环境耐受的嗜水气单胞菌噬菌体zpah34及应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及环境耐受的嗜水气单胞菌噬菌体zpah34及应用。
背景技术：2.嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)属于气单胞菌科，气单胞菌属，是一种革兰氏阴性短杆菌。它广泛存在于河流、池塘、污水、海水等水体环境以及土壤、水生动物中，能感染多种淡水鱼类导致细菌性败血症。据报道，在团头鲂养殖中嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病造成危害最为严重，发病率高、持续时间长、死亡率超过10％，同时还会引起套养鱼大量死亡，对养殖造成了巨大的经济损失。嗜水气单胞菌还具有宿主范围广的特点，能够感染鱼类、两栖类、爬行类及哺乳动物等多种动物。有研究报道，嗜水气单胞菌可寄生于人体肠道，严重时可引起人类及动物的败血症、坏死性筋膜炎以及急性肠胃炎等疾病。
3.噬菌体是一种能特异性感染细菌并裂解细菌的病毒。近年来，由于耐药菌株的大量出现，细菌耐药性已成为全球关注的问题。噬菌体治疗重新被科学界关注起来。随着对噬菌体的研究逐渐加深，发现噬菌体疗法较抗生素治疗细菌感染具有明显的优势，由于噬菌体具有很强的宿主特异性，它只能杀死一种或一类特定的病原菌，因此不会影响机体微生物群落，具有较高的安全性和有效性；噬菌体可以单独使用，可以制成噬菌体混合的“鸡尾酒”疗法，也可以和抗生素或者其他杀菌药物进行联合使用；同时噬菌体易从环境中获得、不会造成环境污染。从而为噬菌体在不同领域的应用提供更多的可能。
技术实现要素：4.本发明从自然环境中筛选得到了嗜水气单胞菌噬菌体zpah34。该噬菌体能够特异性裂解嗜水气单胞菌，环境耐受性强，具有较强的杀菌活性，其保藏编号为cctcc no：m 2022141。
5.本发明的另一个目的在于提供噬菌体zpah34的应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.申请人自湖北省武汉市洪山区南湖中筛选出一株噬菌体，该噬菌体已于2022年2月21 日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌噬菌体(aeromonashydrophila phage)zpah34，保藏编号为cctcc no：m 2022141，地址：中国武汉武汉大学。
8.本发明所述嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophilaphage zpah34)为裂解性噬菌体，通过透射电子显微镜观察显示：具有短的尾部以及直径为50
±
3nm的二十面体结构的头部，头部和尾部之间被颈部所分开。噬菌体菌株在双层平板上形成清晰透明的空斑，周围有晕环，边缘规则，直径约为1mm。该噬菌体具备seq id no.1所示的特异性序列。
9.本发明的保护内容还包括，噬菌体zpah34的应用，包括噬菌体zpah34用于食品保鲜剂，或用于制备治疗或预防嗜水气单胞菌感染的药物。
10.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
11.1嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophilaphage zpah34)在moi＝0.001的条件下培养4h时，该噬菌体效价达到最大值为4
×
108pfu/ml，最佳感染复数为0.001。
12.2.具有较好的酸碱耐受性，嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophilaphagezpah34)ph为4-11这个区间里噬菌体效价稳定，保持在108pfu/ml以上。噬菌体zpah34 的具有较好的酸碱耐受性。
13.3.具有一定的温度耐受性，嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophila phagezpah34)温度在30℃-50℃之间效价稳定在107pfu/ml以上。
