1.本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡。
背景技术：2.衰老过程发生在人体的每个组织，其中皮肤老化是最明显的年龄指标。随着年龄的增长，皮肤内稳态被破坏，代谢活动减慢，内源性活性氧(ros)的产生和积累导致氧化性细胞应激和炎症介质的分泌增加，使得皮肤更具反应性和敏感性；在人体衰老过程中，细胞的还原能力越来越差，体内积累的自由基越来越多，而黑色素是清除自由基的有效大分子，细胞往往为了减少自由基对自身的危害而大量合成黑色素，表现在皮肤上即为色素沉积；除此之外自由基的积累也会导致细胞内的蛋白质被氧化，产生富含色素的脂褐质，形成老年斑。故有效的清除皮肤自由基是减缓皮肤衰老，减少色素沉积，减少老年斑生成的关键。
技术实现要素：3.本发明提供一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，以具有自由基靶向的交联透明质酸为骨架形成囊泡，同时囊泡内含抗氧化活性小分子化合物或生物活性肽类物质。为了进一步降低透明质酸酶、β-d-葡糖苷酸酶和β-n-乙酰-d-氨基己糖苷酶对交联透明质酸骨架的降解作用，该囊泡在表面活性剂存在的条件下通过制备同心外壳，形成多层囊泡，从而延缓交联透明酸骨架的降解，使得该多层囊泡具有皮肤吸收好、体内存留时间长，靶向皮肤组织内自由基，使得可较长时间抗击皮肤内自由基，且具有保湿作用，从而更好的延缓皮肤老化，减少黑色素沉积。
4.为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡；所述囊泡采用的交联剂为包含双硫键或巯基或双硫戊环结构任一或多个结构的单一化学交联剂或混合交联剂，以及包含两种或两种以上的双功能或多功能缩水甘油醚官能团的单一化学交联剂或混合交联剂，并可含有单一的苯硼酸类、草酸酯类、酪氨酸等氨基酸类及聚乙二醇类物质或以上物质混合物。
5.优选的，所述交联透明质酸囊泡通过交联剂及所述试剂交联；所述交联剂及试剂对所述透明质酸的改性程度小于0.1-20摩尔％。
6.优选的交联剂包含双硫键(如：胱胺、二硫代二丙酸)或巯基或双硫戊环结构(如：二硫戊环三亚甲基碳酸酯、硫辛酸)任一或多个结构的单一化学交联剂或混合交联剂；
7.优选的交联剂可包含两种或两种以上的双功能或多功能缩水甘油醚官能团的单一化学交联剂或混合交联剂；
8.优选的试剂可含有单一的苯硼酸类、草酸酯类、酪氨酸等氨基酸类，聚乙二醇类物质或以上物质混合物。
9.优选的，一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡的合成方法，包括如下步骤：
10.步骤一、将含有上述交联剂及试剂的溶液相，以可控的搅拌和控温方式加入非交联的透明质酸成为混合相，从而形成交联透明酸并自组装形成自由基靶向的交联透明质酸囊泡；
11.优选的，一种富含抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的囊泡制备方法，采用透析法进行装载，包括如下步骤：
12.步骤一、在可控的搅拌和控温条件下，将含有自由基靶向囊泡的溶液与抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的溶液混合均匀；
13.步骤二、将步骤一所得产物逐滴加入到pbs缓冲液中，滴加过程中以100-10000rmp的转速搅拌；
14.步骤三、将含有载药囊泡溶液转移到截留分子量为100-30000的透析袋中用pbs透析10小时；每1小时换一次透析介质得到初始载药囊泡；交联剂及试剂残留在标准范围；
15.步骤四、在通氮气的环境下，将含有初始载药囊泡的混合溶液再次转移到透析袋中用pbs透析1-5小时即可得到终载药囊泡。
16.优选的，一种多层自由基靶向囊泡制备方法，包括如下步骤：
17.准备包含至少一种蔗糖脂肪酸酯型表面活性剂(所述表面活性剂包含至少一条由直链或支链，饱和或不饱和，单羟基或多羟基含有c
6-c
22
的脂肪酸)或卵磷脂类表面活性剂；通过以上所述的表面活性剂(单一或混合物)在富含抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的自由基靶向囊泡外层再次形成新的同心外壳，该外壳具有延缓囊泡降解的作用，从而制备得到多层自由基靶向囊泡。
18.其制备方法为：准备含有所述表面活性剂的表面活性剂相；准备富含抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的自由基靶向囊泡的水相，将含有囊泡的水相，以可控的搅拌和控温方式加入到以上表面活性剂中，从而形成多层自由基靶向囊泡。
