重组产生多肽期间减少三硫键的方法
1.本技术为2017年5月9日提交的、发明名称为“重组产生多肽期间减少三硫键的方法”的pct申请pct/us2017/031832的分案申请，所述pct申请进入中国国家阶段的日期为2018年11月9日，申请号为201780028779.x。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2016年5月10日提交的美国临时申请序列号62/334,433的优先权，所述文献通过引用方式完整并入本文。
4.ascii文本文件中提交序列表
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发明领域
6.本公开涉及用于减少重组产生的多肽中三硫键的细胞培养基和方法。
7.发明背景
8.通过以下方式产生三硫键：向二硫键插入附加硫原子，因而导致三个连续硫原子共价键合。三硫键形成是重组产生的治疗用多肽中不均一性的来源。这种不均一性是不希望的，因为治疗用产物必须接受深入表征并且符合确保产品质量和一致性的可接受标准。从而，需要在生产治疗用多肽期间降低三硫键水平的方法。本领域中还需要最小化生产期间治疗用多肽中三硫键水平的变异性。本公开涉及这种需求和其他需求。
9.发明简述
10.提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述方法包括：(a)使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁、ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)、iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡哆醇或吡哆醛(维生素b6)、iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸(维生素b9)、v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)、vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；(b)培养宿主细胞以产生多肽；和(c)收获由宿主细胞产生的多肽。在一个相关方面，提供一种用于产生多肽的方法，所述方法包括：使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：在约2μm至约35μm之间的铁、在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)、在约4.5μm至约80μm之间的吡哆醇或吡哆醛(维生素b6)、在约3.4μm至约23μm之间的叶酸(维生素b9)、在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)、在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；(b)培养宿主细胞以产生多肽；和(c)收获由宿主细胞产生的多肽。
11.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，收获的多肽具有比相同条件下产生的多肽低的三硫键水平，例外在于一种或多种组分的浓度不同于(a)中所述的浓度。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，基础培养基缺少胱氨
酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，基础培养基包含在约1.4mm至3mm之间的半胱氨酸或胱氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，基础培养基包含在约0mm至约1.58mm之间的甲硫氨酸和在约0mm至约3mm之间的半胱氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，基础培养基包含约6mm半胱氨酸。
12.还提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述方法包括：(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁、ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)、iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)、iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)、v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)、vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；(b)产生多肽；(c)并收获由宿主细胞产生的多肽。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，细胞培养基中一种或多种组分的浓度是接种后一次或多次添加的累积浓度。
13.提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁、ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)、iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)、iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)、v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)、vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；(b)产生多肽；(c)并收获由宿主细胞产生的多肽。
14.还提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁，和ii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；(b)产生多肽；并且(c)收获由宿主细胞产生的多肽。
15.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括至少一种补料，并且其中补料培养基缺少以下一种或多种：铁、核黄素、吡哆醇、吡哆醛、叶酸和氰钴胺。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，补料是分批补料。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，分批补料培养基缺少胱氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，分批补料培养基缺少半胱氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，分批补料培养基缺少甲硫氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，铁是三价铁(fe
3+
)或亚铁(fe
2+
)。
16.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括：(i)在收获之前向所述宿主细胞的培养物补充络合剂和还原剂；(ii)向所述宿主细胞的收获前细胞培养液(phccf)补充络合剂和还原剂；或(iii)在收获后向所述宿主细胞的已收获细胞培养液(hccf)补充络合剂和还原剂。
17.还提供一种用于降低宿主细胞产生的多肽中三硫键水平的方法，所述方法包括：(i)在收获之前向所述宿主细胞的培养物补充还原剂和络合剂；(ii)向所述宿主细胞的收获前细胞培养液(phccf)补充络合剂和还原剂；或(iii)向所述宿主细胞的已收获细胞培养液(hccf)补充还原剂和络合剂。
18.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，向所述宿主细胞的培养物、phccf或hccf在补充还原剂之前补充络合剂。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，向所述宿主细胞的phccf或hccf在补充还原剂之前的约60分钟至约30分钟之间补充络合剂。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将络合剂和还原剂在所述宿主细胞的培养物、phccf或hccf中维持约30分钟至约4天。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将所述宿主细胞的培养物、phccf或hccf在约15℃和约37℃之间的温度维持。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将所述宿主细胞的培养物、phccf或hccf在约6.5至约7.5之间的ph维持。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，所述宿主细胞的培养物、phccf或hccf中溶解氧(do)的量是至少约15％。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将所述宿主细胞的培养物、phccf或hccf在约15℃和约37℃之间的温度和约6.5至约7.5之间的ph维持，并且其中所述宿主细胞的培养物或hccf中溶解氧(do)的量是至少约15％。
19.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂选自：谷胱甘肽(gsh)、l-谷胱甘肽(l-gsh)、半胱氨酸、l-半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)、2,3-叔丁基-4-羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、3-氨基丙-1-磺酸、腺苷酰同型半胱氨酸、鹅肌肽、b-丙氨酸、b-胡萝卜素、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯、肌肽、卡维地洛、姜黄素、半胱胺、盐酸半胱胺、地塞米松、二烯丙基二硫化物、dl-羊毛硫氨酸、dl-thiorphan、乙氧喹、没食子酸、龙胆酸钠盐水合物、谷胱甘肽二硫化物、还原型谷胱甘肽乙基酯、甘氨酸、氢化可的松、亚牛磺酸、羟乙基磺酸铵盐、l-半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、l-半胱氨酸亚磺酸一水合物、硫辛酸、还原型硫辛酸、巯丙酰甘氨酸、甲硫氨酸、亚甲基双(3-硫代丙酸)、草酸、栎素水合物、白藜芦醇、视黄酸、s-羧甲基-l-半胱氨酸、硒、硒代甲硫氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸银、牛磺酸、硫代乳酸、tricine、维生素c、维生素e、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b4、维生素b5、维生素b6和维生素b11。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂选自：半胱氨酸和l-半胱氨酸。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，还原剂是l-半胱氨酸，并且其中将l-半胱氨酸添加至所述宿主细胞的培养物或hccf，以实现约3mm和约6mm之间的终浓度。
20.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，络合剂选自：乙二胺四乙酸(edta)、氨三乙酸(nta)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、亚乙基-双(氧乙烯次氮基)四乙酸(egta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、5-磺基水杨酸、n,n-二甲基十二烷基胺n-氧化物、二硫代草酰胺、乙二胺、水杨醛肟、n-(2
’‑
羟乙基)亚胺基二乙酸(himda)、8-羟基喹啉喹啉醇和sulphoxine。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，络合剂选自：乙二胺四乙酸(edta)、氨三乙酸(nta)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)和柠檬酸盐。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，将络合剂添加至所述宿主细胞的培养物或hccf，以实现20mm的终浓度。
21.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，多肽分泌入细胞培养
基。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括纯化已收获多肽的步骤。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，宿主细胞是重组宿主细胞。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，哺乳动物细胞是cho细胞。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，该方法还包括测量多肽中的三硫键水平。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，多肽中的平均三硫键％小于约20％、小于约10％小于约5％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％。
22.在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，多肽是抗体或其片段。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，多肽是抗体片段，并且其中抗体片段选自：fab、fab’、f(ab’)2、scfv、(scfv)2、dab、互补决定区(cdr)片段、线性抗体、单链抗体分子、迷你抗体、双抗体(diabody)和从抗体片段形成的多特异性抗体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，抗体或其片段与选自以下的抗原结合：bmpr1b、e16、steap1、0772p、mpf、napi3b、sema 5b、psca hlg、etbr、msg783、steap2、trpm4、c5、cripto、cd21、cd79b、fcrh2、her2、nca、mdp、il20rα、brevican、ephb2r、aslg659、psca、geda、baff-r、cd22、cd79a、cxcr5、hla-dob、p2x5、cd72、ly64、fcrh1、irta2、tenb2、pmel17、tmeff1、gdnf-ra1、ly6e、tmem46、ly6g6d、lgr5、ret、ly6k、gpr19、gpr54、asphd1、酪氨酸酶、tmem118、gpr172a、cd33、cll-1、ox40、α4β7和αeβ7整联蛋白异二聚体、il-13、cd-20、fgfr、甲型流感、乙型流感、淀粉样蛋白β、her3、补体因子d、il-22c、pd-l1、pd-l2、pd-1、vegf、血管生成素2、cd3、fap、cea和il-6。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，多肽是抗体，并且其中抗体是双特异性抗体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，双特异性抗体是抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗ang2/抗vegf双特异性抗体。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，多肽是免疫细胞因子。在根据(或如适用于)上述任何实施方案的某些实施方案中，免疫细胞因子是cea-il2v或fap-il2v。
23.还提供细胞培养基中约0和约4.5μm之间的甲硫氨酸降低多肽中三硫键水平的用途，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体。
24.应该理解，本文所述的各个实施方案的一个、一些或全部特征可以组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些方面和其他方面将对于本领域技术人员变得显而易见。
25.本文中援引的全部出版物、专利和专利申请通过引用的方式完整并入用于全部目的。
26.附图简述
27.图1提供为评估抗flub中三硫键％所进行的实验的结果，所述抗flub在含有培养基1+半胱氨酸(cys)；培养基1+cys+fe(铁)；培养基1+胱氨酸(cys-cys)；培养基1+cys-cys+fe；培养基2+cys；培养基2+cys+fe；培养基2+cys-cys；或培养基1+cys-cys+fe的无细胞系统中温育。
28.图2a提供为评估抗flub中三硫键％所进行的实验的结果，所述抗flub在补充以下
一种或多种组分：(a)cys-cys、(b)fe和(c)b族维生素(核黄素、吡哆醇、叶酸和氰钴胺)的培养基1中温育。
29.图2b提供为评估抗ox40抗体中三硫键％所进行的实验的结果，所述抗ox40抗体在补充以下一种或多种组分：(a)cys-cys、(b)fe和(c)b族维生素(核黄素、吡哆醇、叶酸和氰钴胺)的培养基1中温育。
30.图3提供以下实验的结果，其中进行所述实验以评估添加的cys或添加的cys-cys对cho细胞培养物产生的抗ox40抗体中三硫键水平的影响。
31.图4a提供以下实验的结果，其中进行所述实验以评估基础培养基中不同cys浓度对cho细胞培养物产生的抗ox40抗体中三硫键水平的影响。
32.图4b提供由图4a中所述的每个细胞培养试验(run)产生的抗ox40抗体的产率。
33.图5a提供以下实验的结果，其中进行所述实验以评估在基础培养基中提供不同浓度的cys和fe以及在分批补料培养基中提供不同浓度的b族维生素对cho细胞培养物产生的抗ox40抗体中三硫键水平的影响。
34.图5b提供由图5a中所述的每个细胞培养试验产生的抗ox40抗体的产率。
35.图5c显示在图5a中每个细胞培养试验结束时，培养基中胱氨酸(cys-cys)的残余浓度。
36.图6提供以下实验的结果，其中进行所述试验以评估在基础培养基中不同浓度的fe和分批补料培养基中b族维生素对cho细胞培养物产生的抗ox40抗体中三硫键水平的影响。
37.图7a提供以下实验的结果，其中进行所述试验以评估向抗ox40抗体的已收获细胞培养液添加半胱氨酸或半胱氨酸+edta对该抗体中三硫键水平的影响。
38.图7b显示图7a中描述的实验的ce-sds的结果，其中所述实验评估在图7a中测试的每种条件下维持的抗ox40抗体中的二硫键减少量。
39.图8a提供以下实验的结果，其中进行所述试验以评估向抗ox40抗体的细胞培养液添加半胱氨酸、半胱氨酸+edta、半胱氨酸+nta、半胱氨酸+edds或半胱氨酸+柠檬酸盐对添加后0至5小时该抗体中三硫键水平的影响。
40.图8b提供以下实验的结果，其中进行所述试验以评估向抗ox40抗体的细胞培养液添加半胱氨酸、半胱氨酸+edta、半胱氨酸+nta、半胱氨酸+edds或半胱氨酸+柠檬酸盐对添加后0至96小时该抗体中三硫键水平的影响。
41.图9提供以下实验的结果，其中实施所述试验以评估细胞培养期间亚牛磺酸对抗ox40抗体中三硫键形成的影响。
42.图10提供显示降低甲硫氨酸浓度显著影响三硫键减少的预测剖析图
43.图11提供以下实验的结果，其中实施所述试验以评估在基础培养基中提供不同浓度的半胱氨酸和甲硫氨酸对cho细胞培养物产生的双特异性抗体中三硫键水平的影响。
44.图12提供以下实验的结果，其中实施所述试验以评估从分批补料培养基省略b族维生素对cho细胞培养物产生的抗体中三硫键水平的影响。进行两次独立试验。
45.发明详述
46.本发明涉及防止、消除细胞培养时产生的多肽(如抗体和双特异性抗体)中三硫键和/或降低其水平的方法。在某些方面，本文提供的方法包括包括：使宿主细胞与基础培养
基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁、ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)、iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡哆醇或吡哆醛(维生素b6)、iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)、v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)、vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；培养宿主细胞以产生多肽；并收获由宿主细胞产生的多肽，因而多肽中的三硫键水平降低。
47.在一个相关方面，提供用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种：i)在约2μm至约35μm之间的铁、ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)、iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)、iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)、v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)、vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；
48.产生多肽；并收获由宿主细胞产生的多肽，因而多肽中的三硫键水平降低。
49.额外地或可选地，该方法包括向所述宿主细胞的培养物或细胞培养液、所述宿主细胞的收获前细胞培养液(phccf)或所述宿主细胞的已收获细胞培养液(hccf)补充络合剂和还原剂。
50.以下描述阐述了示例性方法、参数等。然而，应当认识到，这类描述不意图对本公开范围的限制，而是作为示例性实施方案的说明提供。
51.一般技术
52.本文中描述或援引的技术和方法通常由本领域技术人员使用常规方法时充分理解并寻常使用，例如，广泛利用的方法学在下述中描述：sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual第3版(2001)cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等人编著,(2003))；the series methods in enzymology(academic press,inc.)；antibodies,a laboratory manual,and animal cell culture(r.i.freshney编著(1987))；methods in molecular biology,humana press；cell biology:introduction to cell and tissue culture(j.p.mather和p.e.roberts,1998)plenum press；cell and tissue culture:laboratory procedures(a.doyle,j.b.griffiths和d.g.newell编著,1993-8)j.wiley and sons；handbook of experimental immunology(d.m.weir和c.c.blackwell编著)；current protocols in immunology(j.e.coligan等人编著,1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway和p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty.编著,irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd和c.dean编著,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow和d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；以及the antibodies(m.zanetti和j.d.capra编著,harwood academic publishers,1995)。
