一株兼性厌氧完全反硝化产气菌y23及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术和环境生物技术领域，涉及一株能够在较高氧浓度下进行完全反硝化脱氮的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23及其应用。
背景技术：2.硝酸盐还原菌是一类能够还原硝酸盐或亚硝酸盐产生n2o和n2的细菌的统称。硝酸盐还原菌多为厌氧菌，少部分为兼性厌氧菌。兼性厌氧硝酸盐还原菌在有氧环境下优先进行好氧呼吸快速长菌体，在缺氧条件下，硝酸盐还原菌以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体进行厌氧呼吸产生n2o和n2。目前，硝酸盐还原菌在污水脱氮处理和微生物采油领域均有广泛应用。
3.利用硝酸盐还原菌进行污水脱氮是目前污水脱氮处理的主要手段之一。微生物反硝化脱氮通常在缺氧条件下进行，氧气影响微生物反硝化脱氮效果。因此，能够在较高氧浓度下将no
3-n依次转化为no
2-、no、n2o和n2的完全反硝化微生物在强化污水脱氮处理方面具有更高的应用价值。此外，完全反硝化能力的硝酸盐还原菌还能够一定程度上降低温室气体n2o的排放。
4.在微生物采油过程中，常向油藏储层中注入碳水化合物和硝酸盐用以激活地下微生物实现微生物强化采油。另一方面，硝酸盐还原菌比硫酸盐还原菌更能优先获得电子供体（有机碳源），因此，硝酸盐还原菌还能通过生物竞争作用抑制硫酸盐还原菌的生长，从而解决硫酸盐还原菌代谢产生硫化氢引发的油藏酸化、管道腐蚀和人身安全等问题。反硝化菌产生的氧化亚氮（n2o）气体与co2具有相似的分子结构，且在非极性液体中的溶解度高于co2，可以起到类似co2驱油的作用（溶解在原油中使原油膨胀降低原油粘度）；反硝化菌产生的n2可以通过增加储层压力提高原油采收率。
5.本专利提供的完全反硝化菌分离自实施过微生物采油的油藏，该油藏曾长期向油藏储层注入硝酸盐溶液开展微生物采油，硝酸盐还原菌是这些油藏区块的优势微生物类群。该菌株能够在较高的氧浓度下实现完全反硝化脱氮，在强化污水脱氮处理和强化微生物采油领域具有较高的应用价值。
技术实现要素：6.本发明的一个目的是提供一株能够在较高氧浓度下进行完全反硝化脱氮的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23，在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.24240。
7.本发明的另一个目的是提供一种含有上述微生物菌株菌悬液、发酵液或含有其的菌剂及新用途。
8.本发明提供了上述完全反硝化产气施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23、其菌悬液、其培养液、其发酵产物、含有其的菌剂在微生物采油中的应用。
9.本发明还提供了上述完全反硝化产气施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23、
其菌悬液、其培养液、其发酵产物、含有其的菌剂在制备微生物采油的产品中的应用。
10.本发明提供了上述完全反硝化产气施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23、其菌悬液、其培养液、其发酵产物、含有其的菌剂在污水处理中的应用。
11.本发明还提供了上述完全反硝化产气施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23、其菌悬液、其培养液、其发酵产物、含有其的菌剂在制备污水处理的产品或设备中的应用。
12.本发明的再一个目的是提供一种产品，其活性成分为上述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23、或其菌悬液、或其培养液、或其发酵产物、或含有其的菌剂，所述产品具有微生物采油和污水处理中任意一种功能。
13.本发明还有一个目的是提供一种微生物采油的方法，包括如下方式：在采油的过程中，将上述施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23发酵液及营养剂从油井的油套环空注入地层，利用该菌厌氧代谢产气提高单井产量，同时防控硫酸盐还原菌导致的油藏酸化；将上述施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23发酵液及营养剂由注水井注入地下，利用该菌在地下代谢产气提高原油采收率，同时防控硫酸盐还原菌导致的油藏酸化。
14.本发明最后一个目的是提供一种污水处理方法，包括如下步骤：在污水处理的过程中，加入上述施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23菌悬液、菌剂或已挂膜于填料上的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23。
附图说明
15.图1为基于16s rrna基因及其同源序列构建的菌株y23系统发育树。
16.图2为菌株y23在序批式生物反应器中的反硝化脱氮效果。
17.图3为菌株y23在不同碳源下的产气量。
18.图4为菌株y23产生的气体组分及其相对含量。