19.本发明有益效果为：本发明公开的多层自由基靶向囊泡用途为皮肤护理及抗衰老作用，减少皮肤的黑色素沉积。该囊泡具有以下特点：1、囊泡具有靶向载体作用，对皮肤组织中自由基具有靶向性；2、囊泡内含有抗氧化作用的小分子化合物及生物活性肽类可抗击皮肤自由基，延缓皮肤老化，减少黑色素沉积。3、交联透明质酸形成的囊泡具备缓释性，使其体内存留时间长，可增加抗击自由基的时长；4、透明质酸具有保湿作用，且交联透明质酸可有效的减少或防止皱纹、小皱纹、细纹的特征皮肤线条；并且能有效的改善皮肤的微起伏，抚平肌肤，达到使皮肤丰满的效果；5、通过表面活性剂再次形成同心多层囊泡，延缓降解时间，提高抗降解能力。
20.以本发明囊泡作为主成分后形成的组合物，在生理上可接受的介质包括：理想的成分和香味所需的赋形剂，或对皮肤调理具有显著有益的物质。以下非限制性披露了拟使用的部分典型成分：
21.研磨剂、吸收剂、防结块剂、去屑剂、消泡剂、抗菌剂、抗氧化剂、抗静电剂、收敛剂、粘合剂、漂白剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、清洁剂、化妆品着色剂、变性剂、除臭剂、润肤剂、乳化剂、乳化剂、乳液稳定剂、成膜剂、调味剂、泡沫增强剂、凝胶成型剂，头发调理剂，头发固定剂，保湿剂，掩蔽剂，保湿剂、指甲调理剂、乳浊剂、口腔护理剂、香水助剂、增塑剂、防腐剂、重塑剂、清爽剂、皮肤调理剂、护肤剂、平滑剂、溶剂、表面活性剂、滋补剂、紫外线吸收剂、紫外线过滤器和粘度控制剂。
22.另外，本发明囊泡可与皮肤护理常用的保湿，祛斑的添加剂合用，可通常用于皮肤局部使用的任何一种制剂形式制备，因此需要包括液体、糊状或固体制剂、水性、酒精性或油性软膏或乳膏的形式、粉末、液体或半液体稠度的乳液牛奶类型、微乳液、悬浮液、软、半液体或固体的凝胶、湿巾、喷雾、泡沫、棒、洗发水、压缩剂、洗涤液。
具体实施方式
23.下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.一种用于延缓皮肤老化的自由基靶向透明质酸囊泡；所述囊泡采用的化学交联剂为包含双硫键或巯基或双硫戊环结构任一或多个结构的化学交联剂，以及包含两种或两种以上的双功能或多功能缩水甘油醚官能团的交联剂，及可含有苯硼酸类、草酸酯类、酪氨酸等氨基酸类，聚乙二醇类物质。交联的所述透明质酸通过交联剂及所述试剂交联；所述交联剂及试剂对所述透明质酸的改性程度小于0.1-20摩尔％。
25.本发明提供以非交联透明质酸通过交联剂形成具有自由基靶向的囊泡，同时囊泡内包含具有抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽；且该囊泡可通过包含至少一种蔗糖脂肪酸酯型表面活性剂或卵磷脂类表面活性剂的条件下在自由基靶向囊泡外层再次形成同心外壳，从而制备成多层自由基靶向囊泡。
26.该囊泡具有以下特点：1、囊泡具有靶向载体作用，对皮肤组织中自由基具有靶向性；2、囊泡内含有抗氧化作用的小分子化合物及生物活性肽类可抗击皮肤自由基，延缓皮肤老化，减少黑色素沉积。3、交联透明质酸形成的囊泡具备缓释性，使其体内存留时间长，可增加抗击自由基的时长；4、透明质酸具有保湿作用，且交联透明质酸可有效的减少或防止皱纹、小皱纹、细纹的特征皮肤线条；并且能有效的改善皮肤的微起伏，抚平肌肤，达到使皮肤丰满的效果；5、通过表面活性剂再次形成同心多层囊泡，起到延长降解时间，提高抗降解能力。
27.所述囊泡采用的交联剂为包含双硫键或巯基或双硫戊环结构任一或多个结构的单一化学交联剂或混合交联剂，以及包含两种或两种以上的双功能或多功能缩水甘油醚官能团的单一化学交联剂或混合交联剂，及可含有苯硼酸类、草酸酯类、酪氨酸等氨基酸类及聚乙二醇类物质或以上物质的混合物。
28.作为又一优选实施方案，一种富含抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的囊泡制备方法，采用透析法进行装载包括如下步骤：
29.步骤一、在可控的搅拌及控温下，将含有透明质酸靶向囊泡的溶液与抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的溶液混合均匀；
30.步骤二、将步骤一所得产物逐滴加入到pbs缓冲液中，滴加过程中以100-10000rmp的转速搅拌；