53.i.a.定义
54.除非内容另外清楚地说明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指称。因此，对“分子”的指称任选地包括两个或更多个这类分子的组合等。
55.如本文所用的术语“约”指本技术领域的技术人员轻易已知的相应值的常规误差范围。本文中对“约”某个值或参数的谈及包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
56.可以理解本文所述的本发明方面和实施方案包括“包括”、“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”方面和实施方案。
57.术语“培养基”和“细胞培养基”指用于培育或维持细胞的养分源。如本领域技术人员理解，养分源可以含有为细胞生长和/或存活和/或产物生成所需要的组分，或可以含有辅助细胞生长和/或存活和/或产物生成的组分。维生素、必需或非必需氨基酸、痕量元素和表面活性剂(例如，泊洛沙姆)是培养基组分的例子。
58.例如，“化学成分确定的细胞培养基”或“cdm”指具有详述组成的培养基，其不含动物衍生产物，如动物血清和蛋白胨。本术语还涵盖具有详述组成的培养基，其不含不确定的或部分确定的组分，例如，诸如动物血清、动物蛋白胨(水解物)、植物蛋白胨(水解物)和酵母蛋白胨(水解物)的组分。如本领域技术人员将理解，cdm可以用于多肽生产过程中，因而细胞与cdm接触并将多肽分泌至其中。因此，可以理解，组合物可以含有cdm和多肽产物并且多肽产物的存在不使得cdm在化学上不确定。
59.例如，“化学成分不确定的细胞培养基”指这样的培养基，其化学组成不能详述并且它可能含有一种或多种动物衍生产物，如血清和蛋白胨。如本领域技术人员将理解，在化学上不确定的细胞培养基可能含有动物衍生产物作为养分源。本术语还可以涵盖细胞培养基，其包含不确定的或部分确定的组分，例如，诸如动物血清、动物蛋白胨(水解物)、植物蛋白胨(水解物)或酵母蛋白胨(水解物)的组分。
60.如本文所用，“基础培养基”指在培养过程开始时，含有供应给培养容器的细胞培养用养分的细胞培养基。基础培养基可以是在细胞培养周期之前细胞接种入其中的培养基。可以在细胞培养周期之前供应基础细胞培养基用于分批或补料分批细胞培养。基础细胞培养基也可以在培养过程期间作为补料培养基连续或按分立增量供应给细胞培养物，同时培养终止之前定期收获或不收获细胞或产物(即，补料分批细胞培养)。
61.如本文所用，“补料培养基”指含有细胞培养用养分的细胞培养基，其在培养过程期间作为补料培养基连续或按分立增量供应给培养容器，同时培养终止之前定期收获或不收获细胞或产物(即，补料分批细胞培养)。
[0062]“培养”细胞指使细胞与细胞培养基在适合细胞的活力和/或生长和/或增殖的条件下接触。
[0063]“分批培养”指其中将用于细胞培养的全部组分(包括细胞和全部培养用养分和组分)在培养过程开始时供应给培养容器的培养。
[0064]“灌流培养”是将细胞例如通过过滤、囊化、锚定至微载体等固定在培养物中并且将培养基连续或间歇引入培养容器并从中移除的培养。
[0065]
如本文所用的短语“补料分批细胞培养”指这样的分批培养，其中将细胞和培养基
初始供应给培养容器并且将额外的培养用养分在培养期间连续或以分离增量补料至培养物，同时终止培养之前定期收获或不收获细胞和/或产物。
[0066]“培养容器”指用于培养细胞的容器。培养容器可以具有任何尺寸，只要它可用于培养细胞即可。
[0067]
术语“痕量金属”指细胞为生长、存活和/或产物生成而少量需要的金属。本文范围内涵盖的痕量金属的例子包括但不限于铁(包含亚铁(也称作fe(ii)或fe 2+
)和三价铁(也称作fe(iii)或fe 3+
)、镁、锂、硅、锌、铜、铬、镍、钴、锰、铝、钒、硒、锡、镉、钼和钛。
[0068]
术语“抗氧化剂”指减缓其他分子的氧化速率的分子。本文范围内涵盖的抗氧化剂的例子包括但不限于2,3-叔丁基-4-羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、3-氨基丙-1-磺酸、腺苷酰同型半胱氨酸、鹅肌肽、b-丙氨酸、b-胡萝卜素、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯、肌肽、卡维地洛、姜黄素、半胱胺、盐酸半胱胺、半胱氨酸、地塞米松、二烯丙基二硫化物、dl-羊毛硫氨酸、dl-thiorphan、乙氧喹、没食子酸、龙胆酸钠盐水合物、谷胱甘肽(gsh)、谷胱甘肽二硫化物、还原型谷胱甘肽乙基酯、甘氨酸、氢化可的松、亚牛磺酸、羟乙基磺酸铵盐、l-半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、l-半胱氨酸亚磺酸酸一水合物、硫辛酸、还原型硫辛酸、巯丙酰甘氨酸、甲硫氨酸、亚甲基双(3-硫代丙酸)、草酸、栎素水合物、白藜芦醇、视黄酸、s-羧甲基-l-半胱氨酸、硒、硒代甲硫氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸银、牛磺酸、硫羟乳酸、tricine、维生素c、维生素e、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b4、维生素b5、维生素b6和维生素b11。
[0069]“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以由dna或rna聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。
[0070]“分离的核酸”意指并涵盖非天然存在的、重组的或天然存在的在其通常背景外部或从其分离的序列。分离的核酸分子是与其在自然界中存在的形式或背景不同。分离的核酸分子因此与如其在天然细胞中存在的核酸分子区分。但是，分离的核酸分子包括在细胞内所含的核酸分子，所述核酸分子通常在该核酸分子例如处在与天然细胞不同的染色体位置情况下表达蛋白质。
[0071]“分离的”蛋白质(例如，分离的抗体)是已经鉴定过并且与其自然环境的组分分离和/或从其中回收的一种抗体或多肽。其自然环境的杂质组分是将干扰该蛋白质的研究用途、诊断用途或治疗用途的物质并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。分离的蛋白质包括重组细胞内部在原位的蛋白质，因为该蛋白质的自然环境的至少一种组分将不存在。然而，一般将通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质。
[0072]“纯化的”蛋白质(例如，抗体)意指这样的蛋白质，其纯度已经增加，从而所述多肽以比其在天然环境下和/或最初在实验室条件下产生和/或合成和/或扩增时存在的更纯的形式存在。“纯度”是相对术语和不必然地意指绝对纯度。
[0073]“杂质”指与所需的蛋白质产物不同(例如，与抗体产物不同)的物质。杂质可以包括，而不限于：宿主细胞物质，如chop；核酸；所需蛋白质的变体、片段、聚集物或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。
[0074]
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且任意长度的氨基酸聚合物。该聚
合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经天然地修饰或通过干预(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如以标记组分缀合)而修饰的氨基酸聚合物。在该定义范围内还包括例如这样的多肽，它们含有氨基酸的一个或多个类似物(例如包含非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰。本文范围内涵盖的多肽的例子包括哺乳动物蛋白质，例如，肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素a-链；胰岛素b-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子viiic、因子ix、组织因子和von willebrands因子；抗凝血因子如c蛋白；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-pa)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；rantes(活化时受调节、正常时t-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒氏管抑制物质；松弛素a-链；松弛素b-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；dna酶；ige；细胞毒性t-淋巴细胞相关抗原(ctla)，如ctla-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；受体激素或生长因子；蛋白a或d；类风湿因子；神经营养因子如骨衍生神经营养因子(bdnf)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)或神经生长因子如ngf-b；血小板衍生生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子如afgf和bfgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i)、胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbp)；cd蛋白如cd3、cd4、cd8、cd19和cd20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(csf)，例如，m-csf、gm-csf和g-csf；白介素(il)，例如，il-1α至il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒性抗原如，例如，aids包膜蛋白的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如cd11a、cd11b、cd11c、cd18、icam、vla-4和vcam；肿瘤相关抗原如0772p(ca125、muc16)(即，卵巢癌抗原)或her2、her3或her4受体；免疫黏附素；和前文所列任一种蛋白质的片段和/或变体以及与蛋白质(例如，包括前文所列任一种蛋白质)结合的抗体，包括抗体片段。
[0075]
如本文所用的“术语”滴度指细胞培养物产生的已表达蛋白质产物的总量除以给出的培养基容积量。滴度可以从相对量度角度表述或评估，如与不同培养条件下获得的蛋白质产物相比，滴度增加百分数。
[0076]
术语“抗体”在本文中以最广意义使用和特别地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的生物学活性即可。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
[0077]
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指处于其基本上完好形式的抗体，不指如下文定义的抗体片段。该术语特别指具有重链的抗体，所述重链含有fc区。
[0078]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区(可以可互换地使用术语“抗原结合片段”)。抗体片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
[0079]
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段，称作“fab”片段，各自具有
单个抗原结合位点，和一个残余“fc”片段，该片段的名称反映其轻易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的f(ab')2片段。fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段因在重链ch1结构域的羧基端处附加几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与fab片段不同。fab'-sh在本文是fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离巯基。f(ab')2抗体片段最初作为成对fab片段产生，所述成对fab片段在它们之间具有铰合半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0080]“fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链fv种类由处于紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链fv(scfv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头如此共价连接，从而轻链和重链可以按照与双链fv种类中类似的“二聚体”结构缔合。正是在这种格局中每个可变结构域的三个hvr相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，六个hvr赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的hvr的半个fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然以比完整结合部位更低的亲和力进行。
[0081]“单链fv”或“scfv”抗体片段包括抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，scfv多肽还包含在vh结构域和vl结构域之间的多肽接头，所述多肽接头能够使scfv形成用于抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，参见pluckth
ü
n,引自pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编著,springer-verlag,new york,第269-315页,1994。
[0082]
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，例如，构成这个群体的各个抗体是基本上相同的，例外是可能少量存在的可能突变，例如，天然存在的突变。因此，修饰语“单克隆”表明该抗体的特征为不是独立抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体一般包括了包含结合某靶的多肽序列的抗体，其中通过以下方法获得靶结合的多肽序列，所述方法包括从多个多肽序列中选择单个靶结合的多肽序列。例如，该选择过程可以是从多个克隆(例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组dna克隆的汇集物)选择独特克隆。应当理解，可以进一步改变所选择的靶结合序列，例如以便改善对该靶的亲和力、以便人源化靶结合序列、以便改善其在细胞培养中的产生、以便降低其体内免疫原性、以便产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制备物也是有利的，在于它们一般不混杂有其他免疫球蛋白。
[0083]
修饰语“单克隆的”表明该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括，例如，杂交瘤方法(例如，kohler和milstein,nature,256:495-97(1975)；hongo等人,hybridoma,14(3):253-260(1995)；harlow等人,antibodies:a laboratory manual,(cold spring harbor laboratory press,第2版,1988)；hammerling等人,引自：monoclonal antibodies and t-cell hybridomas 563-681(elsevier,n.y.,1981)、重组dna方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见，例如，
clackson等人,nature,352:624-628(1991)；marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1992)；sidhu等人,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等人,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa 101(34):12467-12472(2004)；和lee等人,j.immunol.methods 284(1-2):119-132(2004)、和在具有编码人免疫球蛋白序列的部分或全部人免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人抗体或人样抗体的技术(参见，例如，wo 1998/24893；wo 1996/34096；wo 1996/33735；wo 1991/10741；jakobovits等人,proc.natl.acad.sci.usa 90:2551(1993)；jakobovits等人,nature 362:255-258(1993)；bruggemann等人,year in immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；marks等人,bio/technology 10:779-783(1992)；lonberg等人,nature 368:856-859(1994)；morrison,nature 368:812-813(1994)；fishwild等人,nature biotechnol.14:845-851(1996)；neuberger,nature biotechnol.14:826(1996)以及lonberg和huszar,intern.rev.immunol.13:65-93(1995))。
[0084]“人抗体”是一种抗体，所述抗体拥有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用如本文中公开的产生人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的多种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等人,j.mol.biol.,222:581(1991)。在cole等人,monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,第77页(1985)；boerner等人,j.immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还参见van dijk和van de winkel,curr.opin.pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过施用抗原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生此类抗体，但是其内源基因座已经失能，例如，免疫的xenomice(关于xenomouse
tm
技术，例如参见美国专利号6,075,181和6,150,584).。关于借助人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体，例如还参见li等人,proc.natl.acad.sci.usa,103:3557-3562(2006)。
[0085]
术语“超变区”、“hvr”或“hv”使用时指抗体可变结构域中在序列上高度变化和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个hvr；vh中三个(h1、h2、h3)和vl中三个(l1、l2、l3)。在天然抗体中，h3和l3显示这六个hvr的大部分多样性，并且尤其认为h3在赋予精细特异性至抗体方面发挥独特作用。例如，参见xu等人,immunity 13:37-45(2000)；johnson和wu，引自methods in molecular biology 248:1-25中(lo编著,human press,totowa,n.j.,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的camelid抗体在轻链不存在的情况下是有功能和稳定的。例如参见，hamers-casterman等人,nature 363:446-448(1993)；sheriff等人,nature struct.biol.3:733-736(1996)。
[0086]
本文中使用和包括了众多的hvr描述。kabat互补性决定区(cdr)基于序列变异性并且是最常使用的(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。相反，chothia指结构环的位置(chothia和lesk j.mol.biol.196:901-917(1987))。abm hvr代表了kabat hvr和chothia结构环之间的折中方案，并且由oxford molecular’s abm建模软件使用。“接触”hvr基于可获得的复合物晶体结构的分析结果。下文指出来自这些
hvr的每一者中的残基。
[0087][0088]
hvr可以包含如下“延长的hvr”：vl中的24-36或24-34(l1)、46-56或50-56(l2)和89-97或89-96(l3)和vh中的26-35(h1)、50-65或49-65(h2)和93-102、94-102或95-102(h3)。对于这些定义中的每一者，可变结构域残基根据kabat等人上文编号。
[0089]“构架”或“fr”残基是除如本文中定义的hvr残基之外的那些可变结构域残基。
[0090]
术语“如kabat中编号的可变结构域残基”或”如kabat中编号的氨基酸位置”和其变型，指用于kabat等人,上文中抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号体系。使用这种编号体系，实际的线性氨基酸序列可以含有与对应于可变结构域fr或hvr缩短或向其中插入的更少或额外氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在h2的残基52后的单个氨基酸插入(根据kabat的残基52a)和在重链fr残基82之后的插入残基(例如，根据kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗体，可以通过在抗体的序列的同源区域处与kabat编号的“标准”序列比对，确定残基的kabat编号。
[0091]
当提到可变结构域中的残基(大约第1-107位轻链残基和第1-113位重链残基)时，通常使用kabat编号系统(例如，kabat等人,sequences of immunological interest.第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。当提到免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“eu编号系统”或“eu index”(例如，kabat等人上文中报道的eu index)。“如kabat中那样的eu index”指人igg1 eu抗体的残基编号法。
[0092]