14.4.吸附速度快，嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophila phage zpah34) 5min内最高吸附速率达到81.75％，在15min内有94.45％的噬菌体吸附至宿主菌上。
15.5.潜伏期短，易于扩繁。嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophilaphagezpah34)一步生长曲线所示，该噬菌体潜伏期短，为20min，平台期滴度高可达109pfu/ml 以上。
16.6.可直接用作食品保鲜，嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophilaphagezpah34)在生菜和鱼肉等食品储存方面，能有效抑制嗜水气单胞菌引起的食物变质，可采用浸泡或喷洒的方式适当延长食品保鲜时间。
17.7.可用于制备治疗疾病药物，嗜水气单胞菌噬菌体zpah34(aeromonashydrophila phagezpah34)能有效预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病，提高斑马鱼的存活率。
附图说明
18.图1为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34噬菌斑形态图。
19.图2为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34透射电镜观察下的结构示意图。
20.图3为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34ph耐受性图。
21.图4为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34温度耐受性图。
22.图5为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34吸附速率图。
23.图6为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34一步生长曲线图。
24.图7为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34对宿主生物被膜清除图；
25.a为96孔板上对宿主生物被膜清除图；b为12孔板上对宿主生物被膜清除图。
26.图8所示为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34在生菜上杀菌效果图；
27.a为4℃下噬菌体zpah34在生菜上杀菌效果图；b为25℃下噬菌体zpah34在生菜上杀菌效果图。
28.图9所示为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34在鱼肉上杀菌效果图；
29.a为4℃下噬菌体zpah34在鱼肉上杀菌效果图；b为25℃下噬菌体zpah34在鱼肉上杀菌效果图。
30.图10所示为嗜水气单胞菌噬菌体zpah34对斑马鱼的预防与治疗保护试验图；
31.a为预防试验中斑马鱼的存活率图；b为治疗试验中斑马鱼的存活率图。
具体实施方式
32.本领域技术人员可以借鉴本技术的研究内容。需注意的是，对本发明的任何细微改变和替换都将包括在本发明的保护范围内。本发明中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件进行；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。本发明所用的嗜水气单胞菌zyah75已在genbank accession no nz_cp016990中公开。
33.实施例1：
34.噬菌体的分离、纯化和效价测定