31.步骤三、将含有载药囊泡溶液转移到截留分子量为100-30000的透析袋中用pbs透析10小时；每1小时换一次透析介质得到初始载药囊泡；交联剂及试剂残留在标准范围；
32.步骤四、在通氮气的环境下，接着将含有步骤三载药囊泡的混合溶液再次转移到透析袋中用pbs透析1-5小时即可得到终载药囊泡。
33.作为又一优选实施方案，一种多层自由基靶向囊泡制备方法，包括如下步骤：
34.该囊泡还可通过在包含至少一种蔗糖脂肪酸酯型表面活性剂(所述表面活性剂包含至少一条由直链或支链，饱和或不饱和，单羟基或多羟基含有c
6-c
22
的脂肪酸)或卵磷脂类表明活性剂；通过以上表面活性剂在富含抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的自由基靶向囊泡外层形成新的同心外壳，该外壳具有延缓囊泡降解的作用，从而制备得到多层自由基靶向囊泡。其制备方法为：准备含有所述表面活性剂的表面活性剂相；准备含有抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的自由基靶向囊泡的水相，将囊泡的水相，以可控的搅拌和控温方式加入到以上表面活性剂中，从而形成多层自由基靶向囊泡。
35.上述设置中，以交联透明质酸制备具有自由基靶向作用的特定囊泡，该囊泡以交联透明质酸自由基靶向载体作为壳，同时囊泡内含抗氧化作用小分子化合物及生物活性肽，且通过表面活性剂可在该囊泡外再次形成新的同心外壳，从而形成多层自由基靶向囊泡，该多层自由基靶向囊泡既具备吸收好，体内存留时间长，又具备自由基靶向性和抗氧化性，起到抗击自由基，延缓皮肤老化，减少黑色素沉积以及保湿作用。在皮肤护理及抗衰老治疗中，其还能有效的减少或防止皱纹、小皱纹、细纹的特征皮肤线条；并且能有效的改善皮肤的微起伏，抚平肌肤，达到使皮肤丰满的效果；还能提高皮肤的密度，使皮肤具有弹性。
36.作为优选实施方案，一种用于延缓皮肤老化的自由基靶向透明质酸囊泡的合成方法，包括如下步骤：
37.步骤一、由所述交联剂制备为交联剂相，以可控的搅拌和控温方式加入含有非交联的透明质酸相，从而形成交联透明质酸并自组装为具有自由基靶向透明质酸囊泡，通过加入抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽制备成自由基靶向透明质酸含药囊泡；
38.步骤二、将自由基靶向透明质酸含药囊泡；制备为水相，以可控的搅拌和控温方式加入含有单一或混合的表面活性剂中，从而形成多层自由基靶向囊泡；
39.步骤三、该自由基靶向囊泡可与人体生理上可接受的赋形剂或添加物组成达到所需外观和气味的组合物，以下为可使用的典型可选成分：
40.研磨剂、吸收剂、防结块剂、去屑剂、消泡剂、抗菌剂、抗氧化剂、抗静电剂、收敛剂、粘合剂、漂白剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、清洁剂、化妆品着色剂、变性剂、除臭剂、润肤剂、乳化剂、乳化剂、乳液稳定剂、成膜剂、调味剂、泡沫增强剂、凝胶成型剂，保湿剂，掩蔽剂，保湿剂、乳浊剂、香水助剂、增塑剂、防腐剂、重塑剂、清爽剂、皮肤调理剂、护肤剂、平滑剂、溶剂、表面活性剂、滋补剂、紫外线吸收剂、紫外线过滤器和粘度控制剂。
41.本实验例的目的是考察根据本发明的方法制备得到的延缓皮肤老化的多层自由基靶向透明质酸囊泡是否具有降解慢，保湿，抗氧化效果。
42.实验例一、
43.1、体外抗酶解试验
44.方法一、囊泡体外抗酶解性测定。样品处理：称取0.5g的囊泡各3份加入853u/ml的透明质酸酶2ml在37℃下反应65h。取出酶解液1ml加入4ml的无水乙醇10000r/min离心15min，取上清液作为甲液。称取1.0g的囊泡各3份加入5ml 0.5mol/l的稀硫酸，沸水浴水解20min。然后将水解液倒入50ml容量瓶定容作为乙液。分别取甲、乙液各1.0m l，用改良咔唑显色法测定糖醛酸含量。囊泡的体外抗酶降解性用耐酶系数(r)表示。计算公式如下：r＝1-0.3(a/b)；a-甲液的糖醛酸含量(mg/m l)；b-乙液的糖醛酸含量(mg/m l)。
45.2.结果
46.考察单层囊泡与多层囊泡体外抗酶解作用，实验结果表明，交联后透明质酸囊泡较非交联透明质酸抗酶解作用显著提高，而多层囊泡较单层囊泡抗酶解作用进一步提高，且具有统计学差异(p《0.05)。
47.表1囊泡的抗酶解性
[0048][0049]
与非交联透明质酸比较，*p《0.05，与单层囊泡比较，**p《0.05
[0050]
方法二
[0051]