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许活性成分的生物学活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。这类制剂是无菌的。
[0093]“可药用”载体、赋形剂或稳定剂是在所用的剂量和浓度上对与之接触的细胞或哺乳动物无毒的那些(remington's pharmaceutical sciences(第20版),编著a.gennaro,2000,lippincott,williams&wilkins,philadelphia,pa)。经常地，生理可接受载体是ph缓冲的水溶液。生理可接受载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；络合剂如edta；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如tween
tm
、聚乙二醇(peg)和pluronics
tm
。
[0094]“无菌”制剂是无菌或不含或基本上不含全部活微生物和它们的孢子。
[0095]
术语“收获前的细胞培养液”指在细胞培养结束、细胞培养后或就在细胞收获之前存在的流体。收获前的细胞培养液包括，但不限于，任选地添加一种或多种本发明物质的细胞培养基。收获前的细胞培养液包括，但不限于，尚未从其中移除细胞、细胞内容物和/或细胞残片的细胞培养基。细胞培养基和/或收获前的细胞培养液可以含有细胞在培养期间释放(例如，分泌)入培养基或溶液中的蛋白质或抗体。细胞培养液的条件针对细胞生长优化，而可以预处理收获前的和收获的细胞培养液以优化用于细胞分离和纯化由宿主细胞分泌的多肽(如重组多肽，例如，抗体)。例如，收获前步骤可以包括通过降低温度、改变ph(通常降低至约5的ph或小于约7的ph)和絮凝，制备培养物用于收获。当细胞培养液可以从其中正在培养细胞的生物反应器直接泵送到离心机或滤器用于收获步骤时，收获前步骤可以是任选的。在收获之前不采用预处理的情况下，收获前的细胞培养液和细胞培养液不可区分。
[0096]“已收获的细胞培养液”指在细胞分离过程期间和借助各种方法(如离心或过滤)使细胞与细胞培养基分离之后存在的流体。已收获的细胞培养液一般包含细胞在细胞培养期间分泌的多肽(如重组多肽，例如，抗体)。
[0097]
ii.b本发明的细胞培养和方法
[0098]
iii.降低多肽中三硫键水平的方法
[0099]
通过以下方式产生三硫键：向二硫键插入附加硫原子，因而导致三个连续硫原子共价键合。三硫键可以在多肽中的半胱氨酸残基之间形成并且可以分子内(即，在同一条多肽中的二个半胱氨酸之间)或分子间(即在独立多肽中的二个半胱氨酸之间)形成。本文中提供用于细胞培养期间降低多肽中三硫键水平的方法。本文中还提供用于细胞培养后加工期间降低多肽中三硫键水平的方法。本文方法可以有利地用于大规模(如按照生产规模)生产含二硫键的多肽(例如，抗体)。
[0100]
在某些实施方案中，宿主细胞在例如促进细胞生长和/或多肽产生的条件下与本文所述的任何细胞培养基(如基础细胞培养基)组合(接触)。在某些实施方案中，术语“接种物”指来自种子罐向基础培养基添加的某体积的宿主细胞。在某些实施方案中，接种物包含额外组分，例如，种子罐介质。
[0101]
在某些实施方案中，术语“初始细胞培养基”指在混合接种物和基础培养基后的细胞培养基。在某些实施方案中，接种物和基础培养基按照约1:5、1:4.5、1:4、1:3.5或1:3中任一者的比率(包括在其之间的任何比率)混合。在某些实施方案中，将额外组分在混合接种物和基础培养基后的某个时间连续地或按一个或多个独立间隔提供给培养物。在某些实施方案中，术语“累积性”指不考虑细胞消耗或生成的情况下，在细胞培养期间添加的某种或多种特定组分的总量，所述组分包括在细胞培养伊始添加的组分和随后添加的组分。
[0102]
在某些实施方案中，提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述方法包括：使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：
[0103]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0104]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0105]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0106]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，
[0107]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0108]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0109]
vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；
[0110]
培养宿主细胞以产生多肽；并收获由宿主细胞产生的多肽，因而多肽中的三硫键水平降低。在某些实施方案中，收获的多肽具有比相同条件下产生的多肽的三硫键水平低的三硫键水平，例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。在某些实施方案中，收获的多肽中的平均三硫键％小于约以下任一个百分数：20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％(mol三硫键/mol多肽)。在某些实施方案中，相对于相同条件下产生的多肽的三硫键水平，收获的多肽中平均三硫键减少约以下任一个百分数：10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或多于99％、例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。
[0111]
在某些实施方案中，提供一种用于产生多肽的方法，包含：所述方法包括：使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：
[0112]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0113]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0114]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0115]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，
[0116]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0117]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0118]
vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；
[0119]
培养宿主细胞以产生多肽；并收获由宿主细胞产生的多肽，因而多肽中的三硫键水平降低。在某些实施方案中，收获的多肽具有比相同条件下产生的多肽的三硫键水平低的三硫键水平，例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。在某些实施方案中，收获的多肽中的平均三硫键％小于约以下任一个百分数：20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％(mol三硫键/mol多肽)。在某些实施方案中，相对于相同条件下产生的多肽的三硫键水平，收获的多肽中平均三硫键减少约以下任一个百分数：10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或多于99％、例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。
[0120]
在某些实施方案中，提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述方法包括：将包含编码多肽的核酸的宿主细胞在细胞培养基中培养，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：
[0121]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0122]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0123]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0124]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，
[0125]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0126]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0127]
vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；
[0128]
产生多肽；并收获由宿主细胞产生的多肽。在某些实施方案中，细胞培养基中一种或多种组分的浓度是接种后一次或多次添加的累积浓度。
[0129]
在某些实施方案中，提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：
[0130]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0131]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0132]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0133]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，
[0134]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0135]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0136]
vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；
[0137]
产生多肽；并收获由宿主细胞产生的多肽，因而多肽中的三硫键水平降低。在某些实施方案中，cea-il2v免疫细胞因子是rg7813。在某些实施方案中，fap-il2v免疫细胞因子是rg7461。在某些实施方案中，抗cea/抗cd3双特异性抗体是rg7802。在某些实施方案中，抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体是rg7716。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是rg7221。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是cas编号1448221-05-3。在某些实施方案中，抗cd40抗体是rg7876。在某些实施方案中，细胞培养基是初始的细胞培养基。在某些实施方案中，收获的多肽具有比相同条件下产生的多肽的三硫键水平低的三硫键水平，例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。在某些实施方案中，收获的多肽中的平均三硫键％小于约以下任一个百分数：20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％(mol三硫键/mol多肽)。在某些实施方案中，相对于相同条件下产生的多肽的三硫键水平，收获的多肽中平均三硫键减少约以下任一个百分数：10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或多于99％、例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。
[0138]
在某些实施方案中，提供一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：
[0139]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，和
[0140]
ii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；
[0141]
产生多肽；并收获由宿主细胞产生的多肽，因而多肽中的三硫键水平降低。在某些实施方案中，cea-il2v免疫细胞因子是rg7813。在某些实施方案中，fap-il2v免疫细胞因子
是rg7461。在某些实施方案中，抗cea/抗cd3双特异性抗体是rg7802。在某些实施方案中，抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体是rg7716。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是rg7221。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是cas编号1448221-05-3。在某些实施方案中，抗cd40抗体是rg7876。在某些实施方案中，细胞培养基是初始的细胞培养基。在某些实施方案中，收获的多肽具有比相同条件下产生的多肽的三硫键水平低的三硫键水平，例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。在某些实施方案中，收获的多肽中的平均三硫键％小于约以下任一个百分数：20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％(mol三硫键/mol多肽)。在某些实施方案中，相对于相同条件下产生的多肽的三硫键水平，收获的多肽中平均三硫键减少约以下任一个百分数：10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或多于99％、例外在于一种或多种组分的浓度不同于上文所述的浓度。
[0142]
在某些实施方案中，提供细胞培养基中约0和约4.5μm之间的甲硫氨酸降低多肽中三硫键水平的用途，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体。在某些实施方案中，cea-il2v免疫细胞因子是rg7813。在某些实施方案中，fap-il2v免疫细胞因子是rg7461。在某些实施方案中，抗cea/抗cd3双特异性抗体是rg7802。在某些实施方案中，抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体是rg7716。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是rg7221。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是cas编号1448221-05-3。在某些实施方案中，抗cd40抗体是rg7876。
[0143]
在某些实施方案中，基础培养基包含在以下任一项之间的铁：约5μm至约30μm、约10μm至约25μm或约15μm至约20μm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，基础培养基包含以下任一项的铁：约2μm、4μm、6μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、20μm、22μm、24μm、26μm、28μm、30μm、35μm铁，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，基础培养基中的铁源是以下任一项或其组合：硫酸铁(ii)、硫酸铁(iii)、柠檬酸铁(ii)、柠檬酸铁(iii)、硫酸铁(ii)铵六水合物、硫酸铁(iii)水合物、硫酸铁(iii)铵十二水合物、硫酸铁(ii)七水合物、硝酸铁(iii)九水合物、柠檬酸铁(iii)铵、酒石酸铁(iii)、乳酸铁(ii)水合物、草酸铁(iii)六水合物、草酸铁(ii)二水合物、三氟乙酰丙酮铁(iii)、延胡索酸铁(ii)、草酸铵铁(iii)三水合物、葡糖酸铁(ii)水合物、d-葡糖酸铁(ii)二水合物、(+)-l-抗坏血酸铁(ii)。
[0144]
在某些实施方案中，细胞培养基包含在以下任一项之间的铁：约5μm至约30μm、约10μm至约25μm或约15μm至约20μm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，细胞培养基包含以下任一项的铁：约2μm、4μm、6μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、20μm、22μm、24μm、26μm、28μm、30μm、35μm铁，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，细胞培养基中的铁源是以下任一项或其组合：硫酸铁(ii)、硫酸铁(iii)、柠檬酸铁(ii)、柠檬酸铁(iii)、硫酸铁(ii)铵六水合物、硫酸铁(iii)水合物、硫酸铁(iii)铵十二水合物、硫酸铁(ii)七水合物、硝酸铁(iii)九水合物、柠檬酸铁(iii)铵、酒石酸铁(iii)、乳酸铁(ii)水合物、草酸铁(iii)六水合物、草酸铁(ii)二水合物、三氟乙酰丙酮铁(iii)、延胡索酸铁(ii)、草酸铵铁(iii)三水合物、葡糖酸铁(ii)水合物、d-葡糖酸铁(ii)二水合物、(+)-l-抗坏血酸铁(ii)。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础
培养基和补料培养基(如，分批补料培养基)。在某些实施方案中，细胞培养基包含补料培养基(如分批补料培养基)。
[0145]
在某些实施方案中，基础培养基包含在以下任一项之间的维生素b2：约0.15μm至约1.5μm、约0.3μm至约1.0μm或约0.3μm至约0.75μm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，基础培养包含在以下任一项的核黄素(维生素b2)：约0.11μm、0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、或2μm，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，基础培养基中的维生素b2源是以下任一项或其组合：核黄素粉末(9,d-核糖醇6,7二甲基异咯嗪)、核黄素5
’‑
单磷酸或核黄素5
’‑
单磷酸的钠盐形式。
[0146]
在某些实施方案中，细胞培养基包含在以下任一项之间的维生素b2：约0.15μm至约1.5μm、约0.3μm至约1.0μm或约0.3μm至约0.75μm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，细胞培养基包含在以下任一项的核黄素(维生素b2)：约0.11μm、0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、或2μm，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，基础培养基中的维生素b2源是以下任一项或其组合：核黄素粉末(9,d-核糖醇6,7二甲基异咯嗪)、核黄素5
’‑
单磷酸或核黄素5
’‑
单磷酸的钠盐形式。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基和补料培养基(如，分批补料培养基)。在某些实施方案中，细胞培养基包含补料培养基(如分批补料培养基)。
[0147]
在某些实施方案中，基础培养基包含在以下任一项之间的维生素b6：约1.5μm至约75μm、约5μm至约50μm，或约25μm至约40μm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，基础培养基包含以下任一项的维生素b6：约4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm或80μm，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，基础培养基中的维生素b6源是以下任一项或其组合：吡哆醇、吡哆醇单盐酸化物、吡哆醛、吡哆醛单盐酸化物、吡哆醛5
’‑
磷酸、吡哆胺、吡哆胺二盐酸化物、吡哆胺5-磷酸、吡硫醇、4-吡哆酸。
[0148]
在某些实施方案中，细胞培养基包含在以下任一项之间的维生素b6：约1.5μm至约75μm、约5μm至约50μm或约25μm至约40μm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，细胞培养基包含以下任一项的维生素b6：约4.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm或80μm，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，细胞培养物中的维生素b6源是以下任一项或其组合：吡哆醇、吡哆醇单盐酸化物、吡哆醛、吡哆醛单盐酸化物、吡哆醛5
’‑
磷酸、吡哆胺、吡哆胺二盐酸化物、吡哆胺5-磷酸、吡硫醇、4-吡哆酸。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基和补料培养基(如，分批补料培养基)。在某些实施方案中，细胞培养基包含补料培养基(如分批补料培养基)。
[0149]
在某些实施方案中，基础培养基包含在以下任一项之间的维生素b9：约5μm至约20μm、约7μm至约15μm或约10μm至约12μm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，基础培养基包含以下任一项的维生素b9：约3.4μm、5μm、10μm、15μm、20μm或23μm，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，基础培养基中的维生素b9源是以下任一项或其组合：叶酸、叶酸粉末、亚叶酸钙盐、四氢叶酸或4-氨基苯甲酸或对-氨基苯甲酸(paba)。
[0150]
在某些实施方案中，细胞培养基包含在以下任一项之间的维生素b9：约5μm至约20
乙酰基-l-甲硫氨酸、n-乙酰基-d、l-甲硫氨酸、l-甲硫氨酸甲基酯盐酸盐、s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸化物和s-(5
′‑
腺苷酰)-l-甲硫氨酸碘化物。
[0156]
在某些实施方案中，细胞培养基包含在以下任一项之间的甲硫氨酸：约0.5mm至约4.0mm、约1.5mm至约3mm或约2mm至约2.5mm，包括这些值之间的任何范围。在某些实施方案中，细胞培养基包含以下任一项的甲硫氨酸：约0mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm、1.0mm、1.25mm、1.5mm、1.75mm、2.0mm、2.25mm、2.5mm、2.75mm、3.0mm、3.25mm、3.5mm、3.75mm、4.0mm、4.25mm或4.5mm，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，细胞培养基中的甲硫氨酸源是以下任一项或其组合：甲硫氨酸粉末、l-甲硫氨酸、dl-甲硫氨酸、盐酸l-甲硫氨酸溶液、n-乙酰基-l-甲硫氨酸、n-乙酰基-d、l-甲硫氨酸、l-甲硫氨酸甲基酯盐酸盐、s-(5
′‑
腺苷酰)-l-甲硫氨酸氯化物二盐酸化物和s-(5
′‑
腺苷)-l-甲硫氨酸碘化物。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基和补料培养基(如，分批补料培养基)。在某些实施方案中，细胞培养基包含补料培养基(如分批补料培养基)。
[0157]
在某些实施方案中，基础培养基缺少胱氨酸。
[0158]
在某些实施方案中，基础培养基含有在约1.4mm至约3.0mm之间的半胱氨酸或胱氨酸(如以下任一项的半胱氨酸或胱氨酸：约1.4mm、1.6mm、1.8mm、2.0mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3.0mm，包括其之间的任何值)。在某些实施方案中，基础培养基中的半胱氨酸源是以下任一项或其组合：l-半胱氨酸和l-半胱氨酸单盐酸化物一水合物粉末。在某些实施方案中，基础培养基中的胱氨酸源是胱氨酸二钠盐一水合物粉末。
