土壤中取10g，在无菌的条件下，分别加到装有100ml无菌液体富集培养基的250ml三角瓶中.在30℃下180r
·
min-1
摇床上培养7天后，按10％(体积％)接种量转移到下一批富集培养基上(苯梯度依次为0.05、0.1、0.20、0.3或0.4g
·
l-1
)，同条件驯化培养7 天。然后再按10％接种量转接到含0.8g
·
l-1
苯的无菌液体基础培养基中，继续培养7天，连续转接2次后从苯浓度为0.8g
·
l-1
基础培养基中，取0.1ml基础培养基发酵液反复进行固体基础培养基平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4℃冰箱内保存。
48.1.3.3菌株鉴定
49.菌株鉴定采用美国midi公司的sherlock microbial identity system(mis)软件系统，该系统将基础培养基上纯化的单菌落按照midi公司的操作规范进行脂肪酸的提取和分析，定性(种类)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸成份并生成脂肪酸图谱，将生成的图谱和数据库(library)进行比对，根据相似指数si(similarity index)鉴定未知菌种，相似指数 si大于0.9就基本可确定是某种微生物。该系统是一相对快速和具有丰富菌库的微生物鉴定系统，已得到较广泛的应用(吴愉萍，徐建明，汪海珍等.sherlockmis系统应用于土壤细菌鉴定的研究.土壤学报，2006，43(4):642-647)。
50.此外，同时用16s rdna鉴定方法进行验证，与sherlock microbial identity system(mis) 进行比较。以lyx-1菌株总dna为模板，用16s rdna基因的通用引物进行pcr扩增，得到的扩增片段经回收、测序可明确其大小，再将测序结果用blast软件与genbank中的序列进行同源性比较。
51.1.3.4菌株形态特征观察及生理生化特性测定
52.将菌株接种在固体培养基中，48h后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》 (东秀珠，蔡妙英)。
53.2.结果
54.2.1菌株的分离与筛选
55.经分离、纯化、筛选获得1株能有效处理含苯废水的细菌，命名为lyx-1，而筛选过程中获得的其它菌株降解力都不同程度地衰退，好氧培养1天，发现它对苯的去除率分别为 99.99％。
56.2.2菌株的鉴定
57.2.2.1菌株基本形态及生理生化特征
58.该菌为杆菌，表面粗糙，不产胞子，且具有小的荚膜，分裂方式为三分裂(单体细胞横向分裂形成三个子代细胞)，革兰氏阴性，菌体大小约为长(1.0～6.0)μm、宽(0.2～0.3)μm (如图1)，在固体培养基上，菌落圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈柠檬白色，不透明。革兰氏染色阴性，乙酰甲基甲醇生成试验(v-p)反应阳性，吲哚实验阴性，能液化明胶，其他生理生化特性见表1。
59.表1、类芽孢杆菌lyx-1的生理生化特性
[0060][0061][0062]
注：+阳性反应；-阴性反应
[0063]
2.2.2菌株鉴定
[0064]
(1)sherlock mis系统对菌株的鉴定
[0065]
根据sherlock mis软件系统对菌株脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比 library数据库，初步鉴定菌株为类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)，相似指数si(similarity index) 为0.98。
[0066]
(2)16s rdna鉴定方法对菌株的验证
[0067]
i.dna提取结果
[0068]
以菌株总dna为模板，用16s rdna基因的通用因为进行pcr扩增，得到1条约为1kb 的片段(图2)。扩增片段经回收、测序明确其大小为1421bp(seq id no.1)。
[0069]
ii.16s rdna基因pcr扩增和序列分析
[0070]
将测序结果用blast软件与genbank中的序列进行同源性比较发现，菌株lyx-1与类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)具有较高的同源性，同源性接近98％，遗传距离较近。
[0071]
综合菌株的生理生化性质、sherlock mis(midi鉴定系统)及16s rdna系统进化分析可以看出，该菌属于类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)。
[0072]
3结论
[0073]
从湖南株洲市某铅锌冶炼厂土壤中分离得到1株能够用于含苯废水处理的高效菌 lyx-1，经sherlock mis系统和16s rdna鉴定为类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)。
[0074]
保藏信息如下：
[0075]
保藏名称：类芽孢杆菌paenibacillus sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.22158，保藏时间2021年4月9日。
[0076]
实施例2、菌株对含苯废水处理性能检测
[0077]
1材料与方法
[0078]
1.1培养基和试剂
[0079]
基础培养基：nh4no31.00g，mgso4.7h2o 0.5g，(nh4)2so
4 0.5g，kh2po
4 0.5g，nacl 0.5g， k2hpo
4 1.5g，h2o1000ml，ph4.0；
[0080]
ph7.0、苯浓度200mg
·
l-1
、cod
cr
为510mg
·
l-1
油漆生产过程产生的含苯废水。
[0081]
1.2菌株对含苯废水处理性能
[0082]
将纯化后的单个菌株
‑‑
类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1以菌量od
415nm
＝0.2接种到 100ml含苯废水(ph7.0、苯浓度200mg
·
l-1
、cod
cr
为510mg
·
l-1
的含苯废水)250ml三角瓶中，以不接菌的苯废水作对照，在30℃,180r
·
min-1
的恒温摇床上振荡好氧培养1天。培养结束后，按照实施例1所述方法测定菌株对苯和codcr的去除率。
[0083]
2.结果
[0084]
菌株在ph7.0、od
415nm
0.2、转速180r
·
min-1
及好氧环境条件下，对苯的去除率分别为 99.99％，处理后废水中苯度为0.02mg
·
l-1
，cod
cr
为20mg
·
l-1
，可达到城镇污水处理厂污染物排放标准(gb18918-2002)(苯0.1mg/l，cod
cr
为50mg
·
l-1
)中的一级a标准，表明本研究分离、筛选的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1是一株可有效处理含苯废水的高效菌株，对控制含苯废水对环境的影响具有一定的应用潜力。
[0085]
对比实验、将筛选过程中获得的其余菌株以及目前现有的类芽孢杆菌及其相近属(如下表2所述)，替代lyx-1后，按照实施例2所述方法进行检测，所得结果与lyx-1的结果对比如下表2所述。
[0086]
表2
[0087]
[0088][0089]
说明：本发明筛选过程中所得lyx-2r、lyx-3s属于是阴沟肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
[0090]
可见本发明所发现的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1是一株可有效处理含苯废水的高效菌株，可高效去除废水中的苯，对控制含苯废水对环境的影响具有一定的应用潜力，而其他相近属却没有该能力或者能力较弱。
[0091]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
技术特征：1.类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1，其特征在于保藏编号：cgmcc no.22158。2.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1，其特征在于：该菌株16s rdna基因序列如seq id no.1所示。3.如权利要求1或2所述的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1用途，其特征在于：处理含苯废水。4.根据权利要求3所述的类芽孢杆菌(paenibacillus sp.)lyx-1用途，其特征在于：去除含苯废水中的苯。
技术总结本发明涉及一株分离自铅锌冶炼厂土壤的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)LYX-1及其在含苯废水处理中的应用。本发明公开了类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)LYX-1，其保藏编号：CGMCC No.22158。类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)LYX-1用途是：处理含苯废水。处理含苯废水。处理含苯废水。
技术研发人员：谢晓梅 廖敏 罗依心 卢雄雄 胡康优
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.02.07
技术公布日：2022/7/5