35.本发明中嗜水气单胞菌噬菌体zpah34的来源水样采集于湖北省武汉市洪山区南湖，将水样用滤纸过滤，4℃下8000r/min离心10min，用注射器小心吸取上清液并用0.22 μm的滤膜过滤，除去宿主菌和其他杂质，得到的噬菌体原液置于4℃保存。
36.(1)噬菌体分离纯化：准备la固体培养基的平板，将噬菌体原液进行10倍梯度的稀释，最终稀释到10-6
。采用双层平板法取100μl稀释后的噬菌体液与100μl宿主菌菌液于 5ml离心管中，再加入3.8ml 0.7％lb半固体培养基迅速上下翻倒混匀，倾倒在固体平板上，在28℃下培养12h。得到双层平板上清晰透明的噬菌斑，挑取单个菌斑加入10ml lb 液体培养基中，同时加入100μl嗜水气单胞菌菌液，在28℃摇床培养12h，培养后的混合液于10000r/min/min离心10min，吸取上清液并用0.22μm的滤膜过滤，得到纯化的噬菌体，重复四次上述步骤得到大小均匀的噬菌斑。结果如图1所示，噬菌体zpah34在双层平板上形成清晰透明的空斑，周围有晕环，边缘规则，直径约为1mm。
37.(2)采用双层平板法测定其效价。噬菌体效价(pfu/ml)指的是每毫升液体中噬菌体的数量。通过对噬菌体原液进行10倍梯度稀释，将稀释液采用双层平板法在28℃下培养 12h，对平板上的噬菌斑进行计数。浓度计算公式为：噬菌体的效价＝双层琼脂平板上噬菌斑的个数
×
稀释倍数
×
10。
38.所述的噬菌体已于2022年2月21日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌噬菌体(aeromonas hydrophila phage)zpah34，保藏编号为cctcc no：m 2022141，地址：中国武汉武汉大学。
39.实施例2：
40.噬菌体zpah34的电镜观察
41.首先对噬菌体进行扩大培养，准备250ml的锥形瓶，加入100ml lb液体培养基与 200μl宿主菌液，在28℃摇床培养3h，将双层平板上含有噬菌斑的上层琼脂用无菌接种环挑取于锥形瓶中，在28℃摇床再培养4h。培养结束后于10000r/min离心10min，吸取上清液并用0.22μm的滤膜过滤。将过滤液在真空环境下30000r/min超速离心2h，弃上清，加入500μl醋酸铵溶液，反复轻柔吹打离心柱，将溶液转移到1.5ml离心管中，得到效价≥10
10 pfu/ml的噬菌体富集液。准备铜网，用无菌水清洗几遍，然后将铜网浸入富集后的噬菌体原液中，吸附5min，用滤纸吸去多余的液体，滴加2％的磷钨酸在铜网上，染色1分钟，待其干燥后，在100kv透射电镜下观察。利用图像处理软件digital micrograph demo 3.9.1进行长度测量。结果如图2所示嗜水气单胞菌噬菌体zpah34具有短的尾部以及直径为50
±
3 nm的正多面体结构的头部，头部和尾部之间被颈部所分开。
42.实施例3：噬菌体zpah34最佳感染复数测定
43.将宿主菌嗜水气单胞菌zyah75(nz_cp016990)过夜培养，调整od
600
在0.8左右，使
菌液浓度为108cfu/ml，将菌液按十倍倍比稀释到105cfu/ml。按照感染复数分别为 1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001加入100μl不同稀释度的噬菌体液(10
8-102pfu/ml) 和100μl宿主菌菌液于800μl的lb培养基中。涡旋混匀，将混合液置于28℃下震荡培养 4h。培养完毕后，4℃、8000r/min离心10min，取上清液，按十倍倍比稀释不同的浓度梯度，采用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价。噬菌体效价最高时的比值，则为噬菌体最佳感染复数。结果如表1所示，显示当moi＝0.001时，噬菌体zpah34的效价为最大值4
×
10
8 pfu/ml，所以噬菌体zpah34的最佳感染复数为0.001。
44.表1噬菌体zpah34的最佳感染复数测定
[0045][0046]
实施例4：噬菌体zpah34ph耐受性测定
[0047]