[0159]
在某些实施方案中，细胞培养基含有在约1.4mm至约3.0mm之间的半胱氨酸或胱氨酸(如以下任一项的半胱氨酸或胱氨酸：约1.4mm、1.6mm、1.8mm、2.0mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3.0mm，包括其之间的任何值)。在某些实施方案中，细胞培养基中的半胱氨酸源是以下任一项或其组合：l-半胱氨酸和l-半胱氨酸单盐酸化物一水合物粉末。在某些实施方案中，细胞培养基中的胱氨酸源是胱氨酸二钠盐一水合物粉末。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基和补料培养基(如，分批补料培养基)。在某些实施方案中，细胞培养基包含补料培养基(如分批补料培养基)。
[0160]
在某些实施方案中，基础培养基包含在约0mm至约1.58mm之间的甲硫氨酸(如以下任一项的甲硫氨酸：约0mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm、1mm、1.25mm或1.58mm，包括其之间的任何值)。在某些实施方案中，基础培养基包含约0mm至约3.0mm半胱氨酸(如以下任一项的半胱氨酸：约0mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2.0mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3.0mm，包括其之间的任何值)。在某些实施方案中，基础培养基包含在约0mm至约1.58mm之间的甲硫氨酸(如以下任一项的甲硫氨酸：约0mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm、1mm、1.25mm或1.58mm，包括其之间的任何值)和约0mm至约3.0mm之间的半胱氨酸(如以下任一项的半胱氨酸：约0mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2.0mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3.0mm，包括其之间的任何值)。
[0161]
在某些实施方案中，细胞培养基包含在约0mm至约1.58mm之间的甲硫氨酸(如以下任一项的甲硫氨酸：约0mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm、1mm、1.25mm或1.58mm，包括其之间的任何值)。在某些实施方案中，细胞培养物包含约0mm至约3.0mm半胱氨酸(如以下任一项的半胱氨酸：约0mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2.0mm、
2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3.0mm，包括其之间的任何值)。在某些实施方案中，细胞培养基包含在约0mm至约1.58mm之间的甲硫氨酸(如以下任一项的甲硫氨酸：约0mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm、1mm、1.25mm或1.58mm，包括其之间的任何值)和约0mm至约3.0mm之间的半胱氨酸(如以下任一项的半胱氨酸：约0mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2.0mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3.0mm，包括其之间的任何值)。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基。在某些实施方案中，细胞培养基包含基础培养基和补料培养基(如，分批补料培养基)。在某些实施方案中，细胞培养基包含补料培养基(如分批补料培养基)。
[0162]
在某些实施方案中，该方法包括按一个或多个增量向宿主细胞培养物添加浓缩的养分混合物(“分批补料”)。在某些实施方案中，分批补料培养基缺少铁(fe，如fe(ii)和/或fe(iii))。在某些实施方案中，分批补料缺少以下一种或多种：核黄素(维生素b2)、吡哆醇(维生素b6)、吡哆醛(维生素b6)、叶酸盐/叶酸(维生素b9)和氰钴胺(维生素b12)。在某些实施方案中，分批补料缺少核黄素(维生素b2)、吡哆醇(维生素b6)、吡哆醛(维生素b6)、叶酸(维生素b9)和氰钴胺(维生素b120)。在某些实施方案中，分批补料缺少铁(fe，如fe(ii)和/或fe(iii)和以下一种或多种：核黄素(维生素b2)、吡哆醇(维生素b6)、吡哆醛(维生素b6)、叶酸(维生素b9)和氰钴胺(维生素b12)。在某些实施方案中，分批补料缺少铁(fe，如fe(ii)和/或fe(iii)核黄素(维生素b2)、吡哆醇(维生素b6)、吡哆醛(维生素b6)、叶酸(维生素b9)和氰钴胺(维生素b12)。在某些实施方案中，分批补料培养基缺少胱氨酸。在某些实施方案中，分批补料培养基缺少半胱氨酸。在某些实施方案中，分批补料培养基缺少甲硫氨酸。在某些实施方案中，分批补料培养基缺少半胱氨酸和甲硫氨酸。在某些实施方案中，分批补料培养基缺少半胱氨酸、胱氨酸和甲硫氨酸。
[0163]
在某些实施方案中，该方法还包括向所述宿主细胞的培养物或细胞培养液、所述宿主细胞的收获前细胞培养液(phccf)或所述宿主细胞的已收获细胞培养液(hccf)补充络合剂和还原剂。
[0164]
在某些实施方案中，本文提供的是一种用于降低宿主细胞产生的多肽中三硫键水平的方法，所述方法包括向所述宿主细胞的培养物或细胞培养液、所述宿主细胞的收获前细胞培养液(phccf)或所述宿主细胞的已收获细胞培养液(hccf)补充络合剂和还原剂，因而降低多肽中的三硫键水平。
[0165]
在某些实施方案中，将络合剂和还原剂在收获之前的以下任一时间添加至培养物：约4.5小时、4.0小时、3.5小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时或0.5小时，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，将络合剂和还原剂在收获时添加至培养物。
[0166]
在某些实施方案中，将络合剂在还原剂之前添加至所述宿主细胞的培养物、细胞培养液、phccf或hccf。在某些实施方案中，将络合剂在添加络合剂之前的以下任一时间之间添加至所述宿主细胞的培养物、细胞培养液、phccf或hccf：约60分钟、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、或30分钟，包括其之间的任何值。
[0167]
在某些实施方案中，将还原剂在络合剂之前添加至所述宿主细胞的培养物、细胞培养液、phccf或hccf。
[0168]
在某些实施方案中，将络合剂和还原剂同时添加至所述宿主细胞的培养物、细胞培养液、phccf或hccf。
[0169]
在某些实施方案中，将络合剂和还原剂添加至培养物、细胞培养液、phccf或hccf，并将培养物、细胞培养液、phccf或hccf在以下任一个温度维持：约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、2 5℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，将络合剂和还原剂添加至培养物、细胞培养液、phccf或hccf，并将培养物、细胞培养液、phccf或hccf在以下任一个ph维持：约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，将络合剂和还原剂添加至培养物、细胞培养液、phccf或hccf，并将培养物、细胞培养液、phccf或hccf在以下任一个％do(溶解氧)维持：约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、26％、27％、28％、29％或30％，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，将hccf在以下％do(溶解氧)维持：超过约30％，包括约31％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％中任一项，包括其之间的任何值。在某些实施方案中，将络合剂和还原剂添加至培养物、细胞培养液或phccf，并将培养物、细胞培养液或phccf在约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、2 5℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃中任一个温度(包括其之间的任何值)、在约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5中任一个ph(包括其之间的任何值)和在约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、26％、27％、28％、29％或30％中任一个％do(溶解氧)(包括其之间的任何值)维持。在某些实施方案中，将络合剂和还原剂添加至hccf，并将hccf在约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、2 5℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃中任一个温度(包括其之间的任何值)、在约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5中任一个ph(包括其之间的任何值)和在约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、和100％中任一个％do(溶解氧)(包括其之间的任何值)维持。
[0170]
在某些实施方案中，络合剂是以下任一项或其组合：乙二胺四乙酸(edta)、氨三乙酸(nta)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、亚乙基-双(氧乙烯次氮基)四乙酸(egta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、5-磺基水杨酸、n,n-二甲基十二烷基胺n-氧化物、二硫代草酰胺、乙二胺、水杨醛肟、n-(2
’‑
羟乙基)亚胺基二乙酸(himda)、8-羟基喹啉喹啉醇和sulphoxine。在某些实施方案中，络合剂选自：乙二胺四乙酸(edta)、氨三乙酸(nta)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)和柠檬酸盐。在某些实施方案中，将乙二胺四乙酸(edta)、氨三乙酸(nta)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)或柠檬酸盐添加至所述宿主细胞的培养物、细胞培养液、phccf或hccf以实现终浓度20mm。
[0171]
在某些实施方案中，还原剂是以下任一项或其组合：谷胱甘肽(gsh)、l-谷胱甘肽(l-gsh)、半胱氨酸、l-半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)、2,3-叔丁基-4-羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、3-氨基丙-1-磺酸、腺苷酰同型半胱氨酸、鹅肌肽、b-丙氨酸、b-胡萝卜素、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯、肌肽、卡维地洛、姜黄素、半胱胺、盐酸半胱胺、地塞米松、二烯丙基二硫化物、dl-羊毛硫氨酸、dl-thiorphan、乙氧喹、没食子酸、龙胆酸钠盐水合物、谷胱甘肽二硫化物、还原型谷胱甘肽乙基酯、甘氨酸、氢化可的松、亚牛磺
酸、羟乙基磺酸铵盐、l-半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、l-半胱氨酸亚磺酸一水合物、硫辛酸、还原型硫辛酸、巯丙酰甘氨酸、甲硫氨酸、亚甲基双(3-硫代丙酸)、草酸、栎素水合物、白藜芦醇、视黄酸、s-羧甲基-l-半胱氨酸、硒、硒代甲硫氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸银、牛磺酸、硫代乳酸、tricine、维生素c、维生素e、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b4、维生素b5、维生素b6和维生素b11。在某些实施方案中，还原剂选自：半胱氨酸和l-半胱氨酸。在某些实施方案中，将半胱氨酸或l-半胱氨酸添加至所述宿主细胞的培养物、细胞培养液、phccf或hccf以实现以下任一个终浓度：约3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、5.5mm或6mm，包括其之间的任何值。
[0172]
适于所需细胞类型和/或多肽产物的本领域已知的任何细胞培养基可以用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，细胞培养基是化学成分确定的培养基。在其他实施方案中，细胞培养基是化学成分不确定的培养基。
[0173]
可以使用市售培养基，如包括但不限于ham's f10(sigma)、极限基本培养基([mem],sigma)、rpmi-1640(sigma)、dulbecco改良eagle培养基([dmem],sigma)，并且任何这些培养基可以如本文所述那样调整。此外，可以如本文详述那样调整wallace,meth.enz.,58:44(1979)；barnes和sato,anal.biochem.,102:255(1980)；vijayasankaran等人,biomacromolecules.,6:605:611(2005)；patkar等人,j biotechnology,93:217-229(2002)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；wo 90/03430；wo 87/00195；美国专利re号30,985或美国专利号5,122,469中描述的任何培养基，所述文献的公开内容均通过引用的方式完整并入本文。
[0174]
本文提供的任何培养基也可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如hepes)、核苷(如腺苷和胸苷)和葡萄糖或同等能量来源。在某些实施方案中，在本文提供的方法中使用的细胞培养基是化学成分确定的细胞培养基。在某些实施方案中，在本文提供的方法中使用的细胞培养基是化学成分不确定的细胞培养基。在某些实施方案中，在本文提供的方法中使用的细胞培养基含有衍生自植物或动物的蛋白质。在某些实施方案中，在本文提供的方法中使用的细胞培养基不含衍生自植物或动物的蛋白质。也可以按本领域技术人员已知的适宜浓度包括任何其他的必需补充物。
[0175]
本领域已知的任何细胞培养物技术可以配合如本文所述的方法使用。细胞培养物技术的例子包括但不限于单个细胞培养传代、细胞培养传代延长、种子或接种物培养、浓缩的补料补充、生成细胞库、灌流培养和补料分批培养。
[0176]
在某些实施方案中，多肽分泌入细胞培养基。在某些实施方案中，本文提供的方法还包括从细胞培养基回收多肽的步骤。
[0177]
在某些实施方案中，本文提供的方法还包括测量多肽中的三硫键水平。可以使用众多方法的任一者检测三硫键的存在，所述方法包括实施例中描述的方法和本领域普通技术人员已知的方法。例如，可以使用肽图检测三硫键并且可以基于完整蛋白质的质量因一个额外硫原子(32da)而增加，检测之。在某些实施方案中，可以使用质谱或通过高压液相色谱和质谱法(利用lc-ms系统的肽图)检测三硫键。在某些实施方案中，可以借助肽图检测三硫键，其中通过lc-ms分析衍生自完整分子(包括含有硫键的那些)的选定肽。在某些实施方案中，也可以间接地检测三硫键，例如通过评估分子折叠或热稳定性检测。在某些实施方案
中，抗体中的三硫键的存在可以因热处理敏感性增加而检测到或鉴定，例如，如因用于非还原性电泳的样品制备后片段化水平增加而证实(参见，例如，us 2012/0264916)。在某些实施方案中，可以根据zhang等人,(2010)journal of chromatography a.1217,5776-5784中描述的方法，借助疏水相互作用液相色谱联合带电荷气溶胶检测(hilic-cad)，检测三硫键。在某些实施方案中，根据本文提供的任意方法或其组合产生的多肽中的平均三硫键水平小于约以下任一个百分数：20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％(mol三硫键/mol多肽)。
[0178]
在一个相关方面，提供根据本文方法产生的多肽。下文进一步详细描述这类多肽。
[0179]
产生和纯化多肽的方法
[0180]
本文提供可以用来在任何类型动物细胞(如重组动物细胞)中产生多肽(例如包括抗体和双特异性抗体)的方法。术语“动物细胞”涵盖无脊椎动物、非哺乳脊椎动物(例如，鸟类、爬行类和两栖类)和哺乳动物细胞。无脊椎动物细胞的例子包括以下昆虫细胞：草地贪夜蛾(spodopter frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(aedes albopictus)(蚊)、黑腹果蝇(drosophilmelanogaster)(果蝇)和家蚕(bombyx mori)(参见，例如，luckow等人,bio/technology,6:47-55(1988)；miller等人,引自genetic engineering,setlow,j.k.等人编著,第8卷(plenum publishing,1986),第277-279页；和maeda等人,nature,315:592-594(1985))。
[0181]
在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。作为表达用宿主可获得的哺乳动物细胞系是本领域熟知的并且包括但不限于从美国典型培养物保藏中心(atcc)可获得的永生化细胞系，并且在本领域已知的表达系统中使用的任何细胞系可以用来根据本文提供的方法产生多肽(如抗体或双特异性抗体)。哺乳动物细胞的例子包括人视网膜母细胞(per.c6(crucell,leiden,荷兰))；由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcc crl 1651(gluzm等人,1981,cell 23:175))；人胚肾系(293、293ebna、msr 293、或经亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，graham等人,j.gen virol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho，urlaub和chasin,proc.natl.acad.sci.usa,77:4216(1980))；小鼠支持细胞(tm4，mather,biol.reprod.,23:243-251(1980))小鼠l细胞；3t3细胞(atcc ccl 163)；猴肾细胞(cvi，atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc ccl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；布法罗大鼠肝细胞(brl 3a，atcc ccl 1442)；人肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳腺瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞(mather等人,annals n.y.acad.sci.,383:44-68(1982))；mrc 5细胞；fs4细胞；人肝瘤系(hep g2)；人表皮a431细胞、人colo205细胞、其他转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、从原代组织的体外培养衍生的细胞株、原代外植体、hl-60、u937、hak或jurkat细胞。任选地，当想要在各种信号转导分析或报道分子分析中使用该多肽时，哺乳动物细胞系如hepg2/3b、kb、nih 3t3或s49，例如，可以用于表达该多肽。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是cho细胞或其衍生物，如在无血清培养基中生长的veggie cho和相关细胞系(rasmussen等人,1998,cytotechnology 28:31)。
[0182]
本发明还适用于杂交瘤细胞。术语“杂交瘤”指通过免疫来源的永生细胞系与抗体产生细胞融合而产生的杂合细胞系。该术语包括异种杂交骨髓瘤融合物的子代，所述子代是人细胞和鼠骨髓瘤细胞系融合，随后与浆细胞融合的结果，常称作三体瘤细胞系。另外，
该术语意图包括产生抗体的任何永生化杂合细胞系，例如，四体瘤(quadroma)(参见，例如，milstein等人,nature,537:3053(1983))。杂交细胞系可以是任何物种，包括人和小鼠。
[0183]
在某些实施方案中，哺乳动物细胞是非杂交瘤哺乳动物细胞，所述细胞已经用编码目的多肽的分离的外源核酸(包括在特别优选的实施方案中编码抗体(如双特异性抗体)、抗体片段(如配体结合片段)和嵌合抗体的核酸)转化。“外源核酸”或“异源核酸”意指这样的核酸序列，所述核酸序列相对于该细胞为外来，或相对于该细胞为同源，但处于宿主细胞核酸内部中通常不存在该核酸的位置。
[0184]
分离的核酸是经鉴定并且与多肽核酸天然来源中通常与其结合的至少一种杂质性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子是与其在自然界中存在的形式或背景不同。分离的核酸优选地是非染色体性核酸，即与其中它天然存在的染色体环境分离。分离的核酸分子因此与如其在天然细胞中存在的核酸分子区分。但是，分离的核酸分子包括在细胞内所含的核酸分子，所述细胞通常在该核酸分子例如处在与天然细胞不同的染色体位置情况下表达多肽。
[0185]
目的多肽优选地作为分泌型多肽从培养基回收，不过如果在无分泌信号的情况下直接表达，它也可以从宿主细胞裂解物回收。作为第一步骤，将培养基或裂解物离心以移除颗粒状细胞残片。此后将多肽从杂质性可溶蛋白和多肽中纯化，用作为合适纯化方法示例的以下方法纯化：在免疫亲和色谱柱或离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相hplc；在二氧化硅上或阳离子交换树脂如deae上色谱；聚焦色谱；sds-page；硫酸铵沉淀；使用例如sephadex g-75的凝胶过滤；移除杂质(如igg)的蛋白a琼脂糖凝胶柱。蛋白酶抑制剂如苯基甲基磺酰氟(pmsf)还可以用于抑制纯化期间的蛋白酶解性降解。本领域技术人员将理解，可能需要修改适于目的多肽的纯化方法，以考虑在重组细胞培养中表达时多肽特性的变化。示例性多肽
[0186]
可以根据本文提供的方法产生各种多肽。例子包括但不限于哺乳动物蛋白质，例如，生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素a-链；胰岛素b-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子viiic、因子ix、组织因子和von willebrands因子；抗凝血因子如c蛋白；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-pa)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；rantes(活化时受调节、正常时t-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒氏管抑制物质；松弛素a-链；松弛素b-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；dna酶；ige；细胞毒性t-淋巴细胞相关抗原(ctla)，如ctla-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；受体激素或生长因子；蛋白a或d；类风湿因子；神经营养因子如骨衍生神经营养因子(bdnf)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)或神经生长因子如ngf-～；血小板衍生生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子如afgf和bfgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i)、胰岛素样生长因子结合蛋白；cd蛋白如cd3、cd4、cd8、cd19、cd20、cd34和cd40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(csf)，例如，m-csf、gm-csf和g-csf；白介素(il)，例