准确称取囊泡，置于离心管中，1000rpm离心，使囊泡平整聚集至管底，在囊泡表面缓缓加入1000单位/ml透明质酸酶磷酸盐缓冲溶液0.1ml，37℃保温酶解2h。加入0.8mol/l四硼酸钾，涡旋混合，沸水浴3min，冷却至室温。加入ehrlich’s试剂，混匀，37℃保温,1000rpm离心，取上清液于585nm处测定吸光度。通过计算在透明酸酶的作用下释放出乙酰氨基葡萄糖量，表示酶对囊泡的降解能力。
[0052]
2.结果
[0053]
考察单层囊泡与多层囊泡体外抗酶解作用，实验结果表明，单层囊泡在透明酸酶的作用下释放出乙酰氨基葡萄糖质量高于多层囊泡，且两者具有统计学差异(p《0.05)。
[0054]
表2囊泡颗粒的抗酶解性
[0055][0056]
与单层囊泡比较，*p《0.05
[0057]
实验例二、
[0058]
考察体外囊泡对羟基自由基(dpph)的清除能力，并通过建立皮肤衰老动物模型，通过检测模型大鼠皮肤中超氧化物歧化酶(sod)，丙二醛(mda)考察囊泡对大鼠皮肤组织氧化应激反应状态的影响，考察囊泡抗氧化作用。
[0059]
1、方法
[0060]
d-半乳糖诱导的皮肤衰老模型及动物分组
[0061]
采用18g～22g昆明种小鼠60只，将小鼠随机分为5组，分别为正常对照组，模型组，囊泡低剂量干预组、囊泡中剂量干预组、囊泡高剂量干预组。正常对照组皮下注射生理盐水，其余各组小鼠每天1次皮下注射d-半乳糖(1g/kg)，连续8周，建立亚急性皮肤衰老小鼠
模型。在开始注射d-半乳糖四周后，囊泡干预组各组动物皮肤注射，每周1次，连续4周。
[0062]
超氧化物歧化酶(sod)，丙二醛(mda)、羟基自由基(dpph)清除能力的检测
[0063]
体外羟基自由基(dpph)清除能力的检测通过在96孔酶标板各孔中分别加入20μl供试样液和180μl 150μmol/ldpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶液(用体积分数80％乙醇配制)，空白对照加入180μl dpph溶液和20μl dmso，样液本底值的测定则加入180μl乙醇(体积分数80％)和20μl供试样液。
[0064]
体内皮肤组织匀浆经低温(4℃)3000r/min离心10～15min后，取上清液。采用南京建成生物工程研究所生产(批号:20210316)的t-sod测试试剂盒—羟胺法、mda测试试剂盒(tba法)
[0065]
2、结果
[0066]
表3结果表明，囊泡在不同时间段内对羟基自由基(dpph)具有显著的清除能力且随时间的延长，其作用更加显著。表4结果表明，与空白相比较，模型组大鼠皮肤组织中sod显著降低，mda明显增高(p《0.05)。与模型组比较，囊泡干预各组均可不同程度升高皮肤组织中sod含量，并降低mda的水平(p《0.05)。其中，中、高剂量组对sod和mda的作用显著。
[0067]
表3.囊泡干预对羟基自由基清除的影响
[0068][0069]
与30min比较，*p《0.05，与60min比较
**
p《0.05
[0070]
表4.使用囊泡干预前后对大鼠皮肤sod及mda含量的影响
[0071][0072]
与对照组比较，*p＜0.05，与模型组比较,**p＜0.05
[0073]
实验例三、
[0074]
1、对象招募
[0075]
本实验共招募到60名经鉴定为“干性皮肤”类型的女性健康受试者，年龄在25-45岁之间。在进行本实验之前，所述受试者被要求除进行日常的皮肤清洁之外，禁止使用任何其它声称具有补水、保湿功能的护肤品达10天的时间。
[0076]
2、实验方法
[0077]
采用双盲法，将所述60名受试者随机分为3组，每组20人。第1组为空白对照组，不施用任何化妆品。第2组为上市对照品组，第3组为实验组施用根据本发明自由基靶向囊泡组合物。
[0078]
评价方法及结果
[0079]
所述受试者通过采用市售的皮肤水分测定仪测量在实验开始前和实验结束后的皮肤水分含量变化
[0080]
表5.使用囊泡干预前后对皮肤含水量的影响
[0081][0082]
与使用前比较，*p《0.05
[0083]
以上结果验证了该囊泡对于受试者的皮肤具有较好的补水、保湿的功效。
[0084]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