调节lb液体培养基的ph值至2-13。将100μl噬菌体原液加入到900μl不同ph值的lb液体培养基中(初始噬菌体浓度是108pfu/ml)，于28℃恒温培养1h，然后采用双层琼脂培养法测定各ph值培养下噬菌体的效价，实验重复三次。
[0048]
结果如图3所示在ph为2、3、12和13时噬菌体zpah34的效价均下降至0pfu/ml，酸性条件下在ph为4至6这个区间里噬菌体效价稳定，保持在108pfu/ml以上，在碱性条件下ph为7至11时，噬菌体效价能达到109pfu/ml。
[0049]
文章中噬菌体ahyvdh1的效价在ph为5-10较稳定，当ph＝4、11时存活率下降到 10％
[1]
。以上结果表明，本发明噬菌体zpah34的酸碱耐受性范围广且效价高。
[0050]
实施例5：噬菌体zpah34温度耐受性测定
[0051]
将实验分成6组，每组加入500μl噬菌体原液于无菌离心管中(初始噬菌体浓度是 108pfu/ml)，再将装有噬菌体的离心管分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下培养，在30min和60min两个时间点取样，采用双层琼脂培养法测定各温度培养下噬菌体的效价，实验重复三次。
[0052]
结果如图4所示，温度在30℃至50℃之间效价稳定。在60℃和70℃时效价分别降低 103pfu/ml左右。噬菌体zpah34在温度为30-50℃时能保持良好的活性。已发表的文章中噬菌体cc2在40℃处理后存活率下降至30％
[2]
，在公开的专利中噬菌体pzy-ah在70℃处理后效价将为0pfu/ml
[3]
，因此本发明噬菌体zpah34具有较好的温度耐受性。
[0053]
实施例6：噬菌体zpah34吸附速率测定
[0054]
根据最佳感染复数对应的比例(moi＝0.001)，加入5ml宿主菌嗜水气单胞菌
zyah75 (nz_cp016990)菌液和5ml噬菌体液于50ml离心管中，将混合液放置于28℃摇床中震荡培养。从0min开始，每隔5min测定游离噬菌体的浓度，每个时间点吸取300μl液体， 8000r/min离心30s，吸取上清液进行梯度稀释。根据噬菌体的特性每个时间点选择不同且适宜的稀释梯度，用双层平板法测定上清液中游离噬菌体的效价。
[0055]
结果如图5所示，噬菌体zpah34在5min内最高吸附速率达到81.75％，在15min内有94.45％的噬菌体吸附至宿主菌上。根据申请人前期发表的一株具有高吸附速率噬菌体 zpah7相比，在5min时zpah7的吸附速率为79％
[4]
，本发明噬菌体zpah34在5min内可达吸附速率比zpah7更高，且与本发明有显著性差异，噬菌体zpah34在短时间内可大量入侵宿主菌。
[0056]
实施例7：噬菌体zpah34 ph一步生长曲线测定
[0057]
根据最佳感染复数对应的比例(moi＝0.001)，加入500μl噬菌体和500μl嗜水气单胞菌zyah75(nz_cp016990)菌液，在28℃下培养15min。将混合液8000r/min离心5 min，弃上清除去游离的噬菌体，加入1ml lb液体培养基重悬沉淀，此步骤重复两次，再加入9ml lb液体培养基。将混合液置于28℃下震荡培养。从0min开始，每隔5min取样，20min后每隔10min取样，每个时间点吸取600μl混合液，8000r/min离心30s，采用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。实验重复三次。
[0058]
结果如图6所示，噬菌体zpah34的一步生长曲线如图所示，其隐蔽期为10min，潜伏期为20min，生长期为90min。
[0059]
实施例8：噬菌体基因组提取及测序
[0060]
(1)取1ml噬菌体液，加入3μl dnaseⅰ和rnasea，28℃过夜培养，然后80℃灭活15 min。
[0061]
(2)向体系中分别加入24μl 0.5m edta溶液，1.5μl 20mg/ml的蛋白酶k，30μl 10％ sds溶液，置于56℃下温育1h。
[0062]
(3)加入等体积的tris平衡酚溶液，温和震荡1min，12000r/min离心10min，将上层水相转移至新的ep管中。