如，il-1α至il-17；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒性抗原如，例如，aids包膜蛋白的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如cd11a、cd11b、cd11c、cd18、icam、vla-4和vcam；肿瘤相关抗原如her2、her3或hera受体；和前文所列任一种多肽的片段。
[0187]
抗体产生和纯化
[0188]
在一些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多肽是抗体或其片段。在一些实施方案中，借助本文所述方法产生的抗体是人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、文库衍生的抗体或多特异性抗体(如双特异性抗体)。在某些实施方案中，借助本文提供的方法产生的抗体片段是fab、fab’、f(ab’)2、scfv、(scfv)2、dab、互补决定区(cdr)片段、线性抗体、单链抗体分子、迷你抗体、双抗体(diabody)和从抗体片段形成的多特异性抗体。
[0189]
可以使用例如(使用哺乳动物细胞(例如，cho细胞)产生抗体的)重组方法，产生抗体。为了重组产生抗体，将编码抗体的核酸分离并插入复制型载体中用于进一步克隆(扩增dna)或用于表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离编码抗体的dna并将其测序。许多载体是可获得的。载体组件通常包括但不限于以下一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
[0190]
抗体可以不仅直接重组产生，还可以作为具有异源多肽的融合多肽重组产生，所述异源多肽优选地是在成熟蛋白或多肽的n末端具有特定切割位点的信号序列或其他多肽。选择的异源信号序列优选地是一个由宿主细胞识别并加工(例如，由信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达时，哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如，单纯疱疹gd信号，是可用的。
[0191]
抗体可以可以在胞内产生或直接分泌入培养基。如果胞内产生抗体，则作为第一步骤，移除颗粒状残片(宿主细胞或裂解的片段)，例如，通过离心或超滤移除。在抗体分泌入培养基的情况下，首先可以使用市售的蛋白质浓缩滤器，例如，amicon或millipore pellicon超滤装置，浓缩来自这类表达系统的上清液。可以在前述任意步骤中包含蛋白酶抑制剂如pmsf以抑制蛋白酶解，并且可以包含抗生素以防止外来杂质增长。
[0192]
本领域已知的标准蛋白质纯化方法可以用来获得基本上均匀的根据本文提供的方法产生的抗体的制备物。以下方法是示例性的合适纯化方法：在免疫亲和色谱柱或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相hplc、在硅胶或阳离子树脂(例如deae)上色谱、聚焦色谱、sds-page、硫酸铵沉淀和例如使用sephadex g-75的凝胶过滤。
[0193]
额外地或可选地，可以例如使用羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱纯化抗体，其中亲和色谱是其中通常优选的纯化步骤之一。在某些方面，将源自如上文所述的细胞培养基的制备物施加到蛋白a固定的固相上，以允许多特异性结合抗原的目的蛋白与蛋白a特异性结合。随后洗涤该固相以除去与固相非特异性结合的杂质。多特异性抗原结合蛋白(如双特异性抗体)可以通过向含有离液剂或温和洗涤剂的溶液洗脱，从固相回收。示例性离液剂和温和洗涤剂包括但不限于胍-hcl、脲、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、sds(十二烷基硫酸钠)、tween、triton和np-40，它们全部均是市售的。
[0194]
蛋白a作为亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白fc结构域的种类和同种型。蛋白a可以用来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(lindmark等人,
j.immunol.meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白g用于全部小鼠同种型和用于人γ3(guss等人,embo j.5:15671575(1986))。亲和力配体所连接的基质最经常是琼脂糖，但是其他基质是可用的。力学稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允许比可以用琼脂糖所实现的更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含ch3结构域的情况下，bakerbond abx
tm
树脂(j.t.baker,phillipsburg,n.j.)可用于纯化。取决于回收待的抗体，也可用其他纯化蛋白的技术，如离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相hplc、二氧化硅上色谱、肝素sepharose
tm
上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上色谱、聚焦色谱、sds-page和硫酸铵沉淀。
[0195]
在任何初步纯化步骤后，包含抗体(如根据本文提供的方法产生的抗体)和杂质的混合物可以经历低ph疏水相互作用色谱，所述低ph疏水相互作用色谱使用ph在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选地以低盐浓度(例如，从约0-0.25m盐起)进行。抗体的产生可以备选地或额外地(相对于前述任一者特定方法)包括透析包含多肽混合物的溶液。
[0196]
在一些实施方案中，本文所述的抗体是其抗原结合片段。抗原结合片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段因在重链ch1结构域的羧基端处附加额外几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与fab片段不同。fab'-sh在本文是fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离巯基。f(ab')2抗体片段最初作为成对的fab’片段产生，所述成对的fab’片段在它们之间具有铰合半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。“fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。“单链fv”或“scfv”抗体片段包括抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，scfv多肽还包含在vh结构域和vl结构域之间的多肽接头，所述多肽接头能够使scfv形成用于抗原结合的所需结构。关于scfv的综述，参见pluckth
ü
n,引自pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编著,(springer-verlag,new york,1994),第269-315页。可以适当地修改上文描述的许多纯化抗体的方法以纯化结合抗原的抗体片段。
[0197]
在某些实施方案中，在本公开的细胞培养基中培养的细胞用来产生双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种非对称结构促进所需的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分离，因为免疫球蛋白轻链在所述双特异性分子的仅一半中的存在提供了便利的分离方式(参见wo 94/04690)。关于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如suresh等人,methods in enzymology,121:210(1986)。根据另一个方案，可以将一对抗体分子之间的界面工程化以最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分数(参见w096/27011)。优选的界面包含抗体恒定结构域的ch3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链由较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链替换为较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链具有相同或相似尺寸的补偿“空穴”。这提供了相对于其他不想要的产物(如同型二聚体)而言增加异二聚体产率的机制。双特异性抗体包括交联抗体或“异质缀合”抗体。例如，异质缀合下的抗体之一可以偶联于抗生物素蛋白，另一种抗体偶联于生物素。已经例如提出这类抗体将免疫系
统细胞导引至不想要的细胞(参见us 4,676,980)并用于治疗hiv感染(参见wo91/00360、wo 92/200373和ep 03089)。可以使用任何便利的交联方法产生异质缀合抗体。合适的交联剂是本领域熟知的并且连同许多交联技术一起在u.s.4,676,980中公开。构思了大于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(参见tutt等人,j.immunol.147:60(1991))。靶分子
[0198]
可以由根据本文提供的方法产生的抗体(或多特异性抗体，如双特异性抗体)靶向的分子的例子包括，但不限于可溶性血清蛋白和它们的受体及其他的膜结合蛋白(例如，黏附素)。在另一个实施方案中，本文提供的多特异性结合抗原的蛋白能够结合一种、两种或更多种选自以下的细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：8mpi、8mp2、8mp38(gdfio)、8mp4、8mp6、8mp8、csfi(m-csf)、csf2(gm-csf)、csf3(g-csf)、epo、fgf1(αfgf)、fgf2(βfgf)、fgf3(int-2)、fgf4(hst)、fgf5、fgf6(hst-2)、fgf7(kgf)、fgf9、fgf1 0、fgf11、fgf12、fgf12b、fgf14、fgf16、fgf17、fgf19、fgf20、fgf21、fgf23、igf1、igf2、ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifn81、ifng、ifnwi、fel1、fel1(epselon)、fel1(zeta)、il 1a、il 1b、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8、il9、il1 0、il 11、il 12a、il 12b、il 13、il 14、il 15、il 16、il 17、il 17b、il 18、il 19、il20、il22、il23、il24、il25、il26、il27、il28a、il28b、il29、il30、pdgfa、pdgfb、tgfa、tgfb1、tgfb2、tgfbb3、lta(tnf-β)、ltb、tnf(tnf-α)、tnfsf4(ox40配体)、tnfsf5(cd40配体)、tnfsf6(fasl)、tnfsf7(cd27配体)、tnfsf8(cd30配体)、tnfsf9(4-1bb配体)、tnfsf10(trail)、tnfsf11(trance)、tnfsf12(apo3l)、tnfsf13(april)、tnfsf13b、tnfsf14(hvem-l)、tnfsf15(vegi)、tnfsf18、hgf(vegfd)、vegf、vegfb、vegfc、il1r1、il1r2、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il7r、il8ra、il8rb、il9r、il10ra、il10rb、il 11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17r、il18r1、il20ra、il21r、il22r、il1hy1、il1rap、il1rapl1、il1rapl2、il1rn、il6st、il18bp、il18rap、il22ra2、aif1、hgf、lep(瘦蛋白)、ptn和thpo。
[0199]
在某些实施方案中，本文提供的方法可以用来产生针对选自以下的趋化因子、趋化因子受体和趋化因子相关蛋白的抗体(或多特异性抗体，如双特异性抗体)：ccli(1-309)、ccl2(mcp-1/mcaf)、ccl3(mip-iα)、ccl4(mip-iβ)、ccl5(rantes)、ccl7(mcp-3)、ccl8(mcp-2)、ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、ccl 13(mcp-4)、ccl 15(mip-iδ)、ccl 16(hcc-4)、ccl 17(tarc)、ccl 18(parc)、ccl 19(mdp-3b)、ccl20(mip-3α)、ccl21(slc/exodus-2)、ccl22(mdc/stc-1)、ccl23(mpif-1)、ccl24(mpif-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、ccl25(teck)、ccl26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、ccl27(ctack/ilc)、ccl28、cxcli(groi)、cxcl2(gr02)、cxcl3(gr03)、cxcl5(ena-78)、cxcl6(gcp-2)、cxcl9(mig)、cxcl 10(ip 10)、cxcl 11(1-tac)、cxcl 12(sdfi)、cxcl 13、cxcl 14、cxcl 16、pf4(cxcl4)、ppbp(cxcl7)、cx3cl 1(scydi)、scyei、xcli(淋巴细胞趋化因子)、xcl2(scm-iβ)、blri(mdr15)、ccbp2(d6/jab61)、ccri(ckri/hm145)、ccr2(mcp-irb ira)、ccr3(ckr3/cmkbr3)、ccr4、ccr5(cmkbr5/chemr13)、ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)、ccr7(ckr7/ebii)、ccr8(cmkbr8/ter1/ckr-l1)、ccr9(gpr-9-6)、ccrl1(vshk1)、ccrl2(l-ccr)、xcr1(gpr5/ccxcr1)、cmklr1、cmkor1(rdc1)、cx3cr1(v28)、cxcr4、gpr2(ccr10)、gpr31、gpr81(fksg80)、cxcr3(gpr9/ckr-l2)、cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)、hm74、il8ra(il8rα)、il8rb(il8rβ)、ltb4r(gpr16)、tcp10、cklfsf2、cklfsf3、cklfsf4、cklfsf5、cklfsf6、cklfsf7、cklfsf8、bdnf、
c5、c5r1、csf3、grcc10(c10)、epo、fy(darc)、gdf5、hdf1、hdf1α、dl8、prl、rgs3、rgs13、sdf2、slit2、tlr2、tlr4、trem1、trem2和vhl。
[0200]
在另一个实施方案中，根据本文提供的方法产生的抗体或双特异性抗体能够结合选自以下的一种或多种靶：0772p(ca125、muc16)(即，卵巢癌抗原)、abcf1；acvr1；acvr1b；acvr2；acvr2b；acvrl1；adora2a；聚集蛋白聚糖；agr2；aicda；aif1；aig1；akap1；akap2；amh；amhr2；淀粉样蛋白β；angptl；angpt2；angptl3；angptl4；anpep；apc；apoc1；ar；aslg659；asphd1(含天冬氨酸β-羟化酶结构域1；loc253982)；azgp1(锌-a-糖蛋白)；b7.1；b7.2；bad；baff-r(b细胞活化因子受体、blys受体3、br3；bag1；bai1；bcl2；bcl6；bdnf；blnk；blri(mdr15)；bmp1；bmp2；bmp3b(gdf10)；bmp4；bmp6；bmp8；bmpr1a；bmpr1b(骨形态发生蛋白受体类型ib)；bmpr2；bpag1(网蛋白)；brca1；brevican；c19orf10(il27w)；c3；c4a；c5；c5r1；cant1；casp1；casp4；cav1；ccbp2(d6/jab61)；ccl1(1-309)；ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子)；ccl13(mcp-4)；ccl15(mip1δ)；ccl16(hcc-4)；ccl17(tarc)；ccl18(parc)；ccl19(mip-3β)；ccl2(mcp-1)；mcaf；ccl20(mip-3α)；ccl21(mtp-2)；slc；exodus-2；ccl22(mdc/stc-1)；ccl23(mpif-1)；ccl24(mpif-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；ccl25(teck)；ccl26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)；ccl27(ctack/ilc)；ccl28；ccl3(mtp-iα)；ccl4(mdp-iβ)；ccl5(rantes)；ccl7(mcp-3)；ccl8(mcp-2)；ccna1；ccna2；ccnd1；ccne1；ccne2；ccr1(ckri/hm145)；ccr2(mcp-irβ/ra)；ccr3(ckr/cmkbr3)；ccr4；ccr5(cmkbr5/chemr13)；ccr6(cmkbr6/ckr-l3/strl22/dry6)；ccr7(ckbr7/ebi1)；ccr8(cmkbr8/ter1/ckr-l1)；ccr9(gpr-9-6)；ccrl1(vshk1)；ccrl2(l-ccr)；cd164；cd19；cd1c；cd20；cd200；cd22(b细胞受体cd22-b同工型)；cd24；cd28；cd3；cd37；cd38；cd3e；cd3g；cd3z；cd4；cd40；cd40l；cd44；cd45rb；cd52；cd69；cd72；cd74；cd79a(cd79α、免疫球蛋白相关的b细胞特异性蛋白)；cd79b；cds；cd80；cd81；cd83；cd86；cdh1(e-钙黏着蛋白)；cdh10；cdh12；cdh13；cdh18；cdh19；cdh20；cdh5；cdh7；cdh8；cdh9；cdk2；cdk3；cdk4；cdk5；cdk6；cdk7；cdk9；cdkn1a(p21/waf1/cip1)；cdkn1b(p27/kip1)；cdkn1c；cdkn2a(p16ink4a)；cdkn2b；cdkn2c；cdkn3；cebpb；cer1；chga；chgb；几丁质酶；chst10；cklfsf2；cklfsf3；cklfsf4；cklfsf5；cklfsf6；cklfsf7；cklfsf8；cldn3；cldn7(claudin-7)；cll-1(clec12a、micl和dcal2)；cln3；clu(簇集蛋白)；cmklr1；cmkor1(rdc1)；cnr1；col 18a1；col1a1；col4a3；col6a1；补体因子d；cr2；crp；cripto(cr、cr1、crgf、cripto、tdgf1、畸胎癌衍生生长因子)；csfi(m-csf)；csf2(gm-csf)；csf3(gcsf)；ctla4；ctnnb1(b-连环蛋白)；ctsb(组织蛋白酶b)；cx3cl1(scydi)；cx3cr1(v28)；cxcl1(gro1)；cxcl10(ip-10)；cxcl11(i-tac/ip-9)；cxcl12(sdf1)；cxcl13；cxcl14；cxcl16；cxcl2(gro2)；cxcl3(gro3)；cxcl5(ena-78/lix)；cxcl6(gcp-2)；cxcl9(mig)；cxcr3(gpr9/ckr-l2)；cxcr4；cxcr5(burkitt淋巴瘤受体1、一种g蛋白偶联受体)；cxcr6(tymstr/strl33/bonzo)；cyb5；cyc1；cysltr1；dab2ip；des；dkfzp451j0118；dncli；dpp4；e16(lat1、slc7a5)；e2f1；ecgf1；edg1；efna1；efna3；efnb2；egf；egfr；elac2；eng；eno1；eno2；eno3；ephb4；ephb2r；epo；erbb2(her-2)；ereg；erk8；esr1；esr2；etbr(b型内皮素受体)；f3(tf)；fadd；fasl；fasn；fcer1a；fcer2；fcgr3a；fcrh1(fc受体样蛋白1)；fcrh2(ifgp4、irta4、spap1a(含有sh2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、spap1b、spap1c)；fgf；fgf1(αfgf)；fgf10；fgf11；fgf12；fgf12b；fgf13；fgf14；fgf16；fgf17；fgf18；fgf19；fgf2(bfgf)；fgf20；fgf21；fgf22；fgf23；fgf3(int-2)；fgf4(hst)；fgf5；fgf6(hst-2)；fgf7