技术特征：1.一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于：非交联透明质酸通过交联剂及试剂形成的具有自由基靶向的囊泡；所述囊泡内包含具有抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽。2.根据权利要求1所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于：所述非交联透明质酸通过所述交联剂及所述试剂交联；所述交联剂及试剂对所述非交联透明质酸的改性程度小于0.1-20摩尔％。3.根据权利要求1所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于：所述交联剂包含双硫键或巯基或双硫戊环结构任一或多个结构的单一化学交联剂，或包含两种或两种的双功能或多功能缩水甘油醚官能团的单一化学交联剂，或混合交联剂。4.根据权利要求1所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于：所述囊泡的制备过程含有单一的苯硼酸类、草酸酯类、酪氨酸等氨基酸类及聚乙二醇类物质或以上物质混合物。5.根据权利要求1所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于：非交联透明质酸通过所述交联剂在可控的温度及搅拌条件下组合为具有自由基靶向的交联透明质酸囊泡。6.根据权利要求3或4或5所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于：所述囊泡的合成方法包括交联剂及所述试剂的溶液相，通过搅拌和控温方式加入非交联透明质酸，形成交联透明质酸囊泡。7.根据权利要求1所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于：该囊泡含有抗氧化作用小分子化合物和生物活性肽；所述抗氧化作用小分子化合物为抗坏血酸及其衍生物、多酚类抗氧化物质或以上物质的混合物；所述生物活性肽为乙酰基多肽类生物活性肽物质。8.根据权利要求7所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，采用透析法进行装载其合成步骤如下：步骤一、在可控的搅拌和控温条件下，将含有自由基靶向囊泡的溶液与抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的溶液混合均匀；步骤二、将步骤一所得产物逐滴加入到pbs缓冲液中，滴加过程中以100-10000rmp的转速搅拌；步骤三、将含有载药囊泡溶液转移到截留分子量为100-30000的透析袋中用pbs透析10小时；每1小时换一次透析介质得到初始载药囊泡，交联剂及试剂残留在标准范围；步骤四、在通氮气的环境下，将含有步骤三初始囊泡的混合溶液再次转移到透析袋中用pbs透析1-5小时即可得到终载药囊泡。9.根据权利要求8所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于，所述囊泡通过在包含至少一种蔗糖脂肪酸酯型表面活性剂或卵磷脂类表面活性剂；通过所述的表面活性剂在富含抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的自由基靶向囊泡外层再次形成新的同心外壳，该外壳具有延缓囊泡降解的作用，从而制备得到多层自由基靶向囊泡。10.根据权利要求9所述的一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，其特征在于，多层自由基靶向囊泡的制备方法为：
准备含有所述表面活性剂的表面活性剂相；准备富含抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽的自由基靶向囊泡的水相，将含有囊泡的水相，以可控的搅拌和控温方式加入到以上表面活性剂相中，从而形成多层自由基靶向囊泡。
技术总结本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种用于延缓皮肤老化的多层自由基靶向囊泡，由非交联透明质酸通过交联剂形成的具有自由基靶向的囊泡；所述囊泡内包含具有抗氧化作用小分子化合物或生物活性肽。该多层自由基靶向囊泡既具备吸收好，体内存留时间长，又具备自由基靶向性和抗氧化性，起到抗击自由基，延缓皮肤老化，减少黑色素沉积以及保湿作用。减少黑色素沉积以及保湿作用。
技术研发人员：文一丁 石磊
受保护的技术使用者：成都丁因生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/5