[0063]
(4)加入等体积的dna提取液(苯酚-氯仿-异戊醇25:24:1)，温和震荡1min，12000r/min 离心10min，将上层水相转移至新的ep管中。
[0064]
(5)加入等体积的氯仿，充分混匀后，10000r/min离心5min，转移上层水相至新的ep管中。(重复该步骤2次)
[0065]
(6)加入400μl异丙醇，-20℃下放置1h以上。4℃下13000r/min离心20min，缓慢倒掉上清。
[0066]
(7)加入1ml 75％的乙醇(在-20℃下预冷)，静置，12000r/min离心10min，弃上清，室温放置，完全挥发乙醇。
[0067]
(8)加入30μlte缓冲液溶解沉淀，得到的噬菌体dna置于-20℃下保存。
[0068]
在illumina公司进行全基因组测序工作，采用miseq测序仪对噬菌体进行高通量测序。测序结果表明，噬菌体zpah34基因组全长234,546bp，总共有234个开放阅读框(orf)， 2个trna，其中有111个orf预测出功能，占所有orf的47％，132个orf预测到的是假想蛋白，占所有orf的53％。经测定噬菌体zpah34不含毒力基因，在实际应用中不会对动物或人体造成潜在的健康风险。根据international committee on taxonomy of viruses (ictv)中
病毒的分类，在ncbi数据库中下载肌尾噬菌体科中所有属的代表噬菌体、肌尾噬菌体科中所有气单胞菌噬菌体以及统计的与噬菌体zpah34具有同源性的噬菌体的主要衣壳蛋白氨基酸序列。使用mega软件对所有氨基酸序列进行多重序列比对，选择邻域连接构建系统发育进化树，最终使用raxml(v 8.2.4)软件绘制系统发育树。结果表明噬菌体zpah34属于肌尾噬菌体科一个新噬菌体属，并可将其命名为zpah34。该噬菌体具备 seq id no.1所示的特异性序列。
[0069]
实施例9：噬菌体对宿主生物被膜清除图
[0070]
采用12孔板、96孔板两种模式培养宿主生物被膜，利用结晶紫染色和活菌计数两种方法测定噬菌体对生物被膜的清除效果。
[0071]
96孔板：每孔加入180μl lb培养基、20μl对数生长期的嗜水气单胞菌zyah75菌液，置于28℃恒温培养箱中，培养48h、72h，设置两个时间组。对照组加入20μl pbs代替噬菌体。每组三个重复。利用结晶紫染色测定噬菌体对生物被膜的清除情况，具体方法为：每孔用200μl无菌pbs洗涤3次，去除浮游细菌和培养基。每孔加入200μl甲醇固定30min，吸出甲醇放入28℃烘箱干燥。每孔加入1％的结晶紫200ul染色20min，然后吸出染液，用pbs轻轻洗涤三次。将96孔板置于烘箱干燥。每孔加入200μl 33％冰醋酸，将其置于30℃的恒温培养摇床上孵育30min，以充分释放生物被膜中的结晶紫。用酶标仪测定od
600
值。
[0072]
12孔板：将爬片放入12孔板底部，加入2.7mllb培养基、300ul对数生长期嗜水气单胞菌。在28℃培养48h、72h。利用活菌计数法测定噬菌体对生物被膜的清除情况。每个孔中加入3ml pbs清洗三遍，将爬片转移到干净的12孔板中，加入2ml pbs在爬片中的各个位置充分吹打10次，然后进行十倍梯度稀释，分别取100μl涂布于lb固体平板上，置于28℃恒温培养箱中过夜培养，进行计数，实验重复三次。
[0073]
结果如图7所示，在12孔板爬片上形成的生物被膜，噬菌体zpah34在环境中48h内对宿主菌嗜水气单胞菌清除率为54％，使生物被膜的菌量下降1.4log。
[0074]
实施例10：噬菌体在生菜上的杀菌活性
[0075]
将生菜叶片切成1厘米
×
1厘米的小片。用75％的乙醇浸泡1min杀菌消毒，然后将叶片用无菌水冲洗。然后室温下在流通风橱中转移到无菌培养皿中，风干。最后经紫外照射1h。将生菜片浸泡到浓度为106cfu/ml的嗜水气单胞菌菌液中10min。并在室温下等待叶片风干，使细菌附着在叶片上。将用细菌处理过的生菜分别浸泡在滴度为107pfu/ml(moi＝10) 和108pfu/ml(moi＝100)噬菌体zpah34中，浸泡10min。转移到干净的培养皿中风干30min。在4℃和25℃培养箱中培养。加入噬菌体后在时间点0、1、3、6、9和12小时检测生菜样品上的菌量。对照组使用相同体积的pbs溶液代替噬菌体液。每组三个平行。菌量检测：将生菜样品转移到加入1ml pbs缓冲液的5ml ep管中，用灭菌研磨棒进行研磨再涡旋混匀， 3000