cdna 2700050c12、riken cdna 2700050c12基因)；ptafr；pten；ptgs2(cox-2)；ptn；rac2(p21 rac2)；rarb；ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；rgsi；rgs13；rgs3；rnf110(znf144)；robo2；s100a2；scgb1d2(亲脂素b)；scgb2a1(mammaglobin 2)；scgb2a2(mammaglobin 1)；scyei(内皮单核细胞活化细胞因子)；sdf2；sema 5b(flj10372、kiaa1445、mm.42015、sema5b、semag、semaphorin 5b hlog、sema结构域、七次凝血酶敏感蛋白重复序列(类型1和类型1样)、跨膜结构域(tm)和短胞质结构域(semaphorin 5b)；serpina1；serpina3；serp1nb5(maspin)；serpine1(pai-1)；serpdmf1；shbg；sla2；slc2a2；slc33a1；slc43a1；slit2；sppi；sprr1b(sprl)；st6gal1；stabi；stat6；steap(前列腺六次跨膜上皮抗原)；steap2(hgnc_8639、ipca-1、pcanap1、stamp1、steap2、stmp、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺六次跨膜上皮抗原2、前列腺六次跨膜蛋白)；tb4r2；tbx21；tcpio；togfi；tek；tenb2(推定性跨膜蛋白聚糖)；tgfa；tgfbi；tgfb1ii；tgfb2；tgfb3；tgfbi；tgfbri；tgfbr2；tgfbr3；thil；thbsi(凝血酶敏感蛋白-1)；thbs2；thbs4；thpo；tie(tie-1)；tmp3；组织因子；tlr1；tlr2；tlr3；tlr4；tlr5；tlr6；tlr7；tlr8；tlr9；tlr10；tmeff1(具有egf样结构域和二个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1)；tmem46(shisa同源物2)；tnf；tnf-a；tnfaep2(b94)；tnfaip3；tnfrsfiia；tnfrsf1a；tnfrsf1b；tnfrsf21；tnfrsf5；tnfrsf6(fas)；tnfrsf7；tnfrsf8；tnfrsf9；tnfsf10(trail)；tnfsf11(trance)；tnfsf12(ap03l)；tnfsf13(april)；tnfsf13b；tnfsf14(hvem-l)；tnfsf15(vegi)；tnfsf18；tnfsf4(ox40配体)；tnfsf5(cd40配体)；tnfsf6(fasl)；tnfsf7(cd27配体)；tnfsfs(cd30配体)；tnfsf9(4-1bb配体)；tollip；toll样受体；top2a(拓扑异构酶ea)；tp53；tpm1；tpm2；tradd；tmem118(跨膜环指蛋白2；rnft2；flj14627)；traf1；traf2；traf3；traf4；traf5；traf6；trem1；trem2；trpm4(br22450、flj20041、trpm4、trpm4b、瞬时受体电位阳离子通道亚家族m成员4)；trpc6；tslp；tweak；酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；vegf；vegfb；vegfc；多功能蛋白聚糖；vhl c5；vla-4；xcl1(淋巴细胞趋化因子)；xcl2(scm-1b)；xcri(gpr5/ccxcri)；yy1和zfpm2。
[0201]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的靶分子抗体(或双特异性抗体)包括cd蛋白如cd3、cd4、cds、cd16、cd19、cd20、cd21(cr2(补体受体2)或c3dr(c3d/epstein barr病毒受体)或hs.73792)；cd33；cd34；cd64；cd72(b细胞分化抗原cd72、lyb-2)；cd79b(cd79b、cd79β、igb(免疫球蛋白相关β)、b29)；erbb受体家族的cd200成员如egf受体、her2、her3或her4受体；细胞黏附分子如lfa-1、mac1、p150.95、vla-4、icam-1、vcam、α4/β7整联蛋白、和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗cd11a、抗cd18、或抗cd11b抗体)；生长因子如vegf-a、vegf-c；组织因子(tf)；α干扰素(αifn)；tnfα、白介素，如il-1αβ、il-3、il-4、il-5、il-6、il-8、il-9、il-13、il 17af、il-1s、il-13rα1、il13rα2、il-4r、il-5r、il-9r、ige；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(ob)受体；mpl受体；ctla-4；rankl、rank、rsv f蛋白、c蛋白等。
[0202]
在某些实施方案中，本文提供的方法可以用来产生与补体蛋白c5特异性结合的抗体(或多特异性抗体，如双特异性抗体)(例如，与人c5特异性结合的抗c5激动剂抗体)。在一些实施方案中，抗c5抗体包含1、2、3、4、5或6个hvr，所述hvr选自(a)包含ssyyma(seq id no:1)的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含aiftgsgaeykaewakg(seq id no:26)的氨基酸序列
的hvr-h2；(c)包含dagydypthamhy(seq id no:27)的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含rasqgisssla(seq id no:28)的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含gasetes(seq id no:29)的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含qntkvgssygnt(seq id no:30)的氨基酸序列的hvr-l3。例如，在一些实施方案中，抗c5抗体包含重链可变结构域(vh)序列，所述重链可变结构域序列包含一个、二或三个选自以下的hvr：(a)包含ssyyma(seq id no:1)的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含aiftgsgaeykaewakg(seq id no:26)的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含dagydypthamhy(seq id no:27)的氨基酸序列的hvr-h3；和/或轻链可变结构域(vl)序列，所述轻链可变结构域序列包含一个、二或三个选自以下的hvr：(d)包含rasqgisssla(seq id no:28)的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含gasetes(seq id no:29)的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含qntkvgssygnt(seq id no:30)的氨基酸序列的hvr-l3。上述的hvr-h1、hvr-h2、hvr-h3、hvr-l1、hvr-l2和hvr-l3序列在us 2016/0176954中分别作为seq id no:117、seq id no:118、seq id no:121、seq id no:122、seq id no:123和seq id no:125公开(us 2016/0176954中参见表7和表8)。
[0203]
在某些实施方案中，抗c5抗体分别包含以下中的vh序列和vl序列
[0204][0205]
和
[0206][0207]
包括那些序列的翻译后修饰。上述的vh序列和vl序列在us 2016/0176954中分别作为seq id no:106和seq id no:111公开。(us 2016/0176954中参见表7和表8)在一些实施方案中，抗c5抗体是305l015(参见us 2016/0176954)。
[0208]
在某些实施方案中，本文提供的方法可以用来产生与ox40特异性结合的抗体(或多特异性抗体，如双特异性抗体)(例如，与人ox40特异性结合的抗ox40激动剂抗体)。在一些实施方案中，抗ox40抗体包含1、2、3、4、5或6个hvr，所述hvr选自(a)包含dsyms(seq id no:2)的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含dmypdngdssynqkfre(seq id no:3)的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含aprwyfsv(seq id no:4)的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含rasqdisnyln(seq id no:5)的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含ytsrlrs(seq id no:6)的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含qqghtlppt(seq id no:7)的氨基酸序列的hvr-l3。例如，在一些实施方案中，抗ox40抗体包含重链可变结构域(vh)序列，所述重链可变结构域序列包含一个、二或三个选自以下的hvr：(a)包含dsyms(seq id no:2)的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含dmypdngdssynqkfre(seq id no:3)的氨基酸序列的hvr-h2；和(c)包含aprwyfsv(seq id no:4)的氨基酸序列的hvr-h3；和/或轻链可变结构域(vl)序列，所述轻链可变结构域序列包含一个、二或三个选自以下的hvr：(a)包含rasqdisnyln(seq id no:5)的氨基酸序列的hvr-l1；(b)包含ytsrlrs(seq id no:6)的氨基酸序列的hvr-l2；和(c)包含qqghtlppt(seq id no:7)的氨基酸序列的hvr-l3。在某些实施方案中，抗ox40抗体分别包含在以下中的vh序列和vl序列
[0209][0210]
包括那些序列的翻译后修饰。
[0211]
在一些实施方案中，抗ox40抗体包含1、2、3、4、5或6个hvr，所述hvr选自(a)包含nylie(seq id no:10)的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含vinpgsgdtyysekfkg(seq id no:11)的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含drldy(seq id no:12)的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含hasqdissyiv(seq id no:13)的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含hgtnled(seq id no:14)的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含vhyaqfpyt(seq id no:15)的氨基酸序列的hvr-l3。例如，在一些实施方案中，抗ox40抗体包含重链可变结构域(vh)序列，所述重链可变结构域序列包含一个、二或三个选自以下的hvr：(a)包含nylie(seq id no:10)的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含vinpgsgdtyysekfkg(seq id no:11)的氨基酸序列的hvr-h2；和(c)包含drldy(seq id no:12)的氨基酸序列的hvr-h3；和/或轻链可变结构域(vl)序列，所述轻链可变结构域序列包含一个、二或三个选自以下的hvr：(a)包含hasqdissyiv(seq id no:13)的氨基酸序列的hvr-l1；(b)包含hgtnled(seq id no:14)的氨基酸序列的hvr-l2；和(c)包含vhyaqfpyt(seq id no:15)的氨基酸序列的hvr-l3。在某些实施方案中，抗ox40抗体分别包含在以下中的vh序列和vl序列
[0212][0213]
和
[0214][0215]
包括那些序列的翻译后修饰。
[0216]
wo 2015/153513中提供关于抗ox40抗体的更多细节，所述文献通过引用方式完整并入本文。
[0217]
在某些实施方案中，本文提供的方法可以用来产生与流感病毒b血凝素(即，“flub”)特异性结合的抗体(或多特异性抗体，如双特异性抗体)(例如，在体外和/或体内结合来自乙型流感病毒yamagata世系的血凝素、结合来自乙型流感病毒victoria世系的血凝素、结合来自乙型流感病毒祖先世系的血凝素或结合来自乙型流感病毒yamagata世系、victoria世系和祖先世系的血凝素)。wo 2015/148806中描述关于抗flub抗体的更多细节，所述文献通过引用方式完整并入本文。
[0218]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的抗体(或双特异性抗体)结合低密度脂蛋白受体相关蛋白(lrp)-1或lrp-8或转铁蛋白受体以及至少一种选自β-分泌酶(bace1或bace2)、α-分泌酶、γ-分泌酶、τ-分泌酶、淀粉样蛋白前体蛋白(app)、死亡受体6(dr6)、淀粉样蛋白β肽、α-突触核蛋白、parkin、亨廷顿蛋白、p75 ntr、cd40和胱天蛋白酶-6的靶。
[0219]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的抗体是针对cd40的人igg2抗体。在某些实施方案中，抗cd40抗体是rg7876。
[0220]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多肽是靶向的免疫细胞因子。在某些实施方案中，靶向的免疫细胞因子是cea-il2v免疫细胞因子。在某些实施方案中，cea-il2v免疫细胞因子是rg7813。在某些实施方案中，靶向的免疫细胞因子是fap-il2v免疫细胞因子。在某些实施方案中，fap-il2v免疫细胞因子是rg7461。
[0221]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)结合cea和至少一种额外的靶分子。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)结合靶向肿瘤的细胞因子和至少一种额外的靶分子。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)与il2v(即，白介素2变体)融合并且结合基于il1的免疫细胞因子和至少一种额外的靶分子。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)是t细胞双特异性抗体(即，双特异性t细胞衔接体或bite)。
[0222]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)与至少两种选自以下的靶分子结合：il-1α和il-1β、il-12和il-1s；il-13和il-9；il-13和il-4；il-13和il-5；il-5和il-4；il-13和il-1β；il-13和il-25；il-13和tarc；il-13和mdc；il-13和mef；il-13和tgf-～；il-13和lhr激动剂；il-12和tweak、il-13和cl25；il-13和sprr2a；il-13和sprr2b；il-13和adams、il-13和ped2、il17a和il17f、cea和cd3、cd3和cd19、cd138和cd20；cd138和cd40；cd19和cd20；cd20和cd3；cd3s和cd13s；cd3s和cd20；cd3s和cd40；cd40和cd20；cd-s和il-6；cd20和br3、tnfα和tgf-β、tnfα和il-1β；tnfα和il-2、tnfα和il-3、tnfα和il-4、tnfα和il-5、tnfα和il6、tnfα和il8、tnfα和il-9、tnfα和il-10、tnfα和il-11、tnfα和il-12、tnfα和il-13、tnfα和il-14、tnfα和il-15、tnfα和il-16、tnfα和il-17、tnfα和il-18、tnfα和il-19、tnfα和il-20、tnfα和il-23、tnfα和ifnα、tnfα和cd4、tnfα和vegf、tnfα和mif、tnfα和icam-1、tnfα和pge4、tnfα和peg2、tnfα和rank配体、tnfα和te38、tnfα和baff,tnfα和cd22、tnfα和ctla-4、tnfα和gp130、tnf a和il-12p40、vegf和血管生成素、vegf和her2、vegf-a和her2、vegf-a和pdgf、her1和her2、vegfa和ang2、vegf-a和vegf-c、vegf-c和vegf-d、her2和dr5,vegf和il-8、vegf和met、vegfr和met受体、egfr和met、vegfr和egfr、her2和cd64、her2和cd3、her2和cd16、her2和her3；egfr(her1)和her2、egfr和her3、egfr和her4、il-14和il-13、il-13和cd40l、il4和cd40l、tnfr1和il-1r、tnfr1和il-6r和tnfr1和il-18r、epcam和cd3、mapg和cd28、egfr和cd64、cspgs和rgm a；ctla-4和btn02；igf1和igf2；igf1/2和erb2b；mag和rgm a；ngr和rgm a；nogoa和rgm a；omgp和rgm a；pol-l和ctla-4；以及rgm a和rgm b。
[0223]
在某些实施方案中，多特异性抗体(如双特异性抗体)是抗cea/抗cd3双特异性抗体。在某些实施方案中，抗cea/抗cd3双特异性抗体是rg7802。在某些实施方案中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含在下文提供的seq id no:18-21中所述的氨基酸序列：
[0224][0225][0226]
wo 2014/121712中提供关于抗cea/抗cd3双特异性抗体的更多细节，所述文献通过引用方式完整并入本文。
[0227]
在某些实施方案中，多特异性抗体(如双特异性抗体)是抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体。在某些实施方案中，抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体是crossmab。在某些实施方案中，抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体是rg7716。在某些实施方案中，抗cea/抗cd3双特异性抗体包含在下文提供的seq id no:22-25中所述的氨基酸序列：
[0228][0229][0230]
在某些实施方案中，多特异性抗体(如双特异性抗体)是抗ang2/抗vegf双特异性抗体。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是rg7221。在某些实施方案中，抗ang2/抗vegf双特异性抗体是cas编号1448221-05-3。
[0231]
其可溶性抗原或片段，任选地与其他分子缀合，可以用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子如受体，这些分子的片段(例如受体的胞外结构域)可以用作免疫原。备选地，表达所述跨膜分子的细胞可以用作免疫原。此类细胞可以源自天然来源(例如癌细胞系)或可以是已经通过重组技术转化以表达所述跨膜分子的细胞。其他抗原及其用于制备抗体的形式对本领域技术人员是显而易见的。
[0232]
在某些实施方案中，本文中产生的多肽(例如，抗体)可以进一步缀合于化学分子如染料或细胞毒活性剂如化疗药、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射缀合物)。包含使用本文所述方法产生的抗体或双特异性抗体的免疫缀合物可以含有与仅一条重链或仅一条轻链的恒定区缀合的细胞毒活性剂。
[0233]
c.药物组合物和制剂
[0234]
根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)可以用合适的载体或赋形剂配制，从而它们适于施用。通过以下方式获得冻干制剂形式或水溶液剂形式的根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)的合适制剂：将具有所需纯度的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂(remington’s pharmaceutical sciences第16版,osol,a.编著(1980))混合。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸类如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；络合剂如edta；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)和/或非离子表面活性剂如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。例如，w098/56418中描述了示例性抗体制剂，所述文献通过引用方式明确并入本文。w097/04801中描述了适应于皮下施用的冻干制剂。这类冻干制剂可以用合适的稀释剂复溶至高蛋白质浓度并且复溶的制剂可以皮下施用至本文中待治疗的哺乳动物。
[0235]
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种活性化合物，优选地是具有并未不利相互影响的互补活性的那些活性化合物。例如，可能想要进一步提供抗肿瘤药、生长抑制剂、细胞毒活性剂或化疗药。此类分子适当地以有效用于预期目的的量存在。这类其他活性剂的有效量取决于该制剂中存在的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)的量、疾病或病症或治疗的类型和上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量并且以如本文中所述施用途径或以约1％至99％前述所用的剂量使用。活性成分也可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳状液中。此类技术在remington’s pharmaceutical sciences第16版,osol,a.编著(1980)中公开。可以制备持续释放制品。缓释制品的合适例子包括含有拮抗剂的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和l-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如lupron depot
tm
(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林乙酸酯组成的可注射微球体)和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。
[0236]
任选的，但是优选地，制剂含有可药用盐、优选地氯化钠，并且优选地以约生理学浓度含有。任选地，制剂可以含有可药用的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度是从0.1至2.0％，一般按v/v计。合适的防腐剂包括制药领域已知的那些。苄醇、苯酚、间甲酚、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯是优选的防腐剂。任选地，制剂可以按0.005％至0.02％的浓度包含可药用的表面活性剂。
[0237]
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处
于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和l-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如lupron depot
tm
(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林乙酸酯组成的可注射微球体)和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100日，但是某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间。当包囊化的根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)长时间留在体内时，它们可能因在37℃暴露于水分而变性或聚集，导致生物学活性丧失和免疫原性可能改变。可以根据所涉及的机制构思用于稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是因巯基-二硫键互换所致的分子间s-s键，可以通过修饰硫氢基残基、从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适宜的添加物和开发专特定聚合物基质组合物实现稳定作用。