具体实施方式
19.实施例1：菌株y23的分离与鉴定菌株y23分离自油田产出液。该油田曾长期向油藏储层注入硝酸盐溶液开展微生物采油，硝酸盐还原菌是该油藏的优势微生物类群之一。菌株分离的具体步骤如下：将10ml油田采出液接种到盛有200 ml无菌反硝化产气菌富集培养基的500ml无菌塑料瓶中，排除多余空气，拧紧瓶盖于恒温箱培养至有气体产生。反硝化产气菌富集培养基成分如下：磷酸氢二钠0-1 g、磷酸二氢钾0-1 g、硝酸钠0-10 g、硫酸亚铁0-1 g、六水合硫酸镁0-1 g、氯化钙0.01 g、酵母浸粉0.01 g，葡萄糖0-10 g、蒸馏水，调节ph为6-8，121℃高压蒸汽灭菌20min。取5ml富集培养液再次接种于上述反硝化产气菌富集培养体系，于恒温箱培养至不再有气体产生。采用稀释涂布的方法分离单菌。验证单菌株产气量，挑选气体产量最大的菌株，命名为y23。
20.利用基因组提取试剂盒提取菌株基因组，利用引物27f（5
´‑
aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3
´
）和1492r（5
´‑
ggt tac ctt gttacg act t-3
´
）通过pcr扩增获得菌株16s rrna基因，将得到的pcr产物进行测序获得16s rrna序列信息。将y23菌株16s rrna的核苷酸序列提交genbank，根据blast搜索和同源性分析比较的结果表明，y23菌株16s rdna序列与已知菌种pseudomonas stutzeri的相似性为99%，表明该菌是一株施氏假单胞菌，综合上述鉴
定结果，将菌株命名为施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23。基于y23菌株16s rrna的核苷酸序列，使用软件mega构建系统发育树如图1所示。
21.该菌株已于2022年1月5日日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmcc no.24240。
22.实施例2：菌株y23反硝化基因检测以菌株基因组为模板，使用学术论文上已公开反硝化基因特异引物和扩增条件pcr扩增获得菌株反硝化基因序列片段。所获的pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测无误后送交北京奥科鼎盛生物技术有限公司进行测序。将测序所得序列提交ncbi数据库进行blast分析，确定与其最相近的功能基因。
23.反硝化基因pcr扩增子测序分析表明，菌株y23拥有反硝化过程涉及的膜结合硝酸还原酶（membrane-bound nitrate reductase，nar）、周质硝酸盐还原酶（periplasmic-bound nitrate reductase，nap）、亚硝酸还原酶（nitrite reductase，nir）、一氧化氮还原酶（nitric oxide reductase，norb）和氧化亚氮还原酶（nitrous oxide reductase，nos）的编码基因，能够将no
3-n依次转化为no
2-、no、n2o和n2。因此，菌株y23是一株具有完全反硝化作用的反硝化菌。膜结合硝酸还原酶nar对氧分子敏感，在厌氧反硝化生物脱氮中发挥主要作用。周质硝酸盐还原酶nap位于细胞周质中，对氧分子不敏感。周质硝酸盐还原酶编码基因的存在意味着菌株y23能够在好氧条件下进行反硝化，即同时利用氧气和硝酸盐作为电子受体进行产能代谢。
24.实施例3：菌株y23在序批式生物反应器中的反硝化脱氮效果将y23菌株接种于50 ml lb液体培养基中过夜培养；将培养液以4000r/min离心5min，倒去上清液；用无菌反硝化培养基悬浮沉到离心管底部的菌体，4000r/min离心5min，倒去上清液，加入50 ml无菌反硝化培养基悬浮菌体；将菌株y23按照1%接种量接种于序批式生物反应器，反应器每12小时排一次处理后的废水，同时补充等量污水（水力停留时间12小时）。模拟废水含c4h4na2o4·
6h2o、nano3、kh2po4、mnso4·
7h2o和feso4·
7h2o。待反应器运行稳定，于第24天，每隔30分钟取样检测处理液中硝态氮和亚硝态氮含量，测定酸碱度ph的变化。
25.如图2所示，菌株y23在序批式生物反应器中具有良好的反硝化脱氮效果，菌株对硝态氮的降解主要集中在前4个小时，反硝化脱氮效率接近100%，在此过程中基本无亚硝酸盐积累，处理废水酸碱度呈现一定程度上升。
26.实施例4：菌株y23在不同碳源下的产气效果在碳源实验中，分别以工业上常用的碳源糖类（葡萄糖、蔗糖、糖蜜）、有机酸、小分子醇（甘油）和石油烃等为唯一碳源，探究y23菌株在不同碳源下的产气量。各类碳源用量为葡萄糖0-5 g/l、甘油0-5 g/l、丁二酸钠0-5 g/l、醋酸钠0-5 g/l、蔗糖0-5 g/l、甲苯0-5 ml/l。
27.如图3所示，菌株可以在葡萄糖、丁二酸钠、甘油、乙酸钠、糖蜜、蔗糖为唯一碳源的液体培养基中产气，但在不同碳源底物下，产气量有很大差距。以糖类（糖蜜、葡萄糖和蔗糖）为碳源的培养液中，菌株的产气量最高；在甘油、丁二酸钠、乙酸钠为碳源的培养液中，产气效果有所降低。因此，从应用的角度，糖蜜可作为菌株y23产气的最佳碳源。