×
g离心10min，弃上清收集沉淀的细菌，这一步是防止样品上的噬菌体对细菌的影响，将细菌沉淀用1ml的pbs再次重悬，得到的菌悬液经过连续稀释涂板，计数菌量。结果如图8所示，嗜水气单胞菌噬菌体zpah34在4℃温度条件下，当moi＝100，经过12h处理，嗜水气单胞菌菌量降低3.4log10，在不同的moi浓度条件处理下噬菌体zpah34对宿主菌嗜水气单胞菌均有良好的抑制能力，可延长食品的保鲜效果。
[0076]
实施例11：噬菌体在鱼肉上的杀菌活性
[0077]
将鱼肉切成2cm
×
1cm
×
0.5cm的薄片，在室温下用75％的乙醇浸泡5min进行杀菌
消毒，再用无菌水冲洗10次，风干30min去除水分。在培养皿中加入10ml浓度为106cfu/ml的嗜水气单胞菌菌液，将鱼肉浸泡到培养皿中5min。并在室温下等待风干。将每个鱼片样品浸泡在滴度为107pfu/ml(moi＝10)和108pfu/ml(moi＝100)噬菌体zpah34中，浸泡10min。风干30min。分别放置于4℃和25℃培养箱中培养。加入噬菌体后在时间点0、1、3、6、9 和12小时检测鱼片样品上的菌量。对照组使用相同体积的pbs溶液代替噬菌体液。每组三个平行。菌量检测：将生菜样品转移到加入1ml pbs缓冲液的5ml ep管中，用灭菌研磨棒进行研磨再涡旋混匀，3000
×
g离心10min，弃上清收集沉淀的细菌，将细菌沉淀用1ml的 pbs再次重悬，得到的菌悬液经过连续稀释涂板，计数菌量。结果如图9所示，嗜水气单胞菌噬菌体zpah34在moi＝100时，4℃温度条件处理12h下，菌量下降3.3log10；25℃温度条件处理3h下，菌量下降2.3log10。不同的moi浓度条件处理，噬菌体zpah34对宿主菌嗜水气单胞菌在短时间内均有一定的杀菌效果，可适用于肉制品生产链上加强食物新鲜感。
[0078]
实施例11：噬菌体对斑马鱼感染嗜水气单胞菌的预防和治疗作用
[0079]
嗜水气单胞菌感染斑马鱼模型采用刮伤浸泡感染方法。该方法可以更真实地模拟水产养殖中出现的一些鱼类体表刮伤并被细菌感染的情况。试验鱼(斑马鱼)共90尾，将其随机分为三组：预防组、治疗组与对照组。治疗组和预防组选择4个moi的噬菌体浓度。每组十尾。首先将斑马鱼的背鳍用手术刀刮取少许鳞片形成一个微小伤口，预防组先用噬菌体侵泡处理刮伤的斑马鱼，再进行攻毒处理。治疗组为先用嗜水气单胞菌浸泡感染刮伤的斑马鱼，再用噬菌体进行治疗处理。具体方案如下：
[0080]
(1)对照组：创伤斑马鱼后，用10ld50嗜水气单胞菌ah75(nz_cp016990)进行浸泡斑马鱼20min，再用pbs浸泡斑马鱼20min。
[0081]
(2)治疗组：创伤斑马鱼后，用10ld
50
嗜水气单胞菌ah75进行浸泡斑马鱼20min，一个小时后再用噬菌体浸泡斑马鱼20min。
[0082]
(3)预防组：创伤斑马鱼后，用噬菌体浸泡斑马鱼20min，一个小时后再用10ld
50
嗜水气单胞菌ah75浸泡斑马鱼20min，再转移到干净的水中。
[0083]
每天观察记录斑马鱼的死亡情况，将所有组的数据绘制成图，结果如图10所示，噬菌体预防试验中，moi＝1时存活率能达到100％。用噬菌体预防和治疗的情况下，均能提高对斑马鱼的保护率。
[0084]
表2噬菌体zpah34对斑马鱼感染嗜水气单胞菌zyah75的预防作用
[0085][0086][0087]
表3噬菌体zpah34对斑马鱼感染嗜水气单胞菌zyah75的治疗作用
[0088][0089]
存活率(％)＝存活斑马鱼数量/原始斑马鱼数量
×
100。
[0090]
参考文献：
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