[0238]
根据已知的方法，将根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)施用至人类受试者，如作为大丸剂的静脉内施用或通过在一段时间范围内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。如果广泛副作用或毒性与针对蛋白质识别的目标分子相关，则可能特别需要局部施用。离体策略也可以用于治疗性应用。离体策略包括用编码本文提供的蛋白质的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。随后将转染或转导的细胞返回这位受试者。细胞可以是广泛类型细胞的任一种，包括而不限于造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树枝状细胞、t细胞或b细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌肉细胞。
[0239]
在一些实施方案中，当病症或肿瘤位置允许时，局部(例如，通过直接注射)施用根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)，并且注射可以周期重复。在手术切除肿瘤后，也可以将多肽(例如，抗体或双特异性抗体)全身递送至受试者或直接递送至肿瘤细胞，例如，递送至肿瘤或肿瘤床，旨在防止或减少局部复发或转移。
[0240]
d.制造品和试剂盒
[0241]
还提供制造品，其含有一种或多种根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)和可用于治疗或诊断病症(例如，自身免疫疾病或癌症)的材料。在某些实施方案中，该制造物包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装说明书。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了有效治疗所述病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小瓶)。组合物中至少一种活性物质是根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)。标签或包装说明书说明该组合物用于治疗特定的病状。标签或包装说明书将进一步包括向受试者施用组合物的说明，所述组合物包含根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)。还构思了包含本文所述的组合性治疗药的制造品和试剂盒。
[0242]“包装说明书”指治疗产品的商业包装中通常包含的说明书，所述说明书含有涉及此类治疗产品用途的关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。在某些实施方案中，包装说明书表示该组合物用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌。
[0243]
额外地，制造品还可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含可药用缓冲液，如抑
菌性注射用水(bwfi)、磷酸缓冲盐溶液、ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点考虑的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
[0244]
还提供可用于多种目的(例如，纯化或免疫沉淀来自细胞的两种或更多种靶抗原)的试剂盒。为了分离和纯化两种或更多种靶抗原，试剂盒可以含有与珠(例如，琼脂糖珠)偶联的根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)。可以提供用于体外(例如在elisa或蛋白质印迹法中)检测和定量抗原的试剂盒，所述试剂盒含有根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)。与制造品一样，该试剂盒包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装说明书。该容器容纳组合物，所述组合物包含至少一种根据本文提供的方法产生的多肽(例如，抗体或双特异性抗体)。可以包括含有例如稀释剂和缓冲液或对照抗体的额外容器。标签或包装说明书可以提供对组合物的描述以及预期体外或诊断用途的说明。
具体实施方案
[0245]
1.一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，包括：
[0246]
(a)使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：
[0247]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0248]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0249]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0250]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸(维生素b9)，
[0251]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0252]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0253]
vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；
[0254]
(b)培养宿主细胞以产生多肽；和
[0255]
(c)收获由宿主细胞产生的多肽。
[0256]
2.产生多肽的方法，包括：
[0257]
(a)使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：
[0258]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0259]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0260]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0261]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸(维生素b9)，
[0262]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0263]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0264]
vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；
[0265]
(b)培养宿主细胞以产生多肽；和
[0266]
(c)收获由宿主细胞产生的多肽。
[0267]
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中收获的多肽具有比相同条件下产生的多肽低的三硫键水平，例外在于一种或多种组分的浓度不同于(a)中所述的浓度。
[0268]
4.根据实施方案1-3所述的方法，其中基础培养基缺少胱氨酸。
[0269]
5.根据实施方案1-3所述的方法，其中基础培养基包含在约1.4mm至3mm之间的半胱氨酸或胱氨酸。
[0270]
6.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中基础培养基包含在约0mm至约1.58mm之间的甲硫氨酸和在约0mm至约3mm之间的半胱氨酸。
[0271]
7.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中基础培养基包含约6mm半胱氨酸。
[0272]
8.用于降低多肽中三硫键水平的方法，包括：
[0273]
(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：
[0274]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0275]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0276]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0277]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，
[0278]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0279]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0280]
vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；
[0281]
(b)产生多肽；
[0282]
(c)并收获由宿主细胞产生的多肽。
[0283]
9.根据实施方案8所述的方法，其中细胞培养基中一种或多种组分的浓度是接种后一次或多次添加的累积浓度。
[0284]
10.用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：
[0285]
(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：
[0286]
i)在约2μm至约35μm之间的铁，
[0287]
ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，
[0288]
iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，
[0289]
iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，
[0290]
v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，
[0291]
vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和
[0292]
vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；
[0293]
(b)产生多肽；
[0294]
(c)并收获由宿主细胞产生的多肽。
[0295]
11.用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：
[0296]
(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：
4-羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、3-氨基丙-1-磺酸、腺苷酰同型半胱氨酸、鹅肌肽、b-丙氨酸、b-胡萝卜素、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯、肌肽、卡维地洛、姜黄素、半胱胺、盐酸半胱胺、地塞米松、二烯丙基二硫化物、dl-羊毛硫氨酸、dl-thiorphan、乙氧喹、没食子酸、龙胆酸钠盐水合物、谷胱甘肽二硫化物、还原型谷胱甘肽乙基酯、甘氨酸、氢化可的松、亚牛磺酸、羟乙基磺酸铵盐、l-半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、l-半胱氨酸亚磺酸一水合物、硫辛酸、还原型硫辛酸、巯丙酰甘氨酸、甲硫氨酸、亚甲基双(3-硫代丙酸)、草酸、栎素水合物、白藜芦醇、视黄酸、s-羧甲基-l-半胱氨酸、硒、硒代甲硫氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸银、牛磺酸、硫代乳酸、tricine、维生素c、维生素e、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b4、维生素b5、维生素b6和维生素b11。
[0322]
28.根据实施方案27所述的方法，其中还原剂选自：半胱氨酸和l-半胱氨酸。
[0323]
29.根据实施方案28所述的方法，其中还原剂是l-半胱氨酸，并且其中将l-半胱氨酸添加至所述宿主细胞的培养物或hccf，以实现约3mm和约6mm之间的终浓度。
[0324]
30.根据实施方案18-29中任一项所述的方法，其中络合剂选自：乙二胺四乙酸(edta)、氨三乙酸(nta)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、亚乙基-双(氧乙烯次氮基)四乙酸(egta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、5-磺基水杨酸、n,n-二甲基十二烷基胺n-氧化物、二硫代草酰胺、乙二胺、水杨醛肟、n-(2
’‑
羟乙基)亚胺基二乙酸(himda)、8-羟基喹啉喹啉醇和sulphoxine。
[0325]
31.根据实施方案30所述的方法，其中络合剂选自：乙二胺四乙酸(edta)、氨三乙酸(nta)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)和柠檬酸盐。
[0326]
32.根据实施方案31所述的方法，其中将络合剂添加至所述宿主细胞的培养物或hccf，以实现20mm的终浓度。
[0327]
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中多肽分泌入细胞培养基。
[0328]
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，还包括纯化已收获多肽的步骤。
[0329]
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中宿主细胞是重组宿主细胞。
[0330]
36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0331]
37.根据实施方案36所述的方法，其中哺乳动物细胞是cho细胞。
[0332]
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中方法还包括测量多肽中的三硫键水平。
[0333]
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中多肽中的平均三硫键％小于约20％、小于约10％小于约5％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％。
[0334]
40.根据实施方案1-9和12-39中任一项所述的方法，其中多肽是抗体或其片段。
[0335]
41.根据实施方案40所述的方法，其中多肽是抗体片段，并且其中抗体片段选自：fab、fab’、f(ab’)2、scfv、(scfv)2、dab、互补决定区(cdr)片段、线性抗体、单链抗体分子、迷你抗体、双抗体和从抗体片段形成的多特异性抗体。
[0336]
42.根据实施方案40所述的方法、其中抗体或其片段与选自以下的抗原结合：bmpr1b、e16、steap1、0772p、mpf、napi3b、sema 5b、psca hlg、etbr、msg783、steap2、trpm4、cripto、cd21、cd79b、fcrh2、her2、nca、mdp、il20rα、brevican、ephb2r、aslg659、psca、geda、baff-r、cd22、cd79a、cxcr5、hla-dob、p2x5、cd72、ly64、fcrh1、irta2、tenb2、pmel17、tmeff1、gdnf-ra1、ly6e、tmem46、ly6g6d、lgr5、ret、ly6k、gpr19、gpr54、asphd1、酪氨酸酶、
tmem118、gpr172a、cd33、cll-1、c5、ox40、α4β7和αeβ7整联蛋白异二聚体、il-13、cd-20、fgfr、甲型流感、乙型流感、淀粉样蛋白β、her3、补体因子d、il-22c、pd-l1、pd-l2、pd-1、vegf、血管生成素2、cd3、fap、cea和il-6。
[0337]
43.根据实施方案40所述的方法，其中多肽是抗体，并且其中抗体是双特异性抗体。
[0338]
44.根据实施方案所述的方法43，其中双特异性抗体是抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗cea/抗cd3双特异性抗体或抗ang2/抗vegf双特异性抗体。
[0339]
45.根据实施方案1-9和12-39中任一项所述的方法，其中多肽是免疫细胞因子。
[0340]
46.根据实施方案45所述的方法，其中免疫细胞因子是cea-il2v或fap-il2v。
[0341]
47.细胞培养基中约0和约4.5μm之间的甲硫氨酸降低多肽中三硫键水平的用途，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体。
[0342]
48.根据前述实施方案中任一项产生的多肽。
[0343]
49.根据实施方案48所述的多肽，其中多肽中的平均三硫键％小于约20％、小于约10％小于约5％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％。
[0344]
实施例
[0345]
将通过参考以下实施例更充分理解本公开。然而，它们不应当解释为限制本公开的范围。可以理解本文所述的实施例和实施方案的目的仅在于说明，并且在其影响下的多种修改或改变将会启发本领域技术人员并且将纳入本技术的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。
[0346]
实施例1：无细胞系统中半胱氨酸、胱氨酸、铁(fe)、和b族维生素对重组多肽中三硫键形成的影响
[0347]
在无细胞系统中实施第一系列实验以确定细胞培养基中有助于胞外分泌的重组多肽中三硫键形成的组分。特别地，这些实验研究半胱氨酸、胱氨酸、微量元素(如铁)和b族维生素对这类多肽中三硫键水平的影响。a.半胱氨酸、胱氨酸和铁的非细胞影响
[0348]
简而言之，将抗flub(示例性多肽含有11％三硫键)在已经补充(a)6mm l-半胱氨酸(cys)、(b)3mm胱氨酸(cys-cys)、(c)6mm l-半胱氨酸(cys)和35μm fe(铁)或(d)3mm胱氨酸(cys-cys)和35μm fe(铁)的培养基1中温育。在培养基2(即，相比培养基1具有不同组成的培养基)中，重复如上文所述那样补充的温育过程。wo 2015/148806中描述关于抗flub的更多细节，所述文献通过引用方式完整并入本文。
[0349]
培养基1和培养基2差异在于它们含有的养分和组分的数目、类型和浓度。具体而言，培养基1中维生素b2和维生素b6的浓度不同于培养基2中维生素b2和维生素b6的浓度。
[0350]
培养基中抗flub的终浓度是1.5g/l。温育在温度设定点为37℃、co2设定点为5％的培养箱中进行。温育混合物保留在带盖的旋转管生物反应器中并且以225转/分钟振摇。一半重复样本保留在带有通气盖的旋转管中，并且一半重复样本保留在带有非通气盖的旋转管中。振摇的旋转管反应器温度、co2和搅拌处于对cho抗体生产培养物中抗体浓度和用于cho(或其他哺乳动物)细胞培养的温度相关的范围内部。
[0351]
在0小时、6小时、24小时、和72小时从八种温育各自取得样种，并且根据zhang等
人,(2010)journal of chromatography a.1217,5776-5784和cornell等人(发表)中描述的方法，借助借助疏水相互作用液相色谱联合带电荷气溶胶检测(hilic-cad)，在每个时间点测定抗flub中的三硫键％。
[0352]
如图中1所示，抗flub在培养基1+cys或培养基2+cys中温育令三硫键水平从11％快速降低至近乎0％，并且这种影响持续72小时。在培养基1+cys-cys或培养基2+cys-cys中72小时温育期间，抗flub中的三硫键水平不受显著影响。在培养基1+cys+fe或培养基2+cys+fe中温育抗flub时，三硫键水平快速地降低，并且这种影响持续约6小时。然而，在6小时后，抗flub中的三硫键水平增加至约15％，即，略高于初始三硫键水平。这个观察结果与存在fe的无细胞系统中cys转化成cys-cys所需要的时间量一致，此时该组合物充当含有cys-cys和fe的一种组合物(参见下文)。在培养基1+cys-cys+fe或培养基2+cys-cys+fe温育抗flub在72小时温育期间显著地增加三硫键水平至约40％。用含有45％三硫键的抗flub观察到相似结果(数据未显示)。气体交换不影响三硫键形成(数据未显示)。
[0353]
总体上，图1中的结果显示：1)当cys存在时，三硫键水平降低，但是如果允许cys转化成cys-cys，则三硫键水平可以增加；2)胞外抗体汇集物中的三硫键形成需要fe，并且在fe和胱氨酸(cys-cys)二者存在下，三硫键形成显著地增加；并且3)鉴于培养基1和培养基2中观察到的结果相似，fe和胱氨酸(cys-cys)对三硫键形成的影响似乎不依赖于细胞培养基。
[0354]
图1中所示的结果还显示，多硫化物如胱氨酸(cys-cys)可以充当在抗体中产生三硫键的硫转移的硫池。在无fe的培养基1+cys中或培养基1+cys+fe中温育抗flub时，顶空中可检出h2s(数据未显示)。在培养基1+cys+fe中温育抗flub时，检测到较高水平的h2s(数据未显示)。在培养基1+cys-cys+fe或无fe的培养基1+cys-cys中温育抗flub时，顶空中不可检出h2s(g)(数据未显示)。不意图受一项具体理论约束的情况下，这类结果表明，cys的存在或cys+fe的存在不导致h2s(g)形成并且因此有助于三硫键形成，甚至当顶空中h2s(g)水平不可检出时也是如此。b.铁和b族维生素的非细胞影响
[0355]
在又一组实验中，将抗flub在补充以下一种或多种组分的培养基1中温育72小时：(a)3mm胱氨酸(cys-cys)、(b)35μm fe和(c)b族维生素(1.84μm核黄素(维生素b2)、24.9μm吡多醇(维生素b6)、22.5μm叶酸(维生素b9)和2.25μm氰钴胺(维生素b12))。如图2a中所示，在补充cys-cys或补充cys-cys+b族维生素的培养基1中温育抗flub时，三硫键水平不受显著影响。在补充fe+cys-cys或补充fe+cys-cys+b族维生的培养基1中温育抗flub时，三硫键水平显著地增加，即，从11％增加至约40％，不过在无细胞系统中存在或不存在时b族维生素的情况下，三硫键水平大致相同。
[0356]
使用抗ox40抗体(即，含有1％三硫键的示例性多肽)重复上文描述的实验。本实施例中使用的抗ox40抗体包含seq id no:8中所述的重链可变结构域和seq id no:9中所述的轻链可变结构域。下文提供seq id no:8和9。wo 2015/153513中提供关于抗ox40抗体的更多细节，所述文献通过引用方式完整并入本文。
[0357][0358]
在缺少cys-cys，fe、和b族维生素的培养基1中温育抗ox40 ab不影响三硫键水平。参见图2b。在含有fe+b族维生素的培养基1中温育抗ox40 ab时，三硫键水平也保持不变。在补充cys-cys或补充cys-cys和b族维生素二者的培养基1中温育抗ox40 ab时，三硫键水平从1％增加至约10-15％。在补充fe+cys-cys或补充fe+cys-cys+b族维生素的培养基1中温育抗ox40 ab时，三硫键水平显著增加，即从1％增加至约75％。再次，b族维生素的存在并不显著地影响三硫键水平。
[0359]
综上，图1和图2a和图2b的结果显示：1)培养基中fe和胱氨酸(cys-cys)的存在有助于无细胞系统中多肽的三硫键形成，以及2)在无细胞系统中温育抗体时，b族维生素(b2、b6、b9和b12)不显著影响三硫键水平(与如下指出的细胞培养系统中观察到影响相反)。
[0360]
实施例2：影响哺乳动物细胞产生的多肽中三硫键形成的细胞培养基组分
[0361]
实施另一个系列实验以评估半胱氨酸(cys)、胱氨酸(cys-cys)、铁和b族维生素对三硫键水平的影响，但是这次是在细胞培养物过程中而非在无细胞过程中实施，以阐明这些化合物在细胞培养环境下具有什么影响。a.细胞培养中半胱氨酸和胱氨酸的影响