28.实施例5：菌株y23菌株反硝化产生的气体组分分析将种子液按照2%接种量接种于盛有1l反硝化产气培养基的1l补料瓶中，拧紧瓶盖，瓶盖上留有两通接口，每个接口处连接集气袋（比克曼生物）。为了排除空气对菌株产生气体组分分析的影响，前期培养阶段，打开其中一个集气袋的进气阀，待气体收集量达到约200ml，关闭该集气袋进气阀，打开另一个集气袋的进气阀进行气体收集。气体分析采用agilent 7890a气相色谱仪，检测器为热导检测器（tcd）和氢火焰离子化检测器（fid），检出限1ppm。
29.如图4所示，反硝化产气菌y23产生的气体中主要包括氮气、一氧化二氮和二氧化碳。n2含量达到56%，产生的n2可以通过增加储层压力提高原油采收率。n2o含量达到32%，该气体与co2具有相似的分子结构，且在非极性液体中的溶解度高于co2，可以起到类似co2驱油的作用。co2含量达到9%，远远高于空气中二氧化碳的浓度（0.03%-0.04%），主要由微生物呼吸作用产生，溶解在原油中能够降低原油粘度，起到驱油的作用。
30.实施例6：菌株y23发酵液及菌悬液的制备发酵液制备方法一：将菌株y23接种于lb液体培养基中静置或于120转每分的摇床上震荡培养，培养条件16-45摄氏度，培养时间12-36h，培养结束后菌浓达到10
9-10
10
个/ml发酵液。
31.发酵液制备方法二：将菌株y23接种于lb液体培养基中于120转每分的摇床上震荡培养至对数生长期；按5%接种量转接于无菌发酵培养基（含磷酸氢二钠0-1 g、磷酸二氢钾0-1 g、硝酸钠0-10 g、硫酸亚铁0-1 g、六水合硫酸镁0-1 g、氯化钙0.01 g、酵母浸粉0.01 g，糖蜜0-10 g），培养条件16-45摄氏度，培养时间12-36h，溶氧量0-10mg/l；培养结束后菌浓达到109个/ml发酵液。
32.菌株y23菌悬液制备：将发酵液制备方法一和发酵液制备方法二制备的菌液按照一定的比例进行稀释获得相应浓度的菌悬液；或者将发酵液制备方法一和发酵液制备方法二制备的菌液通过过滤或者离心收集菌体，再将菌体按照一定比例加入到相应溶液中获得相应浓度的菌悬液。
技术特征：1.一株能够在较高氧浓度下进行完全反硝化脱氮的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23，其特征在于，其微生物保藏编号为cgmcc no.24240。2.权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23、其培养液、其菌悬液或其菌剂在微生物采油中或在制备微生物采油的产品中的应用。3.权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23、其培养液、其菌悬液或其菌剂在污水处理中或在制备污水处理的产品或设备中的应用。4.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23或其菌悬液，所述产品具有微生物采油和污水处理中任意一种功能。5.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23的培养液，所述产品具有微生物采油和污水处理中任意一种功能。6.一种产品，其活性成分为含有权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23的菌剂，所述产品具有微生物采油和污水处理中任意一种功能。7.一种微生物强化采油的方法，其特征在于，包括如下步骤：一种是，在采油的过程中，将权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23发酵液及营养剂从油井的油套环空注入地层，利用该菌厌氧代谢产气提高单井产量，同时防控硫酸盐还原菌导致的油藏酸化；另一种是，将权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23发酵液及营养剂由注水井注入地下，利用该菌在地下代谢产气提高原油采收率，同时防控硫酸盐还原菌导致的油藏酸化。8.一种污水处理方法，其特征在于，包括如下步骤：在污水处理的过程中，加入权利要求1所述的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23菌悬液、菌剂或已挂膜于填料上的施氏假单胞菌pseudomonas stutzeri y23。
技术总结本发明公开了一株能够在较高氧浓度下进行完全反硝化脱氮的施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri Y23及其应用。本发明的完全反硝化产气施氏假单胞菌Y23已于2022年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24240。本发明的施氏假单胞菌Y23具有完全反硝化途径，可在有氧和无氧的条件下将硝酸盐转化为氮气，适用于含氮污水脱氮处理、油田微生物提高原油采收率以及防控硫酸盐还原菌引发的油藏酸化和管道腐蚀等领域。酸盐还原菌引发的油藏酸化和管道腐蚀等领域。酸盐还原菌引发的油藏酸化和管道腐蚀等领域。
技术研发人员：高配科 殷筱惠 王婧 高昭昭 朱美琪 贾传兴 陈峻峰 王仁君
受保护的技术使用者：曲阜师范大学
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/7/5