[0362]
进行一组细胞培养实验以评估添加的半胱氨酸(cys)或添加的胱氨酸(cys-cys)对培养期间三硫键形成的影响。简而言之，在2升生物反应器中，根据下表1中所示的四个方案之一，经过14天试验，培养产生抗ox40 ab的cho细胞：
[0363]
表1
[0364][0365]
在生产培养开始时
[0366]
*计算期间不考虑细胞消耗和生成。
[0367]
为了启动生产细胞培养物的生长期，在含有1l基础培养基的2l搅拌式生物反应器(applikon,foster city,ca)中按大约1.0x106个细胞/ml接种cho细胞。细胞按补料分批模式培养，第3天、第6天和第9天添加分批补料培养基100ml/升细胞培养液(即，方案3和4)；或在第3天添加200ml/升细胞培养液(即，方案1和2)。分批补料培养基不含有cys或cys-cys。如表1中所示，在基础培养中和通过与供应分批补料培养基的同一天从母液(即，10ml 450mm cys或10ml 225mm cys-cys)补充，向生产培养物供应cys或cys-cys。以这样的量供应半胱氨酸或胱氨酸，从而对全部生产试验可能的总半胱氨酸单体保持相等(即对于1x 20％分批补料策略或3x 10％分批补料策略，2x半胱氨酸(cys)浓度与1x胱氨酸(cys-cys))。
[0368]
每天分析葡萄糖浓度，并且如果葡萄糖浓度下降低于3g/l，则从500g/l葡萄糖母液补充它以防止葡萄糖耗尽。反应器配备校验过的溶解氧探测器、ph探测器和温度探测器。通过喷射空气和/或氧在线控制溶解氧。通过添加co2或na2co3控制ph并且根据需要，向培养物添加消泡剂。从第0天至第3天，将细胞培养物维持在ph 7.0和37℃温度，并且第3天后，随后在33℃维持。将细胞培养物按275转/分钟搅拌并且溶解氧水平为30％空气饱和度。每天取得样品用于离线测量。使用bioprofile flex analyzer(nova biomedical,waltham,ma)每日测量离线重量摩尔渗透压浓度、ph和代谢物、活细胞密度(vcc)、细胞活力，细胞悬液按大约700x g离心10分钟后，还测量细胞压积(pcv)。此外，从第6天至第14天取得上清液样品以使用基于蛋白a的hplc方法测定产物浓度。在第0、第3、第4、第6、第8、第10、第12和第14天取得上清液样品，以使用氨基酸衍生法随后rp-hplc法测定胞外氨基酸浓度。
[0369]
在第7、第10和第14天从每份培养物取得样品，并且如上文所述，借助hilic-cad测定在每个时间点时抗ox40 ab中的三硫键％。如图3中所示，在根据方案2和4培养的细胞产生的抗ox40 ab中三硫键％最高。在根据方案1培养的细胞产生的抗ox40 ab中三硫键％在第7天
–
第10天之间稳定增加并且随后在第14天收获时降低至约15％。在根据方案3培养的细胞产生的抗ox40 ab中三硫键％从第7天至第10天保持低并且在第14天收获时增加至约17.5％。不意图受某项具体理论约束的情况下，图3中所示的结果表明，添加cys时，在细胞培养生产过程中使用cys形式导致三硫键水平较低(非细胞机制)。培养结束时三硫键水平升高多半归因于还原三硫键的还原形式的半胱氨酸未留下，结果就是在补料cys后，非细胞机制在试验中后期将该过程向三硫键形成驱动。因而，结果提示，细胞培养试验中早期提供半胱氨酸可以导致收获的多肽中三硫键水平较低。
[0370]
b.优化半胱氨酸/胱氨酸供应以控制三硫键
[0371]
进行额外的实验，以评估仅在生产细胞培养试验的基础培养基中供应时半胱氨酸浓度对三硫键形成的影响。在一个14天生产细胞培养试验中，在2升生物反应器中培养产生抗ox40 ab的cho细胞。向基础培养基补充(a)6mm半胱氨酸、(b)4.5mm半胱氨酸或(c)3mm半胱氨酸。在这些实验中，向细胞培养物供应缺少半胱氨酸的分批补料培养基。在第7、第10、第12和第14天从每份培养物取得样品，并且如上文所述，借助hilic-cad测定在每个时间点时抗ox40 ab中的三硫键％。图4a表明，抗ox40 ab中的三硫键水平与生产培养开始时的初始半胱氨酸浓度相关。在含有3mm半胱氨酸的基础培养基中培养的细胞产生的抗ox40 ab中，三硫键％从第7天至第14天稳定下降，在第14天收获时三硫键％为0。参见图4a。来自每次培养的抗ox40 ab产率是可比的。参见图4b。综上，图4a和图4b中的结果显示，可以优化基础培养基中的半胱氨酸浓度以实现收获时多肽中三硫键％显著降低(或甚至消除)，同时不影响多肽产率的条件。不意图受某项具体理论约束的情况下，这类结果表明，在细胞培养试验中早期按较低浓度提供时，半胱氨酸被细胞消耗，因此防止导致分泌型多肽中三硫键形成的胞外胱氨酸形成。
[0372]
c.铁和b族维生素水平影响三硫键水平
[0373]
实施另外的实验以评估培养期间fe浓度和/或b族维生素(例如，核黄素、吡哆醇、叶酸和氰钴胺)浓度对多肽中三硫键形成的影响。在2升生物反应器中，根据下表2中所示四个方案之一，经过14天生产细胞培养试验，培养产生抗ox40 ab的cho细胞：
[0374]
表2
[0375]
[0376][0377]
在生产培养开始时
[0378]
*
基础培养基中的b族维生素＝1.84μm维生素b2、24.9μm维生素b6、22.5μm维生素b9和2.25μm维生素b12
[0379]
**
分批补料培养基中的b族维生素＝12.5μm维生素b2、250μm维生素b6、150μm维生素b9和10μm维生素b12
[0380]
为了启动生产细胞培养物的生长期，在含有1l基础培养基的2l搅拌式生物反应器(applikon,foster city,ca)中按大约1.0x 106个细胞/ml接种cho细胞。溶解氧条件、ph条件、温度条件、搅拌条件与上文描述相同。后续如上文所述测量葡萄糖浓度、重量摩尔渗透压浓度、ph、代谢物浓度、活细胞密度(vcc)、细胞活力和细胞压积。此外，从第6天至第14天取得上清液样品以使用基于蛋白a的hplc方法测定产物浓度。在第0、第3、第4、第6、第8、第10、第12和第14天取得上清液样品，以使用氨基酸衍生法随后rp-hplc法测定胞外氨基酸浓度。
[0381]
在第7、第10、第12和第14天从每份培养物取得样品，并且如上文所述，借助hilic-cad测定在每个时间点时抗ox40 ab中的三硫键％。如图5a中所示，在根据方案a培养的细胞产生的抗ox40 ab中三硫键％最高。在根据方案c培养的细胞产生的抗ox40 ab中，三硫键％从第7天至第14天稳定下降，在第14天收获时三硫键％为0。值得注意地，在根据方案b培养的细胞产生的抗ox40 ab中三硫键水平从第7天时约10％降低至第14天时约5％。来自每次培养的抗ox40 ab产率是可比的。参见图5b。
[0382]
图5c显示在每次细胞培养结束时，培养基中胱氨酸(cys-cys)的残余浓度。在第14天，在方案a和方案b的培养基中测量到高水平的cys-cys，而在方案c的培养基中未检测到cys-cys。这些结果与以下事实一致：方案c中所用的基础培养基中的低浓度cys在培养期间由细胞完全消耗，并且方案a和方案b中的基础培养基中提供的高浓度cys在培养期间并未由细胞完全消耗，因此导致剩余的cys氧化成cys-cys。值得注意地，方案b中第14天时高度残余的cys-cys并未导致抗ox40 ab中三硫键形成的增加。总体上，这些结果显示，通过控制b族维生素浓度和fe浓度，可以降低三硫键水平，甚至在高水平cys存在(随时间推移可能因cys转化成cys-cys而产生高三硫键水平的条件)下也是如此。通过控制b族维生素和fe浓度，可以将三硫键水平降低到水平类似于通过以下方式所获得的那些水平：优化基础培养基中cys浓度，从而待转化成cys-cys的残余cys最少。d.细胞培养中b族维生素和铁的相对影响
[0383]
为了确定b族维生素和fe对三硫键形成的相对贡献，在含有1升基础培养基的2升生物反应器中在上述条件以及根据下表3中所示的四个方案之一的试验下，培养产生抗ox40 ab的cho细胞，进行14天生产细胞培养：
[0384]
表3
[0385][0386]
在生产培养开始时
[0387]
*
基础培养基中的b族维生素＝1.84μm维生素b2、24.9μm维生素b6、22.5μm维生素b9和2.25μm维生素b12
[0388]
**
分批补料培养基中的b族维生素＝12.5μm维生素b2、250μm维生素b6、150μm维生素b9和10μm维生素b12
[0389]
***
在基础培养基中或分批补料期间不提供胱氨酸(cys-cys)。
[0390]
在第10天和第12天和在第14天收获时取得抗ox40 ab的样品，并且如上文所述，借助hilic-cad对每份样品测定抗ox40 ab中的三硫键％。如图6中所示，在根据方案d(即，低fe，低b族维生素)和方案f(即，高fe和低b族维生素)培养的细胞产生的已收获抗ox40 ab中三硫键％最低。根据方案d产生的抗ox40 ab具有约17-20三硫键％，并且根据方案f产生的抗ox40 ab具有约17-25三硫键％。在根据方案g(即，高fe，高b族维生素)培养的细胞产生的抗ox40 ab中三硫键％是约45％-55％。与图2a和图2b中展示的结果相比，根据方案e(即，低fe，高b族维生素)培养的细胞产生的抗ox40 ab中三硫键％是约35％-50％。在第10天和第12天取得的样品中见到相似结果(数据未显示)。综合图2a和2b中所示的显示b族维生素并不具备非细胞影响的结果，图6中所示的结果显示，b族维生素对三硫键形成作出显著贡献并且通过细胞相关机制如此做到。
[0391]
实施例3：重组表达的多肽的收获前和收获后细胞培养液与还原剂和络合剂温育对多肽中三硫键形成的影响
[0392]
进行另外的实验以鉴定减轻收获的多肽中三硫键形成的策略。在下表4中概述的条件之一下温育抗ox40 ab的已收获细胞培养液(hccf)。控制每种条件的温度、ph和溶解氧(do)。在条件2和条件3下，将hccf与edta(即，示例性金属络合剂)温育30分钟，之后添加半胱氨酸(即，示例性还原剂)。将混合物各自保持4.5小时以模拟常见细胞培养物收获的持续时间。将样品转移至15℃水浴槽并保持长达4天(96小时)以模拟下游纯化之前的冷藏保持时间。
[0393]
表4
[0394][0395]
do＝溶解氧；控制器起到维持do水平于或高于指示设定点的作用。
[0396]
如图7a中所示，在温育前30分钟内，在条件1下添加半胱氨酸(cys)至hccf将抗ox40 ab中的三硫键％从24％降低至2％，相对于添加cys的时间测量。在33℃持续4.5小时后，三硫键水平随后升至约11％，并且在15℃保持4天后，稳定增加至约21％。在条件2下，在33℃温育前30分钟内，添加cys至已经与edta温育的hccf将抗ox40 ab中的三硫键％从24％降低至《1％。在4天保持结束时，三硫键水平升至约5％。在条件3下，在20℃温育前30分钟内，添加cys至已经与edta温育的hccf还将抗ox40 ab中的三硫键％从24％降低至《1％。在20℃持续4.5小时后，三硫键水平升至约2％，并且在15℃保持4天后，进一步升至约4％。向hccf添加cys和edta导致依据ce-sds的主峰轻微下降，可能提示伴随添加还原剂，蛋白质少量减少。参见图7b。
[0397]
还用收获之前的细胞培养液(ccf)进行了相似研究。将ccf与或不与络合剂温育约45分钟，随后在如表5中所概述的温度、ph和溶解氧(do)受控的条件下补充或不补充还原剂。将这种混合物保持4.5小时，随后离心并过滤以移除细胞。在移除细胞后，将样品保持在15℃长达4天(96小时)。
[0398]
表5
[0399][0400][0401]
do＝溶解氧；控制器起到维持do水平于或高于指示设定点的作用。
[0402]
如图8a和图8b中所示，不补充还原剂或络合剂(即，条件a)的ccf中的三硫键水平仍高(约35％)。在温育前30分钟内，单独添加cys至ccf(即，条件b)将抗ox40 ab中的三硫键％从37％降低至6％。在33℃持续4.5小时后，三硫键水平随后升至约4％，并且在收获后在15℃保持4天结束时，稳定增加至约13％。在温育前30分钟内，向ccf添加cys和edta、nts、edds或柠檬酸盐中任一者(即，条件c、d、e和f)也将抗ox40 ab中的三硫键％从30-40％降低至3％或更低。三硫键水平随后保持低，即，在5％或以下，贯穿整个4.5小时33℃温育和在收
获后15℃保持4天之后。
[0403]
综上，图7和图8中所示的结果显示，添加还原剂降低hccf或ccf中多肽的三硫键％，并且需要添加络合剂以维持低三硫键水平。另外，三硫键水平降低并不伴随蛋白质明显减少。
[0404]
实施例4：亚牛磺酸对多肽产生期间三硫键形成的影响
[0405]
为了检查亚牛磺酸对生产期间重组多肽中三硫键形成的影响，产生抗体产物的cho细胞培养按照已知生成具有高三硫键水平(即，25％-45％三硫键)的多肽的工艺执行。细胞源自单一接种物培养并且用来接种四个重复的生产培养物。三种培养在无亚牛磺酸的对照条件下进行。剩余的培养在基础培养基中包含1g/l亚牛磺酸。全部四种培养的全部其他培养基/溶液添加和工艺参数相同。细胞生长似乎并非显著地受阻；然而，对于包含亚牛磺酸的条件，活力在培养结束时维持更好(数据未显示)。对于包含亚牛磺酸的培养，最终的收获产物中三硫键水平显著较低：2.2％相对于对照条件的39.9
±
2.7％。参见图9。
[0406]
实施例5：在硫代谢中发挥关键作用的氨基酸对多肽产生期间三硫键形成的影响
[0407]
为了评估甲硫氨酸和半胱氨酸对生产期间重组多肽中三硫键形成的影响，根据下表6中所示的方案之一，经过14天生产细胞培养试验(rte＝痕量元素溶液，首先为培养基的cys量并且其次补料的cys量)，通过自动化机器人细胞培养系统在振摇的24深孔板中，在37℃和7％co2(接种物＝6x 106个活细胞/ml)培养产生bsab1的cho细胞。在第3天、第6天和第9天按照10％的培养物体积，向培养物补料10mm甲硫氨酸。总计测试36种条件。
[0408]
表6*
[0409] 模式sermetcysrte1+
‑‑
+...1-1v1.0(3mm，15mm)1.22++
‑‑
...11v1.0(3mm，15mm)1.03+-++...1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.24
‑‑‑‑
+...-1-1v1.0(3mm，15mm)1.25
‑‑‑‑
...-1-1v1.0(3mm，15mm)1.06
‑‑
+-...-1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.07-++-...-11v1.3(7.5mm，0mm)1.08+
‑‑‑
...1-1v1.0(3mm，15mm)1.09++
‑‑
...11v1.0(3mm，15mm)1.010+-+-...1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.011-+-+...-11v1.0(3mm，15mm)1.212++++...11v1.3(7.5mm，0mm)1.213-+
‑‑
...-11v1.0(3mm，15mm)1.014
‑‑
+-...-1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.015-+++...-11v1.3(7.5mm，0mm)1.216-+
‑‑
...-11v1.0(3mm，15mm)1.017-+-+...-11v1.0(3mm，15mm)1.218++
‑‑
...11v1.0(3mm，15mm)1.019+++-...11v1.3(7.5mm，0mm)1.0
20++-+...11v1.0(3mm，15mm)1.221
‑‑‑
+...-1-1v1.0(3mm，15mm)1.222+++-...11v1.3(7.5mm，0mm)1.023+
‑‑
+...1-1v1.0(3mm，15mm)1.224
‑‑
++...-1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.225
‑‑
++...-1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.226-+++...-11v1.3(7.5mm，0mm)1.227+
‑‑‑
...1-1v1.0(3mm，15mm)1.028++
‑‑
...11v1.0(3mm，15mm)1.029++++...11v1.3(7.5mm，0mm)1.230
‑‑‑‑
...-1-1v1.0(3mm，15mm)1.031+-++...1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.232++
‑‑
...11v1.0(3mm，15mm)1.033++-+...11v1.0(3mm，15mm)1.234+-+-...1-1v1.3(7.5mm，0mm)1.035-++-...-11v1.3(7.5mm，0mm)1.036-+
‑‑
...11v1.0(3mm，15mm)1.0
[0410]
·
ser浓度如
“‑
1”给出＝1:7.64mm，并且ser浓度如“1”给出＝4.5mm；
[0411]
·
met浓度如
“‑
1”给出＝1.58mm，并且met浓度如“1”给出＝2.25mm；
[0412]
·
cys浓度如(培养基、补料)给出，其中培养基浓度是3mm或7.5mm，而补料浓度是15mm或0mm；
[0413]
·
rte＝痕量元素溶液
[0414]
基于机器人结果，用software jmp计算甲硫氨酸和丝氨酸影响三硫键水平降低的分选的参数评估量。图10提供显示降低甲硫氨酸浓度对三硫键减少的显著影响的预测剖析图。(基于机器人数据计算)。发现丝氨酸浓度不影响bsab1中的三硫键减少。
[0415]
接着，根据下文在下表7中所示的两个方案之一，在2升生物反应器中，在上述条件下培养产生bsab1的cho细胞：
[0416]
表7
[0417][0418]
为了控制ph，使用培养基内部的碳酸盐缓冲液系统、co2通气和1m nahco3溶液。使用三步骤通气速率、搅拌器速度和氧通气级联，控制po2。
[0419]
在方案i中，从基础培养基省略含硫氨基酸半胱氨酸和甲硫氨酸，从补料培养基省略半胱氨酸，并增加丝氨酸浓度以代偿半胱氨酸缺少。如图11中所示，省略硫含有氨基酸导致收获时bsab1的杵臼区域内三硫键水平下降96％(即，从12.5％降至0.5％)。这类结果与自动化细胞培养系统中观察到的那些一致。
[0420]
接着，根据下表8中提供的两个方案之一，如上述那样培养表达bsab1的cho细胞：
[0421]
表8*
[0422][0423]
*其中细胞按方案j和方案k培育的培养基与方案h和方案i中所用的培养基不同。
[0424]
如图10中所示，基础培养基中甲硫氨酸浓度降低导致收获时bsab1的杵臼区域内三硫键水平下降17.4％(即，从4.6％降至3.8％)。这类结果与自动化细胞培养系统中观察到的那些一致。
[0425]
实施例6：b族维生素水平对哺乳动物细胞产生的多肽中三硫键形成的相对影响
[0426]
为了评估b族维生素对第二哺乳动物细胞系产生的多肽中三硫键形成的相对贡献，在含有1.2升基础培养基的2升生物反应器中，经过14天生产细胞培养试验，根据下表9中所示的两个方案之一，培养产生抗体的cho细胞：
[0427]
表9
[0428][0429][0430]
基础培养基中的b族维生素＝1.84μm维生素b2、24.9μm维生素b6、22.5μm维生素b9和2.25μm维生素b12。基础培养基还含有6mm cys。
[0431]
为了启动生产细胞培养物的生长期，在含有1.2l基础培养基的2l搅拌式生物反应器(sartorius,goettingen,germany)中按大约1.0x 106个细胞/ml接种cho细胞。细胞按补料分批模式培养，第3天、第6天和第9天添加分批补料培养基100ml/升细胞培养液。分批补料培养基不含有cys或cys-cys。向基础培养基中的生产培养物供应6mm cys。
[0432]
每天分析葡萄糖浓度，并且如果葡萄糖浓度下降低于3g/l，则从500g/l葡萄糖母
液补充它以防止葡萄糖耗尽。反应器配备校验过的溶解氧探测器、ph探测器和温度探测器。通过喷射空气和/或氧在线控制溶解氧。通过添加co2或na2co3控制ph。将细胞培养物维持在ph 7.0和37℃温度。将细胞培养物按233转/分钟搅拌并且溶解氧水平为30％空气饱和度。从第14天取得样品并测定抗体中的三硫键％。
[0433]
如图12中所示，通过从分批补料培养基省略b族维生素降低培养物中的b族维生素浓度导致三硫键浓度明显降低达87.5％(即从26.79％降至3.34％)。对于采用各自设置的两个试验(生物学重复)，结果始终如一。
[0434]
前述实施例仅出于说明目的而提供并且不意在以任何方式限制本发明的范围。除了本文显示和描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前面的描述而对本领域技术人员是显而易见的并且落于所附权利要求书的范围内。
技术特征：1.一种用于降低多肽中三硫键水平的方法，包括：(a)使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁，ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸(维生素b9)，v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；(b)培养宿主细胞以产生多肽；和(c)收获由宿主细胞产生的多肽。2.产生多肽的方法，包括：(a)使宿主细胞与基础培养基接触，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中基础培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁，ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸(维生素b9)，v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约1.58mm之间的甲硫氨酸；(b)培养宿主细胞以产生多肽；和(c)收获由宿主细胞产生的多肽。3.用于降低多肽中三硫键水平的方法，包括：(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁，ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；(b)产生多肽；(c)并收获由宿主细胞产生的多肽。4.用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：
(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁，ii)在约0.11μm至约2μm之间的核黄素(维生素b2)，iii)在约4.5μm至约80μm之间的吡多醇或吡哆醛(维生素b6)，iv)在约3.4μm至约23μm之间的叶酸盐/叶酸(维生素b9)，v)在约0.2μm至约2.5μm之间的氰钴胺(维生素b12)，vi)在约9mm和约10mm之间的亚牛磺酸；和vii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；(b)产生多肽；(c)并收获由宿主细胞产生的多肽。5.用于降低多肽中三硫键水平的方法，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体，所述方法包括：(a)在细胞培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码多肽的核酸，其中细胞培养基包含以下一种或多种组分：i)在约2μm至约35μm之间的铁，和ii)在约0和约4.5mm之间的甲硫氨酸；(b)产生多肽；并且(c)收获由宿主细胞产生的多肽。6.用于降低由宿主细胞产生的多肽中三硫键水平的方法，包括：(i)在收获之前向所述宿主细胞的培养物补充还原剂和络合剂；(ii)向所述宿主细胞的收获前细胞培养液(phccf)补充络合剂和还原剂；或(iii)向所述宿主细胞的已收获细胞培养液(hccf)补充还原剂和络合剂。7.细胞培养基中约0和约4.5μm之间的甲硫氨酸降低多肽中三硫键水平的用途，所述多肽选自：cea-il2v免疫细胞因子、fap-il2v免疫细胞因子、抗cea/抗cd3双特异性抗体、抗vegf/抗血管生成素双特异性抗体、抗ang2/抗vegf双特异性抗体、抗c5抗体和抗cd40抗体。
技术总结本文中提供细胞培养基和方法，其培养表达多肽的宿主细胞以降低宿主细胞中产生的多肽中三硫键水平。中三硫键水平。中三硫键水平。
技术研发人员：M
受保护的技术使用者：豪夫迈
技术研发日：2017.05.09
技术公布日：2022/7/5
